动物细胞培养的基本知识.ppt

《动物细胞培养的基本知识.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物细胞培养的基本知识.ppt（70页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、动物细胞培养的动物细胞培养的基本知识基本知识第二章第二章一、培养细胞的生长类型一、培养细胞的生长类型贴壁型贴壁型细胞细胞:附着在某一固相支持物表面才附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞能生长的细胞。悬浮型悬浮型细胞细胞:不必附着于固相支持物表面，而不必附着于固相支持物表面，而 在悬浮状态下即可生长的细胞在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数绝大多数有机体细胞有机体细胞属粘附型属粘附型细胞，细胞，只有少数细胞类型，如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长只有少数细胞类型，如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长 兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞贴壁贴壁(粘附粘附)型细胞型细胞 粘附粘附:是大多数有机体

2、是大多数有机体细胞细胞在体内在体内 生存生存和和生长发育生长发育的的基本存在方式基本存在方式含义含义 两两方面方面结果结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须有机体的绝大多数细胞必须 粘附粘附于一于一固相表面固相表面 才能才能生存生存和和生长生长。培养时培养时：细胞被放到体外环境中以后：细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞属于粘附型细胞。粘附粘附(锚定或锚着锚定或锚着)依赖型依赖型(性性)细胞：细胞：唯有粘附于固相

3、表面才能生存的细胞唯有粘附于固相表面才能生存的细胞 类型类型细胞在体内、外细胞在体内、外的的粘附粘附方式方式存在差异存在差异 体内体内：粘附粘附是是全方位全方位，外形，外形具有具有复杂的立体特征复杂的立体特征 体外体外：多数情况，细胞只有：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一个附着平面，外形一般一般与体内时明显不同与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态，可分为按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型几大类型 1、成纤维细胞型 n胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态

4、。培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。n小鼠成纤维细胞成纤维细胞 n皮肤成纤维细胞（100 倍）n体外培养的年轻和老的人成纤维细胞的显微形态 n左边是只分裂了几代的年轻成纤维细胞，呈现薄层、细长的形态；右边是分离了50次的老的成纤维细胞，开始衰退，并很快死亡。2、上皮型细胞n细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。3、游走细胞型n常具有胞质突起（伪足），呈散在生长，一般不连成片，呈活跃游走或变形运动，方向不规

5、则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。n单核巨噬细胞系统的细胞4、多形细胞型n细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体为细长型，似丝状伪足。n有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。n（a）成纤维细胞型；（b）上皮细胞型；（c）游走细胞型；（d）多形性细胞型细胞形态的影响因素n细胞种类n血清成分n培养液中的添加成分n酸碱度n气相环境n温度条件悬浮型n见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。o培培养养时时不不贴贴附附于于底底物物而而呈呈悬悬浮浮状状态态生生长长或或以以机机械械方方法法使保持悬浮状态下生

6、长使保持悬浮状态下生长o 来自血，脾或骨髓来自血，脾或骨髓o 在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团o 生存空间大，提供数量大，传代方便生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化不需消化)，易于收获，可获得稳定状态易于收获，可获得稳定状态o 观察不方便观察不方便兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞既能贴壁生长又能悬浮生长既能贴壁生长又能悬浮生长 CHO细胞细胞 小鼠小鼠L929细胞细胞 贴附时：上皮或成纤维细胞形态贴附时：上皮或成纤维细胞形态悬浮时：圆形悬浮时：圆形 二、体外培养物的细胞生物学特点二、体外培养物的细胞生物学特点总的：总的：与体内仍有相似与体内仍有相

7、似-体外培养的细胞体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系细胞和基质的相互关系但有不同但有不同 相对相对孤立孤立、相对单一、相对单一 失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显分化减弱或不显体外培养物的细胞生物学特点体外培养物的细胞生物学特点 体外培养体外培养 单个细胞也能生存和增殖单个细胞也能生存和增殖 但但单个细胞不是细胞永久存在单个细胞不是细胞永久存在的形式的形式,培养的培养的细胞之间细胞之间仍有在仍有在形态形态和和机能上机能上的的 相互依存关系相互依存关系 1.培养的培养的细胞之间细胞之间 仍有在形态和机能上的仍有在形态和机能上的

8、相互依存关系相互依存关系。在在结构上结构上，如：上皮细胞仍见有桥粒，如：上皮细胞仍见有桥粒 在在生理活动上生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖，单个细胞虽能生长繁殖,但但不如群体细不如群体细胞能力强胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止当相邻细胞接触，便导致运动停止 细胞相互沟通生物信细胞相互沟通生物信息息的结果的结果 2.培养的细胞和培养的细胞和基质之间基质之间 对细胞外基质仍有依存性对细胞外基质仍有依存性 相互依存关系相互依存关系 但有不同但有不同 人工所模拟的条件人工所模拟的条件与与体内体内实际情况实际情况 仍仍不完全不完全 相同相同 当细胞被置于当细胞被置于体外培养体外培养后后 久了久了

9、,必然必然发生变化发生变化与体内主要不同与体内主要不同 相对相对孤立孤立、相对单一、相对单一 缺乏体内的缺乏体内的一些一些影响影响 主要表现主要表现 失去原有组织结构和细胞形失去原有组织结构和细胞形 如：肌肉细胞如：肌肉细胞纤维化纤维化 分化减弱或不显分化减弱或不显 出现类似出现类似“返祖返祖”现象：细现象：细胞趋向单一化胞趋向单一化 或获得不死性或获得不死性 或变成具有恶性性状的细胞群或变成具有恶性性状的细胞群 因此因此要正确认识要正确认识体外培养细胞体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体是一种特定条件下生长的细胞群体培养细胞培养细胞的主要的生物学特点n培养细胞分化状态的变化：培养细胞

10、分化状态的变化：1 1、去分化（脱分化）、去分化（脱分化）2 2、不适应、不适应n生长特点：生长特点：1、贴附生长、贴附生长2、接触抑制、接触抑制3、密度依赖性、密度依赖性体外培养物的细胞生物学特点体外培养物的细胞生物学特点 体外培养生长生物学特征具有体外培养生长生物学特征具有两重性两重性 基本生物学特征基本生物学特征 仍仍与体内的细胞相似与体内的细胞相似 培养物培养物在体外在体外条件下生长，条件下生长，许多生长生物学行为许多生长生物学行为发生改变发生改变 培养细胞分化状态的变化培养细胞分化状态的变化 体内体内细胞细胞-三方面三方面的影响与调节的影响与调节:体外环境体外环境的影响的影响 体内神

11、经体内神经体液因素体液因素 的调节的调节 细胞与局部微环境细胞与局部微环境的相互作用的相互作用 控制控制-维持着细胞的维持着细胞的分化特征分化特征。体外体外培养时，培养时，失去了失去了-分化特征分化特征逐渐逐渐减弱减弱 去分化去分化(脱分化):各种分化细胞，逐渐各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与失去各自的形态与功能功能“个性个性”，表现出某种，表现出某种趋同性趋同性 如如:培养的培养的成纤维细胞成纤维细胞 在在适当刺激适当刺激下，下，可可分化分化为为 其它结缔组织细胞其它结缔组织细胞和和肌组织细肌组织细胞胞，表现出，表现出类似未分化类似未分化的间充质细胞的的间充质细胞的特性，特性，返祖返祖。有

12、有2点点1.但但,去分化去分化并不并不意味着意味着完全返回完全返回胚胎时期胚胎时期的原始细胞状态的原始细胞状态如如:高度分化高度分化的的神经细胞神经细胞和和心肌细心肌细已经丧已经丧失的失的增生活性不可能恢复增生活性不可能恢复 但已经具备但已经具备的的生物电活动特性不会完全失去生物电活动特性不会完全失去 2.可可重新表现重新表现出出分化特点分化特点 如：如：把把表皮细胞表皮细胞放在放在气液界面上气液界面上培养，可培养，可分分化化成含大量角蛋白丝的成含大量角蛋白丝的角质细胞角质细胞、内皮、内皮细胞，细胞，但，这种但，这种能力能力会会随着培养时间延随着培养时间延长长 逐渐丧失逐渐丧失总之，体外培养总

13、之，体外培养,使细胞使细胞结构结构与与功能上功能上的的“可塑性可塑性”增大增大 防止去分化防止去分化n提高细胞接种密度n提高Ca2+浓度n诱导分化的激素贴附贴附(粘附粘附)和附着和附着 粘附粘附于固相表面是锚定依赖性细胞于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本生命活动的基本要求要求，细胞被接种到培养器皿内以后，细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生首先要发生粘附粘附(adherence)，是细胞培养以后能否成功的第是细胞培养以后能否成功的第一步一步.细胞悬液后耽搁得越久，越容易发生退化提细胞悬液后耽搁得越久，越容易发生退化提供什么样的供什么样的生长表面生长表面是是细胞能否成功粘附的主要细胞能否成

14、功粘附的主要因素因素。不同细胞不同细胞的的粘附能力不同粘附能力不同 如如巨噬细胞、成纤维细胞巨噬细胞、成纤维细胞等等粘附能力强粘附能力强能在数分钟至能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面数十分钟内粘附到固相表面 如如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱需要数小时乃需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面至更长的时间才能粘附到固相表面 粘附能力强的细胞粘附能力强的细胞-粘附能力弱的细胞粘附能力弱的细胞-可可利用利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）此特点（粘附：快、牢；慢、弱）分离分离、纯化细胞纯化细胞 细胞形态细胞形态因因是否贴附于底物是否贴附于底物而而不同不同悬浮悬浮

15、的细胞的细胞:基本基本圆形圆形粘附粘附和贴壁的细胞和贴壁的细胞:扁平圆形扁平圆形 相差显微镜相差显微镜 “亮圈亮圈”很快很快过渡过渡-贴附过程贴附过程：4步步吸附吸附-接触接触-贴壁贴壁-扩展扩展 影响因素影响因素 各种细胞不同各种细胞不同 如接种如接种30后后第二瓶第二瓶30 (附着最强附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞巨噬细胞一成纤维细胞 上皮细胞上皮细胞血细胞血细胞(最弱最弱)生物因素生物因素 血清、培养液中的促附着因子血清、培养液中的促附着因子 机械机械，物理等物理等其他因素因素其他因素因素 离心：促进附着离心：促进附着 流动：培养液流动可阻止细胞附着流动：培养液流动可阻止细胞附着 低温：

16、可抑制附着低温：可抑制附着 措施措施（因素）（因素）1.包被包被对对分化程度高、生长能力差分化程度高、生长能力差的细胞的细胞 可在可在培养瓶皿表面包被培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和有利于细胞粘附和 生长的生长的生物活性物质生物活性物质 如如:-通过其所带通过其所带电荷先吸附电荷先吸附-,培养的细胞再与其结合。培养的细胞再与其结合。血清内血清内含有多种能够含有多种能够 促进细胞粘附促进细胞粘附的的成分成分 细胞细胞本身也可能本身也可能产生产生一些一些粘附分子粘附分子 2.减少接种减少接种时细胞悬液的时细胞悬液的量量待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液

17、3.减少减少培养液中培养液中血清的含量血清的含量 使培养液使培养液黏度降低黏度降低4.培养液中培养液中离子成分及其浓度离子成分及其浓度 如，培养液中的如，培养液中的Ca含量过低时不利于含量过低时不利于 细胞的粘附、贴壁和细胞的粘附、贴壁和铺展铺展5.培养液的温度培养液的温度 低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁 附着的条件附着的条件 底物底物 细胞能在很多固体表面附着最终铺展的程度，取决于细胞能在很多固体表面附着最终铺展的程度，取决于底物的性质底物的性质影响因素影响因素：活性物质活性物质(贴附贴附、伸展因子伸展因子):血清、培养液中或细胞血清、培养液中或细胞

18、分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展 细胞借助这些分子细胞借助这些分子,可附着于各种可附着于各种”非特异性非特异性”的底的底物上物上 如如Fn，胶原，聚赖氨酸，胶原，聚赖氨酸 机械机械，物理因素物理因素 接触抑制接触抑制和密度依赖性生长仰制密度依赖性生长仰制 运动的接触抑制运动的接触抑制密度依赖性生长仰制密度依赖性生长仰制增殖的密度抑制增殖的密度抑制实验实验方方 法法：3T3细细 胞胞，接接 种种 105于于 6cm培培 养养 皿皿，5d细胞计数细胞计数 于于 加加 入入 10、20、30 牛牛 血血 清清 的的 培养液中，培养液中，结果

19、结果：结果结果：10血清：血清：20hr后后铺满铺满 以后至以后至5d 细胞数不再增加细胞数不再增加(细胞细胞 数约数约1066cm皿皿)30%血清：血清：以后经常换液至以后经常换液至5d，细胞，细胞密度继续增加密度继续增加 (可达可达6xl066cm皿皿)说明说明:密度抑制密度抑制-铺满后不再增殖铺满后不再增殖(分裂停分裂停止止)血清血清可可降低密度抑制降低密度抑制 只加入于只加入于3T3停止生停止生 长的培养液长的培养液中中细胞不生长细胞不生长 当再加入当再加入血清血清 细胞细胞又又生长生长说明说明血清血清可可消除密度抑制消除密度抑制(2)转化细胞的密度抑制降低转化细胞的密度抑制降低 用用

20、此培养液此培养液 3T33T3细胞细胞不再分裂增殖不再分裂增殖 当再加入当再加入1010血清，血清，3T33T3细胞可再增殖细胞可再增殖 表示血表示血清可消除密度抑制清可消除密度抑制 但当用但当用此培养液此培养液，于于转化的转化的3T3细胞细胞(SV3T3)却却生长良好生长良好表示表示转化细胞密度抑制降低转化细胞密度抑制降低(血清血清需要降低需要降低)说明：说明：转化细胞转化细胞的的密度抑制降低密度抑制降低.可可生长生长至至较高较高的密度的密度总的说明：总的说明：细胞生长细胞生长有有密度抑制密度抑制血清血清可可降低密度抑制降低密度抑制转化细胞转化细胞可可降低密度抑制降低密度抑制 四、培养细胞的

21、生长和增殖过程四、培养细胞的生长和增殖过程n（一）培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells）n培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。1原代培养（Primary Culture）期：n也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。n此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。n细胞群是异质的（细胞群是异质的（Heterogeneous），也），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。细胞克隆形成率很低，即细胞独立存性强。细

22、胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。初代培养细胞多呈二倍体核型；生存性差。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。是检测药物很好的实验对象。2传代期n在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。n为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右

23、，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。3衰退期：n此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。n在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生

24、在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。（二）组织培养细胞一代生存期n所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。在细胞一代中，一般要经过以下三个阶段：1潜伏期（Latent Phase）：n细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，

25、这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关 n贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。n初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。2指数增生期n这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一

26、般以细胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行

27、增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。3衰退期 n细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入衰退期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。衰退期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。n 此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。