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1、大麦萌发前后淀粉酶活力的测定实验目的 n n学习分光光度计的原理和使用方法。n n掌握淀粉酶活力测定的一般方法。n n了解大麦萌发前后淀粉酶活力的变化。实验原理 n n几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。谷类种子，淀粉酶活性最强。种子萌发时，淀粉种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。淀粉酶主要包括子糖类，供幼苗生长。淀粉酶主要包括-淀粉酶淀粉酶和和-淀粉酶两种。淀粉酶两种。-淀粉酶可随机地作用于淀粉中淀粉酶可随机地作用于淀粉中的的-1,4-
2、1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。糊精等还原糖。-淀粉酶可从淀粉的非还原性末淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解生成麦芽糖。端进行水解生成麦芽糖。n n淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉的水解产物麦淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖与芽糖及其它还原糖与3 3，5-5-二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（DNSDNS）的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3 3，5-5-二二硝基水杨酸生成棕红色的硝基水杨酸生成棕红色的3-3-氨基氨基-5-5-硝基水杨酸。硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色
3、深浅与淀粉酶水解产物的在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。力。n n休眠种子的淀粉酶活力很弱，但经吸胀萌发后，休眠种子的淀粉酶活力很弱，但经吸胀萌发后，淀粉酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而淀粉酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。本实验通过测定大麦种子萌发前后的淀粉增加。本实验通过测定大麦种子萌发前后的淀粉酶活力，来了解
4、此过程中淀粉酶活力的变化。酶活力，来了解此过程中淀粉酶活力的变化。仪器、原料和试剂 n n仪器：小台秤；具塞刻度试管25ml13；研钵；容量瓶50ml 2、100ml 1；离心机；分光光度计；恒温水浴；移液管。n n原料：大麦种子n n试剂：试剂：（1 1）麦芽糖标准液（）麦芽糖标准液（1mg/ml1mg/ml）：称取）：称取100mg100mg麦芽糖，用麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至蒸馏水溶解并定容至100ml100ml（要求严格仔细操作）；（要求严格仔细操作）；（2 2）的柠檬酸缓冲液：）的柠檬酸缓冲液：A A液（柠檬酸）液（柠檬酸）称取分析纯柠檬酸，用蒸馏水溶解并称取分析纯柠檬酸，用蒸馏水
5、溶解并定容至定容至1L1L；B B液柠檬酸钠液柠檬酸钠)称取柠檬酸钠用蒸馏水溶解并定容至称取柠檬酸钠用蒸馏水溶解并定容至1L1L；取取A A液液55ml55ml与与B B液液145ml145ml混匀，即为的柠檬酸缓冲液；混匀，即为的柠檬酸缓冲液；（3 3）1%1%淀粉溶液：称取淀粉溶液：称取1g1g淀粉溶于的柠檬酸缓冲液中。淀粉溶于的柠檬酸缓冲液中。（4 4）3 3，5-5-二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（DNSDNS）：精确称取）：精确称取1g 31g 3，5-5-二二硝基水杨酸溶于硝基水杨酸溶于20ml 2M20ml 2M氢氧化钠中，加入氢氧化钠中，加入50ml50ml蒸馏水，蒸馏水，再加再加
6、30g30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml100ml，盖紧瓶塞，防止盖紧瓶塞，防止CO2CO2进入。若溶液混浊，可过滤。进入。若溶液混浊，可过滤。实验步骤n n种子萌发：大麦种子浸泡后，放入种子萌发：大麦种子浸泡后，放入2525恒温箱内或室温恒温箱内或室温下发芽。大麦萌发所需要的时间与品种有关。若难以萌下发芽。大麦萌发所需要的时间与品种有关。若难以萌发，可适当延长浸泡时间和发芽时间。发，可适当延长浸泡时间和发芽时间。n n酶液提取：称取萌发酶液提取：称取萌发3 3天的大麦种子（芽长），置研钵天的大麦种子（芽长），置研钵中，加少量石英砂和中，加少量
7、石英砂和2ml2ml蒸馏水，研磨成匀浆后转入离蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用心管中，用8ml8ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管提取液在蒸馏水分次将残渣洗入离心管提取液在室温下放置提取室温下放置提取151520min20min，每隔数分钟振荡，每隔数分钟振荡1 1次，使其次，使其充分提取。然后充分提取。然后3000r/min3000r/min离心离心10min10min，取上清液倒入，取上清液倒入50ml50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml5ml，放入，放入50ml50ml容
8、量瓶中容量瓶中（稀释程度视酶活性大小而定），用蒸馏水定容至刻度（稀释程度视酶活性大小而定），用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液，进行酶活力测定。摇匀，即为淀粉酶稀释液，进行酶活力测定。n n取干燥种子或浸泡后的种子作为对照，按上述步骤进行取干燥种子或浸泡后的种子作为对照，按上述步骤进行提取操作。提取操作。n n麦芽糖标准曲线制作麦芽糖标准曲线制作 取取 7 7 支干净的具塞刻度试管，编号，按表加入试剂：支干净的具塞刻度试管，编号，按表加入试剂：n n置沸水浴中加热置沸水浴中加热 5min 5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至。取出冷却，用蒸馏水稀释至 25 m1 25 m1。混匀后以。混匀
9、后以1 1号号管为对照用分光光度计在管为对照用分光光度计在 520 nm 520 nm 波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（为纵坐标，以麦芽糖含量（mg mg）为横坐标，绘制标准曲线。）为横坐标，绘制标准曲线。试剂试剂管号管号1 12 23 34 45 56 67 7麦芽糖标准液麦芽糖标准液（mlml）0 00.20.20.60.61.01.01.41.41.61.62.02.0蒸馏水蒸馏水2.02.01.61.61.41.41.01.00.60.60.20.20 0麦芽糖含量（麦芽糖含量（mgmg）0 00.20.20.60.61.
10、01.01.41.41.61.62.02.0DNSDNS（mlml）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0n n4酶活力测定：取25ml刻度试管5支，编号，按下表要求加入试剂。摇匀，置于水浴中煮沸 5 min,取出后流水冷却，加蒸馏水定容至 25m L。摇匀，以5号管为对照在 520 nm 波长下比色，记录光密度值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，用以表示酶活性。试管标号试管标号试剂试剂加入量加入量/ml/ml1 12 23 34 45 5干燥种子的干燥种子的酶提取液酶提取液 干燥种子的干燥种子的酶提取液重酶提取液重复复 萌发幼苗的萌发幼苗的酶提
11、取液酶提取液萌发幼苗的萌发幼苗的酶提取液重酶提取液重复复空白管空白管酶稀释液酶稀释液1.01.01.01.01.01.01.01.00 0DNSDNS（mlml）0 00 00 00 02.02.0预保温预保温将各试管和淀粉溶液置于将各试管和淀粉溶液置于4040恒温水浴中保温恒温水浴中保温10min 10min 1%1%淀粉溶液淀粉溶液1 11 11 11 11 1保温保温在在4040恒温水浴中准确保温恒温水浴中准确保温5min5min DNSDNS（mlml）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准标准/A未知未知=C
12、标准标准/C未知未知，则 C（酶液管浓度）=A酶酶C标准标准/A标准标准 式中 C浓度；A光吸收值注意事项 n n在实验中要严格控制时间和温度，以减小误差。在实验中要严格控制时间和温度，以减小误差。n n为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min5min时取时取出试管，在依次立即加入出试管，在依次立即加入DNSDNS纪录吸光值，以纪录吸光值，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。差。n n如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发例如萌发1d1d、2d2d、3d3d、4d4d的大麦种子，比较测定的大麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中淀粉酶活力的变化。结果，以了解萌发过程中淀粉酶活力的变化。n n样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。不同材料酶活性的大小而定。思考题 n n测定酶活力，应注意什么问题？n n萌发种子和干种子的淀粉酶活力有何差异？这种变化有何生物学意义？