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1、第三章第三章 突变的应用突变的应用 第一节第一节诱变育种诱变育种第二节第二节营养缺陷型突变株的筛选与应用营养缺陷型突变株的筛选与应用第三节第三节抗反馈调节突变型的筛选及应用抗反馈调节突变型的筛选及应用第四节第四节其它类型突变株的筛选及应用其它类型突变株的筛选及应用第五节第五节菌种退化及其防止菌种退化及其防止第一节第一节诱变育种诱变育种一、概述二、诱变育种方案的设计三、诱变育种的一般步骤四、诱变育种中应注意的一些问题一、概述一、概述（一）诱变育种技术的产生与发展（一）诱变育种技术的产生与发展工业与工程需求：工业与工程需求：发酵工业尤其是抗生素工业生产菌株选育工作的需要；理论与技术基础：理论与技术
2、基础：Thom和Steinberg（1939）用X射线在真菌中首次诱发基因突变成功；问题探索与技术发展：问题探索与技术发展：Davis对各种诱变筛选程序的统计学比较；Calam对各种诱变剂量下的产量分步曲线的比较；Dahl等人对筛选工作可能误差的分析；各种自动化和高通量筛选技术出现（二）诱变育种技术在育种工作的作用（二）诱变育种技术在育种工作的作用提高目标产物的产量；提高目标产物的产量；改善菌种特性，提高产品质量，简化工艺条件；改善菌种特性，提高产品质量，简化工艺条件；开发新产品；开发新产品；给代谢调控育种提供技术手段给代谢调控育种提供技术手段（三）高产菌株诱变育种的特点（三）高产菌株诱变育种
3、的特点产量是一种数量性状，数量性状的特性和基因产量是一种数量性状，数量性状的特性和基因突变的特点决定了高产菌株的诱变选育一般具突变的特点决定了高产菌株的诱变选育一般具有以下一些特点有以下一些特点：盲目性大；盲目性大；筛选工作繁琐，工作量大；筛选工作繁琐，工作量大；工作效率低，周期长；工作效率低，周期长；难以集合多个优良性状难以集合多个优良性状二、诱变育种方案的设计二、诱变育种方案的设计制定明确的选育目标：制定明确的选育目标：一次诱变目标不可太高太多；建立可行的筛选方法：建立可行的筛选方法：关键问题是确立一种测定产物的方法；确定诱变筛选流程：确定诱变筛选流程：是诱变育种工作方案设计的中心内容。对
4、于既往诱变史较少的低产菌株，采用一次高效法有利于提高育种工作的进度；而对于已进行多次诱变处理的高产菌株，多步积累法优于一次高效法。三、诱变育种的一般步骤三、诱变育种的一般步骤出发菌株出发菌株纯化、活化、前培养（同步培养）纯化、活化、前培养（同步培养）培养液培养液离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）单细胞或单孢子悬液单细胞或单孢子悬液活菌计数，诱变预备试验活菌计数，诱变预备试验诱变处理诱变处理活细胞计数，致死率计算活细胞计数，致死率计算后培养（中间培养）后培养（中间培养）平板分离平板分离变异率计算变异率计算初筛初筛复筛复
5、筛保藏及扩大试验保藏及扩大试验（一）出发菌株的选择（一）出发菌株的选择尽尽量量选选择择既既往往诱诱变变史史少少的的高高产产菌菌株株：由由自自然然界界分分离离获获得得的的野野生生型型菌菌株株，突突变变可可能能性性较较大大;经经自自然然分分离离的的生生产产菌菌株株，对对生生产产环环境境适适应应，又又具具野野生生型型特特性性，也也是是良良好好的的出出发发菌菌株株;经经过过诱诱变变改改造造的的菌菌株株，负负突突变变可可能能性性较较大大，可可结结合合其其它它育育种种方方法法改变其遗传保守性改变其遗传保守性（一）出发菌株的选择（一）出发菌株的选择挑挑选选纯纯系系（遗遗传传纯纯）菌菌株株：避避免免使使用用丝
6、丝状状真真菌菌菌菌丝丝体体（异异核核体体）；要要尽尽量量选选择择单单倍倍体体单单核核细细胞胞（孢孢子子），以以减减少少诱诱变变菌的分离延迟（结合诱变剂选择）菌的分离延迟（结合诱变剂选择）选选择择对对诱诱变变剂剂敏敏感感的的菌菌株株：选选择择一一些些增增变突变株变突变株采用多出发菌株采用多出发菌株更换出发菌株更换出发菌株具具有有特特定定生生产产性性状状的的可可能能性性：要要确确有有特特定物的代谢途径定物的代谢途径（二）前培养（二）前培养前培养的目的：前培养的目的：p对对数数中中后后期期：生长旺盛，细胞浓度较高，对诱变剂敏感；p同步培养物：同步培养物：诱变剂处理时，群体中变化一致；p细细胞胞内内应
7、应具具有有丰丰富富的的内内源源性性碱碱基基：DNA被诱变剂作用后所造成的损伤能快速通过复制而形成突变，可以获得较高的突变率。前前培培养养的的培培养养基基：嘌嘌呤呤、嘧嘧啶啶碱碱基基含量要丰富（二）前培养（二）前培养丝状真菌的前培养丝状真菌的前培养p产产孢孢子子真真菌菌一般采用其孢子进行诱变，为提高其对诱变剂敏感性，可以将其同步培养至孢子刚萌发的高生理活性状态（芽管的长度相当于孢子直径的0.51倍）；p不不产产孢孢子子的的真真菌菌可以采用年幼的菌丝体进行诱变处理（对尖端菌丝、单菌落边缘菌丝或小段菌丝悬浮液进行诱变处理）（三）菌悬液的制备（三）菌悬液的制备 选选择择合合适适的的介介质质：物物理理诱
8、诱变变常常采采用用生生理理盐盐水水作作分分散介质，而化学诱变则需要用缓冲液作介质散介质，而化学诱变则需要用缓冲液作介质。使使细细胞胞或或孢孢子子要要处处于于良良好好的的分分散散状状态态：利利于于与与诱变剂解除；便于筛选诱变剂解除；便于筛选玻璃株打散，脱脂棉或擦镜纸（双层）过滤玻璃株打散，脱脂棉或擦镜纸（双层）过滤调节适当的细胞或孢子密度调节适当的细胞或孢子密度 酵母细胞、霉菌孢子：酵母细胞、霉菌孢子：106107个个/ml；细菌细胞、放线菌孢子：细菌细胞、放线菌孢子：108个个/ml估计：估计：血球计数板计数或血球计数板计数或ODOD法法计数：计数：平板菌落计数平板菌落计数（四）诱变处理（四）
9、诱变处理 1.1.诱变剂的选择诱变剂的选择在在不不影影响响诱诱变变效效果果的的前前提提下下，尽尽量量选选择择毒毒性性小小、易易于于防护、安全性强的诱变剂；防护、安全性强的诱变剂；尽量选择操作简便易行、便宜易得的诱变剂；尽量选择操作简便易行、便宜易得的诱变剂；尽尽量量选选择择不不易易发发生生回回复复突突变变的的诱诱变变剂剂：碱碱基基置置换换易易回回复，染色体畸变、移码等不易回复复，染色体畸变、移码等不易回复对对一一些些既既往往诱诱变变史史少少的的低低产产或或野野生生菌菌株株，uvuv线线往往往往是是首首选选；对对于于经经多多次次诱诱变变处处理理的的菌菌株株，常常需需要要能能诱诱发发染染色体发生重
10、排等较大损伤的强辐射进行处理。色体发生重排等较大损伤的强辐射进行处理。结合细胞的透性和生理状态进行选择结合细胞的透性和生理状态进行选择经常变换诱变剂或复合处理经常变换诱变剂或复合处理2.2.诱变剂量的选择诱变剂量的选择高产菌株在高产菌株在低剂量低剂量时效果较好，而对多核细胞、孢子、时效果较好，而对多核细胞、孢子、低产菌株或质量性状处理剂量不宜过低。低产菌株或质量性状处理剂量不宜过低。经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来激活；一次较高剂量的强诱变后，通常接着进行激活；一次较高剂量的强诱变后，通常接着进行23次次较低剂量的温和诱变，以利于菌株
11、遗传性状的稳定。较低剂量的温和诱变，以利于菌株遗传性状的稳定。在一次诱变中，可以分别采用不同剂量处理出发菌株，在一次诱变中，可以分别采用不同剂量处理出发菌株，从中选出最佳剂量从中选出最佳剂量诱变剂量的控制方法诱变剂量的控制方法化学诱变剂：诱变剂的浓度、处理时间和处理条件；化学诱变剂：诱变剂的浓度、处理时间和处理条件；物理诱变剂：照射距离、照射时间和照射条件物理诱变剂：照射距离、照射时间和照射条件X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变变异的关系异的关系 形态突变型形态突变型 负突变型负突变型 正突变型正突变型 紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土
12、霉素高产菌株紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株293#变异变异的关系的关系 3.处理方法处理方法单一诱变剂处理单一诱变剂处理;复复合合处处理理：两两种种或或两两种种以以上上诱诱变变剂剂同同时时处处理理、不不同同的的诱诱变变剂剂交交替替处处理理、同同一一诱诱变变剂剂连连续续处处理理以及紫外线与光复活交替处理等以及紫外线与光复活交替处理等(注意！注意！)乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果 1-对照；对照；2-乙烯亚胺（浓度乙烯亚胺（浓度1:7000）；）；3,5,7,9-紫外线；紫外线；4,6,8,10-乙烯亚胺加紫外线乙烯亚胺加紫外线 紫外线的剂量（紫外线的剂
13、量（erg/mm2）：）：3,4-2000；5,6-4000；7,8-6000；9,10-10000 3.处理方法处理方法直直接接处处理理：在在缓缓冲冲液液或或无无菌菌生生理理盐盐水水体体系系中中对对出出发发菌菌株株进进行行诱诱变变处处理理，然然后后涂涂平平板板分分离离突变株；突变株；生生长长过过程程处处理理：在在摇摇瓶瓶培培养养基基或或固固体体平平板板中中加加入入诱诱变变剂剂，在在菌菌体体生生长长时时进进行行诱诱变变处处理理。（适用？）（适用？）（五）后培养（五）后培养 后后培培养养：将将诱诱变变处处理理过过的的细细胞胞在在营营养养丰丰富富的的培培养养基基中中进进行行培培养养，使使突突变变基
14、基因因稳稳定定、纯纯合并表达。合并表达。目的：目的：消除表型延迟消除表型延迟后培养培养基：后培养培养基：营养要求丰富，酪素水解营养要求丰富，酪素水解液液(或蛋白胨或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各种生长因子。可提供各种生长因子。（六）变异菌株的分离及筛选（六）变异菌株的分离及筛选 1.1.变变异异株株的的分分离离：多多为为平平板板分分离离，结结合合快快速速检出法（平板预筛）检出法（平板预筛）根根据据形形态态变变异异淘淘汰汰低低产产菌菌株株或或筛筛选选高高产产菌菌株；株；根根据据平平皿皿反反应应淘淘汰汰低低产产菌菌株株或或直直接接挑挑取取高高产菌株产菌株2.2.筛
15、选：筛选：包括初筛，复筛和终筛等包括初筛，复筛和终筛等。明确筛选目标：明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；产产量突变还是其它突变型；产量准备提高多少等；量准备提高多少等；v一次诱变目标不要太高一次诱变目标不要太高。制定筛选方案：制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采用的筛选准备分几步；筛选采用的培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株；培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株；每一步准备采用的分析方法等。每一步准备采用的分析方法等。制定筛选方案时的一些基本原则制定筛选方案时的一些基本原则筛选菌株的量要根据实验室的人力物力条件而定；筛选菌株的量要根据实验室的人力物力条件而定；初筛的目的是将大
16、多数未变异菌株或负变菌株去除，初筛的目的是将大多数未变异菌株或负变菌株去除，这时解决的主要是量的问题，因此每株菌培养时一这时解决的主要是量的问题，因此每株菌培养时一般只在一种培养条件下培养一瓶；培养条件一般沿般只在一种培养条件下培养一瓶；培养条件一般沿用出发菌株的培养条件，分析方法也选用适于处理用出发菌株的培养条件，分析方法也选用适于处理大量样本的、操作简便而快速的方法，如大量样本的、操作简便而快速的方法，如HPLC,GC，比色法等（分析方法的精确性可以稍差一些）。，比色法等（分析方法的精确性可以稍差一些）。复筛时量的矛盾已不突出，而对准确性有了更高的复筛时量的矛盾已不突出，而对准确性有了更高
17、的要求，因此复筛一般要培养要求，因此复筛一般要培养23瓶，分析方法一般瓶，分析方法一般选用经典方法或标准方法，有时要进行几次复筛。选用经典方法或标准方法，有时要进行几次复筛。筛选的一般步骤筛选的一般步骤1株出发菌株株出发菌株诱变处理诱变处理400个单细胞菌株个单细胞菌株初筛每株初筛每株1 1瓶瓶80株株复筛每株三瓶复筛每株三瓶16株株复筛，三种工艺条件，每株各三瓶复筛，三种工艺条件，每株各三瓶3株（对应于不同工艺条件）株（对应于不同工艺条件）供生产或再次诱变使用供生产或再次诱变使用四、诱变育种工作中应注意的问题四、诱变育种工作中应注意的问题安全问题安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用，各种诱变
18、剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安全和环境安全。全和环境安全。v个人安全个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如求不同防护方法，如-射线辐射防护要求较射线辐射防护要求较高，高，uvuv要求较低，而化学诱变剂则要求不与要求较低，而化学诱变剂则要求不与身体有关部位直接接触；身体有关部位直接接触；v环境安全环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释才可以排放。解毒或充分稀释才可以排放。要养成良好的工作习惯：要养成良好的工作习惯：如仔细观察细如仔细观察细微的形
19、态变化、要详实记录菌株的诱变微的形态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。史和诱变谱系。诱变育种技术要和其他育种手段相结合。诱变育种技术要和其他育种手段相结合。诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量十分大，因此不定向性，工作量十分大，因此要对整要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提个工作进行合理的设计并结合新技术提高其工作效率。高其工作效率。第二节第二节营养缺陷型突变株的筛选与应营养缺陷型突变株的筛选与应用用代代谢谢调调控控育育种种（推推理理育育种种 rational selection）：是是指指利利用用代谢调控知识指导筛选工作的育种技术。代
20、谢调控知识指导筛选工作的育种技术。工业与工程需求：工业与工程需求：克服诱变育种筛选盲目性大、效率低的缺陷；氨基酸发酵工业的兴起理论与技术基础：理论与技术基础：某些微生物中一些代谢产物的合成途径，以及这些途径之间的关系和调控特点被揭示；诱变育种技术已经成熟问题探索与技术发展：问题探索与技术发展：对微生物代谢途径的研究不断深入，越来越多的代谢途径和代谢调控方法被阐明一、营养缺陷型及其应用一、营养缺陷型及其应用营营养养缺缺陷陷型型（auxotroph）：是是指指丧丧失失了了合合成成一一种种或或多多种种必必需需生生长长因因子子能能力力的的菌菌株株，它它们们只只能能在在补充了相应的生长因子的培养基上才能
21、正常生长。补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。野野生生型型（wildtype)：从从自自然然界界分分离离到到的的任任何何微微生生物物在在其其发发生生营营养养缺缺陷陷突突变变前前的的原原始始菌菌株株，均均称称该微生物的野生型。该微生物的野生型。原原养养型型（prototroph)：营营养养缺缺陷陷型型突突变变株株经经回回复复突突变变或或重重组组后后产产生生的的、其其营营养养要要求求在在表表型型上上与与野生型相同的菌株。野生型相同的菌株。完完全全培培养养基基CompleteMedium（CM）含含有有满满足足某某微微生生物物的的所所有有营营养养缺缺陷陷型型和和野野生生型型菌菌株株生生长长所
22、需营养物质的天然或半合成培养基。所需营养物质的天然或半合成培养基。基基本本培培养养基基MinimalMedium（MM）：不不含含生生长长因因子子仅仅能能满满足足某某微微生生物物的的野野生生型型菌菌株株生生长长需需要要的最低成分合成培养基。的最低成分合成培养基。补补充充培培养养基基SupplementedMedium(SM)：补补充充了了一一种种或或数数种种生生长长因因子子，以以满满足足某某微微生生物物的的特特定定的的营营养养缺缺陷陷型型生生长长的的培培养养基基，其其中中的的生生长长因因子子多多是通过直接添加是通过直接添加AAAA、碱基或维生素而提供、碱基或维生素而提供。与营养要求有关的三种遗
23、传型与营养要求有关的三种遗传型基本培养基基本培养基MM完全培养基完全培养基CM或补充培养基或补充培养基MM+A、MM+B野生型A+B+原养型A+B+营养缺陷型A+B-或A-B+回复突变或重组诱变（二）营养缺陷型突变株的应用（二）营养缺陷型突变株的应用 科研上：科研上：v研究代谢途径；研究代谢途径；v基因重组的遗传标记菌种；基因重组的遗传标记菌种；vAAAA、碱基、维生素生物测定的试验菌种、碱基、维生素生物测定的试验菌种生产上：生产上：v氨氨基基酸酸，核核苷苷酸酸等等发发酵酵产产品品生生产产菌菌种种的的代代谢调控育种；谢调控育种；v生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记生产菌株杂交育种的亲本进行遗传
24、标记营养缺陷型突变株在代谢调控育种中的应用营养缺陷型突变株在代谢调控育种中的应用 阻断代谢途径，积累中间代谢产物阻断代谢途径，积累中间代谢产物 例：利用谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型积累鸟氨酸谷氨酸谷氨酸N-乙酰乙酰谷氨酸谷氨酸鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸瓜氨酸精氨酰精氨酰琥珀酸琥珀酸精氨酸精氨酸营养缺陷营养缺陷反馈抑制反馈抑制 (1)(2)SAMPAMPXMPIMPGMPR-5-PAMP脱氨酶(3)GMP还原酶阻断分支代谢，积累另一终端代谢产物阻断分支代谢，积累另一终端代谢产物例：利用XMP-生产 AMPC.glutamicum高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶(AK)解除反馈抑制，解除反馈抑制，积累代谢产物积
25、累代谢产物如：高丝氨酸营养缺陷型突变株(Hser-)条件解除（Thr+Lys)对AK的协同反馈抑制应用渗漏突变株进行代谢调控育种应用渗漏突变株进行代谢调控育种p渗漏突变株渗漏突变株(leakage mutant)：一种遗传障碍不完全的营养缺陷型，其特点是酶的活力下降但不完全丧失，使其能少量合成某一代谢产物，但产物的量又不造成反馈抑制。p优点优点：不需要限量添加生长因子。p筛选筛选：营养缺陷型突变株诱变 挑选在MM上生长缓慢且菌落小的回复突变株不同类型突变株积累L-赖氨酸的水平突变菌株突变型产量(mg/ml)钝齿棒杆菌Hse-17.93钝齿棒杆菌Thr-2.33钝齿棒杆菌Thr-+Met-2.0
26、0钝齿棒杆菌AECr20.0AECr,Hse-50.0北京棒杆菌Hse-36.6Hse-,AECr45.0二、营养缺陷型的筛选二、营养缺陷型的筛选诱变处理：同前诱变处理：同前后后培培养养：在在CMCM中中进进行行，消消除除突突变变细细胞胞的的表表型型延延迟（生理性延迟和分离延迟）迟（生理性延迟和分离延迟）饥饥饿饿培培养养：洗洗涤涤后后用用无无氮氮基基本本培培养养基基培培养养46小时，避免在淘汰野生型时营养缺陷型被误杀小时，避免在淘汰野生型时营养缺陷型被误杀淘淘汰汰野野生生型型：降降低低野野生生型型细细胞胞的的数数量量和和比比例例，使营养缺陷型细胞得以相对浓缩使营养缺陷型细胞得以相对浓缩检出缺陷
27、型检出缺陷型鉴定缺陷型鉴定缺陷型淘汰野生型淘汰野生型原原理理：限限制制营营养养成成分分使使缺缺陷陷型型细细胞胞生生长长受受抑抑制制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去方法：方法：v差别杀菌：差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点。利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点。将诱变处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中将诱变处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热杀死营养体。由于野生型芽孢能培养一段时间，然后加热杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，而营养缺陷型不能萌发不被杀死。萌发所以被杀死，而营养缺陷型不能萌发
28、不被杀死。v抗生素法：抗生素法：青霉素能杀死生长态的细菌而对休止态的细菌青霉素能杀死生长态的细菌而对休止态的细菌无作用无作用 v菌丝过滤法：菌丝过滤法：适用于丝状真菌适用于丝状真菌将将诱诱变变后后的的孢孢子子接接种种至至MMMM中中，控控制制培培养养时时间间，使使野野生生型型长长成成菌菌丝丝体体，通通过过过过滤滤而而除除去去菌菌丝丝体体，反反复复几几次次后后，剩剩余的多为缺陷型孢子。余的多为缺陷型孢子。v饥饿法：饥饿法：抗生素淘汰野生型抗生素淘汰野生型饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养于无氮基本培养基中培养1-21-2小时，耗尽细
29、胞小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的内氮源，防止加抗生素后的“误杀误杀”；加抗生素处理：加入等体积的加抗生素处理：加入等体积的2N2N基本培养基基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。以保留。v制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。v注意：注意：培养基应添加渗透压稳定剂而制成高培养基应添加渗透压稳定剂而制成高渗培养基，可避免由于细胞破裂而给缺陷型渗培养基，可避免
30、由于细胞破裂而给缺陷型提供营养物质。提供营养物质。饥饿法饥饿法v原原理理：微微生生物物的的某某些些缺缺陷陷型型菌菌株株在在某某些些培培养养条条件件下下会会因因代代谢谢不不平平衡衡自自行行死死亡亡，可可是是如如果果在在细细胞胞中中发发生生了了另另一一营营养养缺缺陷陷型型突突变变，这这一一细细胞胞反反而而会会因因代代谢谢平平衡的恢复而避免死亡，从而可被浓缩衡的恢复而避免死亡，从而可被浓缩。v举例：举例：1 1）胸腺嘧啶缺陷型细菌在不加胸腺嘧啶时在短时间内）胸腺嘧啶缺陷型细菌在不加胸腺嘧啶时在短时间内细胞大量死亡。而残留下来的细菌中可以发现许多细胞大量死亡。而残留下来的细菌中可以发现许多营养缺陷型。
31、营养缺陷型。2 2）二氨基庚二酸缺陷型：二氨基庚二酸是合成赖氨酸）二氨基庚二酸缺陷型：二氨基庚二酸是合成赖氨酸和细胞壁物质的前体。这一缺陷型在不加赖氨酸的和细胞壁物质的前体。这一缺陷型在不加赖氨酸的情况下不生长也不死亡。给以赖氨酸时反而大量死情况下不生长也不死亡。给以赖氨酸时反而大量死亡。如果细胞中发生了另一个氨基酸缺陷型突变，亡。如果细胞中发生了另一个氨基酸缺陷型突变，它反而可以存活。它反而可以存活。检出缺陷型检出缺陷型限量补充法限量补充法MM+0.01%蛋蛋白白胨胨：野野生生型型菌菌落落大大，缺缺陷陷型型菌菌落落小小夹层培养法夹层培养法制备琼脂平板：制备琼脂平板：培养：长出菌落后作记号培养
32、：长出菌落后作记号加第四层培养基：加第四层培养基：CM培养：新长出的菌落多为缺陷型。培养：新长出的菌落多为缺陷型。夹层平板的制备夹层平板的制备MMMM+菌液MM逐个检出法逐个检出法分离得单菌落：分离得单菌落：CM点种：逐个菌落依次点种至点种：逐个菌落依次点种至MM和和CM上上培培养养：在在MM上上不不长长、CM上上长长的的菌菌落落为为缺陷型缺陷型影印培养法影印培养法分离单菌落：分离单菌落：CM影影印印：用用“印印章章”影影印印至至MM 和和CM上上培培养养：在在MM上上不不长长所所对对应应的的CM上上的的菌菌落落即即为为缺缺陷陷型型v筛筛选选特特定定的的缺缺陷陷型型时时，用用SMSM取取代代C
33、MCM则则可可以以得得到到目目的菌的菌鉴定缺陷型鉴定缺陷型-生长谱法生长谱法大类的鉴定：大类的鉴定：v营养因子：营养因子：A、酪素水解液（、酪素水解液（AA混合物）混合物）B、水溶性维生素混合液、水溶性维生素混合液C、酵母核酸水解液（碱基）、酵母核酸水解液（碱基）D、酵母膏水溶液、酵母膏水溶液v方法：方法：缺陷型菌经缺陷型菌经CM液体培养后，离心洗涤，液体培养后，离心洗涤，制成制成107108个个/ml菌悬液。取菌悬液。取涂布至涂布至MM平板平板上，分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因子上，分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因子后，放入接种的后，放入接种的MM上，适宜温度下培养上，适宜温度下培养v
34、判断：判断：A、D生长，生长，AA缺陷型缺陷型B、D生长，维生素缺陷型生长，维生素缺陷型C、D生长，碱基缺陷型生长，碱基缺陷型AB、D生长，生长，AA、维生素双缺、维生素双缺AC、D生长，生长，AA、碱基双缺、碱基双缺BC、D生长，维生素、碱基双缺生长，维生素、碱基双缺详细鉴定详细鉴定v生生长长因因子子组组合合：10种种生生长长因因子子分分成成4组组，15种种分成分成5组，组，21种分成种分成6组。组。将将各各营营养养因因子子等等量量混混合合，研研细细成成粉粉未未；或或按按照照规规定定量量制制成成混混合合液液。若若氨氨基基酸酸为为DL型型，则则用量加倍。用量加倍。v方方法法：直直接接加加固固体
35、体粉粉未未或或用用无无菌菌滤滤纸纸片片取取少少许许混合液加至培养基平板上培养混合液加至培养基平板上培养v判断：判断：生长圈：单缺生长圈：单缺棱形生长带：双缺或多缺棱形生长带：双缺或多缺抑菌圈：生长因子浓度过高，且为单缺抑菌圈：生长因子浓度过高，且为单缺组生长因子甲123456乙27891011丙3812131415丁4913161718戊51014171920己61115182021生长因子分组方法生长因子分组方法营养缺陷型的生长谱鉴定第三节抗反馈调节突变型的筛选及应用第三节抗反馈调节突变型的筛选及应用一、反馈调节和抗反馈调节突变一、反馈调节和抗反馈调节突变（一）反馈调节（一）反馈调节是指当合
36、成代谢途径的终产物或是指当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的终产物过量积累时，分支代谢途径的终产物过量积累时，抑制合成代谢途径的关键酶（往往是抑制合成代谢途径的关键酶（往往是代谢途径或分支代谢途径第一步的酶）代谢途径或分支代谢途径第一步的酶）的活力或相关酶的合成。反馈调节分的活力或相关酶的合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。为反馈抑制和反馈阻遏。反馈抑制是指合成代谢途径终产物过量积累时反馈抑制是指合成代谢途径终产物过量积累时对该途径前端某些关键酶酶活性的抑制作用。对该途径前端某些关键酶酶活性的抑制作用。反馈阻遏是指微生物合成代谢中高浓度终产物反馈阻遏是指微生物合成代谢中高浓度终产物对该途径
37、上酶合成的抑制作用。对该途径上酶合成的抑制作用。反馈抑制直接以产物浓度控制关键酶的活性，反馈抑制直接以产物浓度控制关键酶的活性，从而控制整个代谢途径，具有快速、有效、经从而控制整个代谢途径，具有快速、有效、经济和直接的特点。反馈阻遏作用是胞内产物过济和直接的特点。反馈阻遏作用是胞内产物过量后终止酶合成的一种机制，与反馈抑制相比，量后终止酶合成的一种机制，与反馈抑制相比，反应较慢，并且往往影响代谢途径中所有酶反应较慢，并且往往影响代谢途径中所有酶（整个操纵子）的合成。（整个操纵子）的合成。突变前突变前突变后突变后反馈抑制与抗反馈抑制突变反馈抑制与抗反馈抑制突变抗反馈阻遏突变的机制抗反馈阻遏突变的
38、机制（二）抗反馈调节突变（二）抗反馈调节突变是指解除了反馈调节的突变株，包括抗反是指解除了反馈调节的突变株，包括抗反馈抑制突变和抗反馈阻遏突变。馈抑制突变和抗反馈阻遏突变。抗反馈抑制突变是指解除了反馈抑制的突抗反馈抑制突变是指解除了反馈抑制的突变株。（变株。（调节中心发生结构改变，无法与调节中心发生结构改变，无法与效应物结合效应物结合）抗反馈阻遏突变是指解除了反馈阻遏的突抗反馈阻遏突变是指解除了反馈阻遏的突变株。（变株。（调节基因突变或操纵基因突变调节基因突变或操纵基因突变）（三）抗反馈调节突变株的筛选（三）抗反馈调节突变株的筛选筛选抗结构类似物突变株筛选抗结构类似物突变株利用回复突变筛选利用
39、回复突变筛选初级代谢产物营养缺陷型回复突变筛选抗反馈调初级代谢产物营养缺陷型回复突变筛选抗反馈调节突变株（节突变株（野生型营养缺陷型原养型）次级代谢产物营养缺陷型回复突变筛选抗反馈调次级代谢产物营养缺陷型回复突变筛选抗反馈调节突变株（节突变株（野生型营养缺陷型原养型）次级代谢产物零产量回复突变筛选抗反馈调节突次级代谢产物零产量回复突变筛选抗反馈调节突变株（变株（高产株零变株高产株）二、抗代谢类似物突变型的筛选二、抗代谢类似物突变型的筛选（一）代谢类似物与抗代谢类似物突变（一）代谢类似物与抗代谢类似物突变代谢类似物：代谢类似物：结构与（初级）代谢物类结构与（初级）代谢物类似，因此可起到代谢物所具
40、有的调节作似，因此可起到代谢物所具有的调节作用而不具备其生理功能的一类化合物。用而不具备其生理功能的一类化合物。Threonine AHV a-Amino-b-hydroxyvaleric acid a-氨基-b-羟戊酸 Lys AEC S-(2-Aminoethyl)-L-Cysteine真正代谢物功能：真正代谢物功能：合成大分子（合成大分子（终产物终产物一般为初级代谢产物，为生长必需一般为初级代谢产物，为生长必需）；）；调节功能（调节功能（反馈反馈）代谢类似物：代谢类似物：只有调节功能，不能合成只有调节功能，不能合成有活性的生物大分子。加入代谢类似物，有活性的生物大分子。加入代谢类似物，将
41、关闭相关代谢物的合成，从而影响微将关闭相关代谢物的合成，从而影响微生物的生长。生物的生长。抗代谢类似物突变株抗代谢类似物突变株：在含有代谢类在含有代谢类似物的基本培养基中能够生长的菌株似物的基本培养基中能够生长的菌株被称作抗代谢类似物突变株。被称作抗代谢类似物突变株。通过基因突变，使变构酶或阻遏蛋白通过基因突变，使变构酶或阻遏蛋白的结构发生改变，使其不能与代谢终的结构发生改变，使其不能与代谢终产物结合，从而解除了代谢终产物的产物结合，从而解除了代谢终产物的反馈调节作用，反馈调节作用，所以即使在代谢类似所以即使在代谢类似物存在时，也能合成相关代谢物，从物存在时，也能合成相关代谢物，从而能够生长。
42、而能够生长。（二二）抗抗结结构构类类似似物物突突变变株株在在代代谢谢调调控育种中的应用控育种中的应用 抗抗结结构构类类似似物物突突变变的的实实质质是是解解除除了了反反馈馈抑抑制制或或反反馈馈阻阻遏遏，因因此此，在在这这类类突突变变株株中中，合合成成代代谢谢途途径径也也不不再再受受代代谢谢终终产产物物的的反反馈馈调调节节，能能够够在在终终产产物物过过量量积积累累的的情情况况下下还还不不断断合合成成该该产产物物，从从而而可可以以大大大大提提高高这这些些终终产产物物的的合合成成量量。抗抗结结构构类类似似物物突突变变在在氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸和和维维生生素素等等初初级级代代谢谢产产物物的的高高产产
43、菌菌株株选选育育中中被被广广泛应用。泛应用。（三）筛选方法（三）筛选方法一一次次性性筛筛选选法法：将将经经过过诱诱变变后后培培养养的的细细胞胞直直接接涂涂布布在在含含有有一一定定浓浓度度结结构构类类似似物物的的基基本本培培养养基基平平板板上上，长长出出的的菌菌落落即即为为抗抗结结构构类类似似物物突突变变株株（药物不很贵药物不很贵）；）；梯梯度度平平板板法法：将将经经过过后后培培养养的的细细胞胞涂涂布布在在基基本本培培养养基基平平板板上上，在在平平板板的的中中央央加加少少量量结结构构类类似似物物，在在抑抑菌菌圈圈内内长长出出的的个个别别菌菌落落即即为为抗抗结结构构类类似物突变株。似物突变株。注：
44、注：如果是协同反馈抑制，则要在基本培养如果是协同反馈抑制，则要在基本培养基中添加起协同反馈抑制作用的产物基中添加起协同反馈抑制作用的产物抗结构类似物突变是数量性状，可通过抗结构类似物突变是数量性状，可通过逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积累水平逐渐提高累水平逐渐提高抗结构类似物突变和营养缺陷型突变等抗结构类似物突变和营养缺陷型突变等共同使用，提高产量的效果会更好。共同使用，提高产量的效果会更好。结构类似物和代谢终产物终产物结构类似物过量积累产物精氨酸D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸,噻吩丙氨酸苯丙氨酸赖氨酸AEC赖氨酸酪氨酸对氟苯丙氨酸,D-酪氨酸酪氨酸色
45、氨酸5-碱基色氨酸,6-甲基色氨酸色氨酸脯氨酸3,4-二氢脯氨酸,磺胺胍脯氨酸腺苷酸2-氟腺嘌呤腺苷酸葡萄糖2-脱氧葡萄糖b-葡萄糖苷酶蔗糖,麦芽糖2-脱氧棉子糖蔗糖酶纤维二糖,葡萄糖甘油纤维素酶第四节第四节 其它类型突变型的筛选及应用其它类型突变型的筛选及应用一、组成型突变株的筛选一、组成型突变株的筛选组成型突变株组成型突变株：在没有诱导底物存在在没有诱导底物存在时也能产生大量诱导酶的突变株。时也能产生大量诱导酶的突变株。筛选原理筛选原理：通过诱变处理，使调节基通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与白，或者操纵基
46、因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。组成型酶。筛选方法：筛选方法：创造一种有利于组成型菌株生长而不利创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型突变株的选择优势；组成型突变株的选择优势；选择适当的鉴别培养基，直接在平板上选择适当的鉴别培养基，直接在平板上识别两类菌落识别两类菌落，从而把组成型突变株选，从而把组成型突变株选择出来。择出来。p限量诱导物恒化培养法限量诱导物恒化培养法控控制制低低于于诱诱导导浓浓度度的的诱诱导导物物作作碳碳源源进进行行恒恒化化连连续续培培养养。诱诱导
47、导型型菌菌株株生生长长极极弱弱，而而变变异异株株由由于于能能产产分分解解底底物物的的酶酶，则则能能分分解解底底物物而而得得以以生生长长。通通过过连连续续不不断断加加入入新新鲜鲜基基质质，野野生生型型就就会会被被“洗洗出出”，组组成成型型突突变变株株就就被被不不断断“浓浓缩缩”，最最后后达达到能分离的浓度。到能分离的浓度。p循环培养法循环培养法不含诱导物培养基不含诱导物培养基含诱导物培养基含诱导物培养基(普通碳源或氮源）普通碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）两两菌菌都都能能生生长长，但但组组成成型型突突变变株株已已能能合合成成特定的酶，亲株不能特定的酶，亲株不能变变
48、异异株株调调整整期期短短，亲亲株株调调整整期期长长，短短时时间间培培养养后后，变异株所占比例增大变异株所占比例增大 反反复复循循环环培培养养几几次次后后，变变异异株株所所占占比比例逐渐提高，然后进行分离例逐渐提高，然后进行分离诱导抑制剂法诱导抑制剂法诱诱导导物物作作唯唯一一碳碳源源或或氮氮源源，添添加加诱诱导导抑抑制制剂剂，只有变异株能合成酶利用底物进行生长只有变异株能合成酶利用底物进行生长例：例：b-b-半乳糖苷酶半乳糖苷酶诱导物：乳糖诱导物：乳糖诱导抑制剂：诱导抑制剂：邻邻硝基苯基硝基苯基-b b-D-岩藻糖苷岩藻糖苷平板菌落识别法平板菌落识别法例：筛选例：筛选b-b-半乳糖苷酶组成型突变
49、株半乳糖苷酶组成型突变株将诱变后的细胞涂布接种到以甘油为唯一碳源将诱变后的细胞涂布接种到以甘油为唯一碳源的平板上的平板上培养后在长出的菌落上喷邻硝基苯半乳糖苷培养后在长出的菌落上喷邻硝基苯半乳糖苷(o-nitropheny-b b-D-galactoside,onp-G)三、细胞膜透性突变型三、细胞膜透性突变型1、提高细胞膜透性的优点、提高细胞膜透性的优点使胞内产物浓度维持较低的水平，有利于酶促使胞内产物浓度维持较低的水平，有利于酶促反应的进行，提高产物的生成量反应的进行，提高产物的生成量使胞内产物浓度维持低于发生反馈抑制或阻遏使胞内产物浓度维持低于发生反馈抑制或阻遏的程度，以积累过量的产物的
50、程度，以积累过量的产物2、提高细胞膜透性、提高细胞膜透性的措施的措施例例1：谷氨酸生产：谷氨酸生产生物素对于细胞膜（脂肪酸）的合成是必需的生物素对于细胞膜（脂肪酸）的合成是必需的筛选筛选Bio-，在限量添加生物素的情况下可使合，在限量添加生物素的情况下可使合成的谷氨酸大量分泌到胞外，使谷氨酸得以过成的谷氨酸大量分泌到胞外，使谷氨酸得以过量积累量积累例例2：5-肌苷酸生产肌苷酸生产Ade-可以合成可以合成5-肌苷酸，但不能分泌到胞外肌苷酸，但不能分泌到胞外在限量在限量Mn2+(10m mg/L）时，可以分泌）时，可以分泌选育选育Mn2+浓度（浓度（100m mg/L)不敏感突变株，能不敏感突变株