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1、第三章第三章灭菌灭菌(sterilization)n灭菌的原理及方法灭菌的原理及方法 n培养基和发酵设备的灭菌工艺培养基和发酵设备的灭菌工艺 n空气除菌空气除菌 n灭菌：指用化学或物理的方法杀灭灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。的技术或工艺过程。第一节第一节灭菌的原理及方法灭菌的原理及方法n一一几种常见的灭菌方法几种常见的灭菌方法1化学物质灭菌化学物质灭菌原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变蛋白质变性酶失活。性酶失活。常用的灭菌剂常用的灭菌剂:使用范围：使用范围：器皿、双手
2、和实验室、无菌室的环境灭菌，器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌不能用于培养基灭菌 常用的灭菌剂常用的灭菌剂化学物质名称化学物质名称有效浓度有效浓度化学物质名称化学物质名称有效浓度有效浓度新洁尔灭新洁尔灭(苯扎溴铵苯扎溴铵)0.25%甲醛甲醛37%杜灭芬杜灭芬0.25%戊二醛戊二醛2%高锰酸钾高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚苯酚0.1%-0.15%漂白粉漂白粉5%过氧乙酸过氧乙酸0.02%-0.2%酒精酒精75%焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（来苏尔）煤酚皂（来苏尔）1%5%*2.辐射灭菌辐射灭菌n原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸原理：利用高能量的电
3、磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。的光化学反应造成菌体死亡。n常用：紫外线、常用：紫外线、X射线和射线和射线。射线。n使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌 3干热灭菌干热灭菌 n原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。n常常用用方方法法：灼灼烧烧和和电电热热箱箱加加热热，140-1801-2小时小时n使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌4湿热灭菌湿热灭菌n原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，原理：蒸汽冷凝放出大量
4、潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。n常用方法：常用方法：水煮常压灭菌：水煮常压灭菌：100饱和蒸汽灭菌：一般饱和蒸汽灭菌：一般121，30分钟分钟n使用范围：培养基和发酵设备灭菌使用范围：培养基和发酵设备灭菌。5过滤除菌过滤除菌 n原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。n方法方法:0.010.45 m孔径滤膜，孔径滤膜，n使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。不耐热化合物溶液除菌。二二.湿热灭菌原理湿热灭菌原理 n1.生物热死动力学（对数残存定律）生物热
5、死动力学（对数残存定律）dN/dt =-K NN：菌体个数（个）：菌体个数（个）t:灭菌时间（灭菌时间（min）k：反应速度常数（：反应速度常数（min-1）dN/dt:菌受热死亡速率菌受热死亡速率(个个/min)LnN/N0=-K t N=N0e-K t以菌的残留数以菌的残留数LnN/N0的对数与时间的对数与时间t作作图，得出一条直线，其斜率为图，得出一条直线，其斜率为-K（P222图图14-1）如何通过实验根据对数残存定律确定某一如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度温度,某一微生物的某一微生物的K？1).K 与菌种的特性有关与菌种的特性有关相同温度下，微生物越耐热，相同温度下，微生物越
6、耐热，k值越小。值越小。相同温度下，微生物越不耐热，相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。值越大。2.反应速率常数反应速率常数K2).K 与灭菌温度有关与灭菌温度有关K=AeE/RT（阿累尼乌斯方程）（阿累尼乌斯方程）LnK=LnA-E/RTA：比例常数：比例常数R：气体常数：气体常数(J/molK)T：绝对温度：绝对温度(K)E：杀杀死死细细菌菌所所需需的的活活化能（化能（J/mol）121118115110105第二节 培养基和发酵设备的灭菌工艺 n一培养基灭菌时间的选择一培养基灭菌时间的选择t=1/k*Ln(N0/N)其中其中K：一般耐热的细菌芽孢的：一般耐热的细菌芽孢的K值值N0：细菌
7、及芽孢数之和：细菌及芽孢数之和N：10-3二二.培养基灭菌温度的选择培养基灭菌温度的选择选择即能达到灭菌要求，选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度又保证营养成分不被破坏的温度n1.培养基营养成分破坏动力学方程培养基营养成分破坏动力学方程-dC/dt=K C-dC/dt:营养物降解速度营养物降解速度mol/LhC:营养物浓度营养物浓度mol/LK:营养物降解反应速度常数营养物降解反应速度常数1/st：时间：时间(S)Ln(C/C0)=-K tK=Ae-E/RTLnK=LnA-E/RTA：比例常数：比例常数R：气体常数：气体常数(J/molK)T：绝对温度：绝对温度(K)E：营养物破
8、坏所需的活化能（：营养物破坏所需的活化能（J/mol）2.根根据据实实验验结结果果灭灭菌菌活活化化能能大大于于培培养养基基破破坏活化能坏活化能E E P225 表14-113.灭菌反应灭菌反应营养物破坏反应营养物破坏反应T1 Ln K1=Ln A-E/RT1 Ln K1=Ln A-E/RT1 T2 Ln K2=Ln A-E/RT2 Ln K2=Ln A-E/RT2 Ln(K2/K1)=E/R(1/T1-1/T2)Ln(K2/K1)=E/R(1/T1-1/T2)Ln(K2/K1)=ELn(K2/K1)E Ln(K2/K1)Ln(K2/K1)K2/K1 K2/K1 当温度升高时微生物死亡速度常数比
9、营养物质降解速度常数变化得大4达达到到相相同同灭灭菌菌效效果果，T越越高高，K越越大大，所所需需t越短，采用高温短时（越短，采用高温短时（HTST）灭菌效果好）灭菌效果好n三三影响灭菌效果的因素影响灭菌效果的因素n微生物种类：不同的微生物微生物种类：不同的微生物k值不同。值不同。n初始菌量：在保持初始菌量：在保持N值不变的前提下，值不变的前提下，t 与与初始菌量初始菌量N0的对数成正比。的对数成正比。n培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。热性。n传热与混合状况：影响受热均匀度。传热与混合状况：影响受热均匀度。n培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。培养
10、基中固体颗粒的存在影响热穿透。n蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。npH：酸性：酸性pH下可加快微生物热死速率下可加快微生物热死速率 四四.培养基和发酵设备的灭菌方法培养基和发酵设备的灭菌方法（一）实验室种子培养基灭菌方法（一）实验室种子培养基灭菌方法使用高压蒸汽灭菌锅使用高压蒸汽灭菌锅手提式灭菌锅。手提式灭菌锅。容量小。容量小。立式或卧式灭菌锅。立式或卧式灭菌锅。容量较大，容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶。一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜。灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套，要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培养基的灭菌，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至
11、几千瓶一次能装几百至几千瓶(袋袋)。四四.培养基和发酵设备的灭菌方法培养基和发酵设备的灭菌方法n（二）分批灭菌（二）分批灭菌(batchsterilization)n1定义：定义：将将配配制制好好的的培培养养基基输输入入发发酵酵罐罐中中，用用蒸蒸汽汽加加热热，使使培培养养基基和和设设备备同同时时灭灭菌菌的的一一种种灭灭菌方式。菌方式。n2操作过程：操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基的温度降低到接
12、种的温度。冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。温度随灭菌时间的变化温度随灭菌时间的变化三路进汽：三路进汽：直接蒸汽直接蒸汽从通风、取样和出料从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，直到所规定的温度，并维持一定的时间。并维持一定的时间。这就是所谓的这就是所谓的“三路三路进气进气”。*四路出汽：四路出汽：直接蒸汽直接蒸汽从排气、接种、进料从排气、接种、进料和消沫剂管排气和消沫剂管排气分批灭菌设备示意图分批灭菌设备示意图n三）连续灭菌三）连续灭菌(continuoussterilization)1定定义义：将将培培养养基基通通过过专专门门设设计计的的灭灭菌菌
13、器器，进进行行连连续续流流动动灭灭菌菌后后，进进入入预预先先灭灭过过菌菌的的发发酵酵罐罐中中的的灭灭菌菌方式。方式。2流程：流程：1)由热交换器组成的灭菌系统由热交换器组成的灭菌系统2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统3）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统 由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图温度随时间的变化温度随时间的变化蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统温度随灭菌时间的变化温度随灭菌时间的变化由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭
14、菌系统三）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择三）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌分批灭菌优点：优点：1不需附加设备不需附加设备2蒸汽利用率高蒸汽利用率高3节约劳动力节约劳动力缺点缺点1培养基质量比较差培养基质量比较差2罐的利用率低罐的利用率低3.冷却水用量大冷却水用量大连续灭菌连续灭菌优点：优点：1采用高温快速灭菌法采用高温快速灭菌法2可以把培养基按其性质分开灭菌可以把培养基按其性质分开灭菌3有利于自动控制有利于自动控制4节省冷却水节省冷却水缺点缺点1投资费用高投资费用高2对物料要求高对物料要求高3蒸汽用量大蒸汽用量大选择原则：选择原则：1培养基成份（易降解成分、液化情况等）培养基成份（易降
15、解成分、液化情况等）2设备状况（冷却面积、传动装置等）设备状况（冷却面积、传动装置等）3.动力条件动力条件四、高温对培养基成分的有害影响及其防止四、高温对培养基成分的有害影响及其防止 消除高温有害影响的措施消除高温有害影响的措施n（1 1）采用特殊加热灭菌法）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法）连续灭菌方法）n（2 2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；n（3 3）对含）对含Ca2+或或Fe3+的培养基与磷酸盐先的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷作分别灭菌，然后再混合，
16、就不易形成磷酸盐沉淀；酸盐沉淀；n（4 4）对含有在高温下易破坏成分的培养基）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌 第三节第三节空气除菌空气除菌n一、无菌空气的要求一、无菌空气的要求n1.空气中的微生物空气中的微生物空气中的微生物种类以细菌和细菌芽空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢孢较多，较多，也有酵母，霉菌也有酵母，霉菌孢子孢子和病毒。和病毒。这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为10103 310104 4个米
17、个米3 3。灰尘粒子的平均大小约灰尘粒子的平均大小约左右，所以空气除菌主左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒要是去除空气中的微粒(0.6-1m(0.6-1m）第三节第三节空气除菌空气除菌n一、无菌空气的要求一、无菌空气的要求n无菌空气的标准无菌空气的标准百分数：百分数：美国联邦宇航局等级标准：美国联邦宇航局等级标准：100级（直径小于微米粒子数少于个级（直径小于微米粒子数少于个/L）温度：温度：2540湿度：湿度：30%45%1.纤纤维维或或颗颗粒粒介介质质填填充充床床过过滤滤器器：棉棉花花、玻玻璃璃纤纤维维、腈腈纶纶、涤涤纶纶、维尼纶或活性炭等维尼纶或活性炭等2.折折叠叠式式硼硼硅硅酸酸
18、超超细细纤纤维维过过滤滤器器：超细玻璃纤维超细玻璃纤维3.烧结金属、陶瓷过滤器烧结金属、陶瓷过滤器 n二二介质除菌：介质除菌：原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃微生物截留在介质中，达到除菌的目的。微生物截留在介质中，达到除菌的目的。主要设备：填充床过滤器主要设备：填充床过滤器发酵生产中制备无菌空气的大致过程发酵生产中制备无菌空气的大致过程 空气空气介质除菌介质除菌流程流程高空取气管高空取气管是远离地面几十米的管子。一般而言，地面附近空气中所含的
19、微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。两级分离、冷却、加热的空气除菌流程级分离、冷却、加热的空气除菌流程 粗过滤器粗过滤器压缩机压缩机 贮罐贮罐冷却器冷却器 丝网分离器丝网分离器 过滤器过滤器高效前置过滤除菌流程高效前置过滤除菌流程 高效前置过滤器高效前置过滤器压缩机压缩机贮罐贮罐冷却器冷却器丝网分离器丝网分离器加热器加热器过滤器过滤器三三膜过滤（绝对过滤）膜过滤（绝对过滤）原理：利用微孔滤膜（原理：利用微孔滤膜（microporousmembrane）对空气进行过滤，膜的孔径）对空气进行过滤，膜的孔径微米，大于这一孔径的微生物能绝对截留。微米，大于这一孔径的微生物能绝对截留。膜过滤器膜过滤器：聚四氟乙烯、偏聚二氟乙烯、：聚四氟乙烯、偏聚二氟乙烯、聚丙烯、纤维素脂膜等聚丙烯、纤维素脂膜等