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1、实验二实验二 细菌的分离接种细菌的分离接种及理化因素的影响及理化因素的影响实验目的实验目的l掌握培养基制备的基本过程l熟悉常用培养基的原理、种类及其用途l掌握细菌的分离接种方法l皮肤表面的细菌发布及消毒前后对比l紫外线对细菌的影响l药物对细菌的影响实验内容实验内容l1、制备普通琼脂平板l2、细菌在平板上的接种方法及生长表现l3、细菌在液体中的接种方法（肉汤）及生长表现l4、细菌在半固体中的接种方法及生长表现l5、皮肤表面的细菌分布及消毒前后对比l6、紫外线对细菌的影响l7、药物对细菌的影响（药敏实验）制备普通琼脂平板制备普通琼脂平板l将已灭菌的普通琼脂加热融化，冷却至60度左右，倒入灭菌平板中
2、，厚度约为4-5毫米，冷却后备用。细菌在平板上的接种方法及生长细菌在平板上的接种方法及生长表现表现l四区划线法：分别接种大肠埃希菌和枯草杆菌，37度培养24小时，观察光滑型菌落和粗燥型菌落的不同点。细菌在液体中的接种方法（肉汤）及细菌在液体中的接种方法（肉汤）及生长表现生长表现l分别将大肠埃希菌，枯草杆菌，炭疽杆菌接种至肉汤管中，37度培养24小时，观察三种不同的生长表现：混浊生长、表面生长、沉淀生长。细菌在半固体中的接种方法及生细菌在半固体中的接种方法及生长表现长表现l在半固体中分别接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，37度培养24小时，观察有动力的菌和无动力的菌的不同表现。皮肤表面的细菌分布及消
3、毒前后皮肤表面的细菌分布及消毒前后对比对比l将普通平板分区，手指消毒前后分别按一下，37度培养24小时后，比较消毒前后的菌落数。紫外线对细菌的影响紫外线对细菌的影响l将大肠埃希菌密集接种于普通平板上，将平板盖一半打开，置于紫外灯下30分钟，合上盖，放入37度培养24小时，观察紫外灯直接照射和隔着平板盖照射的区别。药物对细菌的影响（药敏实验）药物对细菌的影响（药敏实验）l纸片扩散法（K-B法）l原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解，不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌
4、圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。l方法方法:（4人一组，选人一组，选4个不同的药物纸片）个不同的药物纸片）1、制备MH琼脂平板：将加热融化的琼脂冷却至60左右时倾注于直径为6cm的无菌平板中，使琼脂厚度为4mm，待琼脂凝固后使用，如有冷凝水产生，可放置37 温箱中15-30分钟后使用。2、无菌棉签蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在平板表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60，最后沿平板內缘涂布1周。3、平板在室温下干燥5分钟，用无菌镊子将抗菌药物纸片贴于琼脂表面，各纸片中心相距大于24mm，距平板內缘大于15mm，37 温箱中孵育16-18小时，量取抑菌圈直径。l结果观察中的注意事项：1、准确量取抑菌圈直径，若抑菌圈为椭圆形，量其最长径和最短径，取其平均值。2、若出现双层抑菌圈，一般药物测量内圈，而磺胺类药物则量其外圈。3、若抑菌圈内有散在菌落出现，排除污染菌的存在和其他影响因素，若无污染菌等，需重做。l结果观察结果观察：结果解释结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参照书上的标准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报告。例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药量30微克，抑菌圈14mm为耐药，15-16mm为中介，17mm为敏感。小结