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1、第二章第二章 原核生物分子克隆的宿原核生物分子克隆的宿主和载体系统主和载体系统本章节主要内容l用于用于DNADNA复制的特殊大肠杆菌品系复制的特殊大肠杆菌品系lDNADNA克隆载体克隆载体l细菌细菌DNADNA转化方法转化方法l基因克隆的噬菌体系统基因克隆的噬菌体系统2第一节 应用广泛的细菌宿主一、一、E.coliE.coli K12 K12 的生物学的生物学l革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌l没有核膜和染色体没有核膜和染色体l一个环状双链一个环状双链DNADNA分子，有一个复制起点分子，有一个复制起点l细胞中能维持细胞中能维持质粒质粒DNADNA的复制的复制l生活周期较短，生活周期较短，20mi
2、n20min分裂一次分裂一次l能在发酵罐中高密度生长能在发酵罐中高密度生长l能在平板上培养出单克隆能在平板上培养出单克隆3A)A)laclac operon operon结构以及表达特性结构以及表达特性二、乳糖操纵子乳糖操纵子lac Zlac Z:-gallactosidase(-:-gallactosidase(-半乳半乳糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）lac Ylac Y:lactose permease:lactose permease（半乳糖苷（半乳糖苷透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁)lac Alac A:tra
3、nsacetylase:transacetylase（半乳糖苷乙（半乳糖苷乙酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收的有毒的硫代半乳糖苷的有毒的硫代半乳糖苷thiogalactoside)thiogalactoside)lac Ilac I:乳糖阻遏蛋白基因乳糖阻遏蛋白基因P Placlac :乳糖代谢结构基因的启动子乳糖代谢结构基因的启动子P PI I:阻遏蛋白基因的启动子阻遏蛋白基因的启动子CAPCAP：代谢激活蛋白结合位点：代谢激活蛋白结合位点4 阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，也能被与别乳阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，也能被与别乳糖结构类似的物质如糖结
4、构类似的物质如IPTG(IPTG(异丙基异丙基-D-D-硫代半乳糖）结合，硫代半乳糖）结合，这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分子，称为子，称为安慰性诱导物安慰性诱导物5二、乳糖操纵子二、乳糖操纵子l利用利用-半乳糖苷酶及其基因半乳糖苷酶及其基因l-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-galX-gal形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中-半乳糖苷酶的活性。半乳糖苷酶的活性。6a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解半乳糖
5、分解半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白-肽段肽段分解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突变体突变体M157a-a-互补显色反应（蓝白斑筛选）总结互补显色反应（蓝白斑筛选）总结细菌菌株细菌菌株野生野生型型突变体突变体（Lac ZLac Z-基基因）因）突变体突变体+无外源片段无外源片段插入质粒插入质粒（Lac ZLac Z-+Lac+Lac ZZ）突变体突变体+有有外源片段插外源片段插入质粒入质粒（Lac ZLac Z-）Lac Z Lac Z 蛋蛋白白有有无（仅有无（仅有片段）片段）有（有（+片段）片段）无（仅有无（仅有片段）片段）底物底
6、物X-galX-gal分解情况分解情况蓝色蓝色菌落菌落白色菌落白色菌落蓝色菌落蓝色菌落白色菌落白色菌落抗生素抗性抗生素抗性无无无无有有有有8第二节第二节 质粒载体质粒载体一、质粒的基本生物学特征一、质粒的基本生物学特征l质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价闭环，双链闭环，双链DNADNA分子。分子。l大都数质粒具有大都数质粒具有复制原点复制原点，能独立进行复制，不，能独立进行复制，不依赖寄主的细胞复制周期。依赖寄主的细胞复制周期。质粒质粒9l质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。生素抗性等。l选择性标记选
7、择性标记(selectable marker):(selectable marker):由于由于质粒携带的基因，可供实验室条件下进质粒携带的基因，可供实验室条件下进行选择的一些标记。如抗性，营养元素行选择的一些标记。如抗性，营养元素的利用等。显性质粒与隐性质粒的利用等。显性质粒与隐性质粒.第二节第二节 质粒载体质粒载体10二、质粒的大小和拷贝数二、质粒的大小和拷贝数l相对分子量从相对分子量从 1kb1kb到到250kb250kb不等。分子量较小不等。分子量较小的适合实验室利用的适合实验室利用l拷贝数拷贝数 严谨型严谨型:少数拷贝存在于细胞中（少数拷贝存在于细胞中（1-1-几个）几个）松弛型松弛
8、型:多个拷贝存在于细胞中（多个拷贝存在于细胞中（1010）严谨型与松弛型是严谨型与松弛型是相对相对的。的。第二节第二节 质粒载体质粒载体11（1 1）、反义）、反义RNARNA进行调控的机制进行调控的机制（plasmid Col E1 plasmid Col E1）RopdimerPRNAIIRNA IIA A、在复制起点处，、在复制起点处，RNA IIRNA II（长（长555555个碱基）与质粒个碱基）与质粒DNADNA形成形成RNA-DNARNA-DNA复合物，复合物，RNARNA酶酶H H的降解的降解RNA II RNA II，露出，露出33自由羟基，自由羟基，质粒复制起始。质粒复制起
9、始。三、调节拷贝数的机理三、调节拷贝数的机理(质粒的复制，补充知识质粒的复制，补充知识)12B B、如果如果RNA IRNA I和和RNA IIRNA II形成双链形成双链RNARNA螺旋，螺旋，RNARNA酶酶H H不能不能降解降解RNA IIRNA II，复制不能进行。，复制不能进行。RopdimerPRNAIIRNA II13C C、当质粒的浓度比较高当质粒的浓度比较高的时，的时，RNA IRNA I和和RNA IIRNA II形形成双链成双链RNARNA螺旋，使质粒螺旋，使质粒的复制不能起始。的复制不能起始。D D、当质粒的比较低时，当质粒的比较低时，RNA IIRNA II与质粒与质
10、粒DNADNA形成形成RNA-DNARNA-DNA复合物，复合物，RNARNA酶酶H H降解降解RNA II RNA II 质粒复制起质粒复制起始。始。E E、突变、突变RNA IRNA I或去除或去除RopRop基基因导致质粒的拷贝数增因导致质粒的拷贝数增加。加。14(2)(2)关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理（pS101pS101质粒）质粒）A A 复制原点区域含有复制原点区域含有3 37 7拷贝的长度为拷贝的长度为171722bp22bp的的重复区域，重复区域，R1R1、R2R2、R3R3等。等。15(2)(2)关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理
11、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 B B、复制原点附近有一个编码基因、复制原点附近有一个编码基因repA,repA,编码编码RepARepA蛋蛋白。白。RepARepA是双功能的蛋白：是双功能的蛋白：与复制原点区域的重复序列结合，起始与复制原点区域的重复序列结合，起始DNADNA的的合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。16质粒拷贝数由质粒拷贝数由RepARepA蛋白浓度和质粒自身的浓度蛋白浓度和质粒自身的浓度进行调节。进行调节。如果质粒拷贝数高，如果质粒拷贝数高，RepARepA蛋白与自身的启动子区蛋白与自身的启动子区域结合，抑制转录
12、，域结合，抑制转录，RepARepA蛋白合成受阻，蛋白合成受阻，DNADNA的复的复制受到抑制。制受到抑制。RepARepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连接起来，避免复制起始。接起来，避免复制起始。细胞分裂后，拷贝数和细胞分裂后，拷贝数和RepARepA蛋白的浓度降低，蛋白的浓度降低，RepARepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNADNA的合成的合成 。(2)(2)关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理17问题：问题：在寄主复制后，质粒是如何分在寄主复制后，质粒是如
13、何分配到子细胞中？配到子细胞中？ParPar原件会附着在细胞膜上，随着细原件会附着在细胞膜上，随着细胞的分裂，质粒正确胞的分裂，质粒正确 分配到子细胞中，分配到子细胞中，维持相对稳定的质粒拷贝数。维持相对稳定的质粒拷贝数。18第二节第二节 质粒载体质粒载体四、相容性四、相容性l在没有选择压力的情况下，两种亲缘关在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，称为细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒质粒的不相容性的不相容性，或称为不亲和性（，或称为不亲和性（Plasmid Plasmid incom-patibilit
14、y)incom-patibility)。这样的两种质粒。这样的两种质粒称为不亲和质粒称为不亲和质粒19第二节第二节 质粒载体质粒载体l引起质粒的不相容的机理引起质粒的不相容的机理 A A 具有相同的复制调控机制具有相同的复制调控机制 B B 控制质粒分配的控制质粒分配的parpar元件相同元件相同,也会引也会引起质粒的不相容起质粒的不相容l不相容群：指那些具有不相容性的质粒组不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子成的一个群体，一般具有相同的复制子ColE1/pMB1ColE1/pMB120五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体克隆载体：是一种能携带
15、外源克隆载体：是一种能携带外源DNADNA片段进入受体片段进入受体细胞，并在受体细胞中得到维持或表达的细胞，并在受体细胞中得到维持或表达的DNADNA分分子。子。通常由天然的质粒、噬菌体或动植物的病毒改通常由天然的质粒、噬菌体或动植物的病毒改造而成。造而成。1 1 质粒克隆载体的命名法质粒克隆载体的命名法pBR322pBR322“p”“p”代表质粒代表质粒“BR”BR”代表构建的实验室代表构建的实验室“322”322”区别于其他的质粒区别于其他的质粒21五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体2 2、质粒载体的一般特性、质粒载体的一般特性（1 1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复
16、制。）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。（2 2）具有选择标记基因）具有选择标记基因（3 3）具有若干限制酶单一位点）具有若干限制酶单一位点（4 4）具有较小的分子量和较高的拷贝数）具有较小的分子量和较高的拷贝数22R7268ApRR1 drd 19ApR CmR SmRSuR KmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApR TcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApR TcR78pMB1(b)五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体3 3、第一个人工构建的遗传载体、第一个人工构建的遗传载体234
17、4、改进了的载体（、改进了的载体（pUCpUC载体载体乳糖选择质粒）乳糖选择质粒）l具有更高的拷贝数具有更高的拷贝数l重组体的识别只需要一步重组体的识别只需要一步l拥有更多的多克隆单酶切位点拥有更多的多克隆单酶切位点五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体24pUCpUC载体载体乳糖选择质粒乳糖选择质粒p(1)(1)来自来自pBR322pBR322质粒的质粒的复制起点复制起点(ori)(ori)；p(2)(2)氨卞青霉素氨卞青霉素抗性基因抗性基因(Amp(AmpR R)，但它的，但它的DNADNA核苷酸序列已经核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点；发生了变化，
18、不再含有原来的限制酶的单识别位点；p(3)(3)大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(laclacZ)Z)的启动子及其编码该基的启动子及其编码该基因氨基端因氨基端-肽链的肽链的DNADNA序列序列,此结构特称为此结构特称为laclacZZ基因基因；p(4)(4)多克隆位点多克隆位点(MCS)(MCS)区段区段：位于：位于laclacZ Z 基因中的靠近基因中的靠近55端，端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的同粘端的目的DNADNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏破坏la
19、clacZ Z 基因的功能。基因的功能。2526pGEMpGEM载体载体克隆克隆DNADNA的体转录的体转录p加入了两个短片段，这两个片段在限制性加入了两个短片段，这两个片段在限制性酶切位点的两侧，可被酶切位点的两侧，可被T7T7噬菌体的噬菌体的RNARNA聚聚合酶或合酶或SP6 T7SP6 T7噬菌体的噬菌体的RNARNA聚合酶的识别聚合酶的识别p方便了克隆方便了克隆DNADNA的体外转录，便于研究的体外转录，便于研究RNARNA加工，合成蛋白质等的研究等加工，合成蛋白质等的研究等五、基于大肠杆菌的克隆载体五、基于大肠杆菌的克隆载体27多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝装有多克隆位点（装有多克隆位点（
20、装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCSMCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZlacZlacZ装有两个噬菌体的强启动子用于外装有两个噬菌体的强启动子用于外装有两个噬菌体的强启动子用于外装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达源基因的高效表达源基因的高效表达源基因的高效表达 注意：注意：注意：注意：T7T7T7T7和和和和SP6SP6SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNADNADNA编码的编码的编码的编码的RNARNARNARNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须
21、表达噬菌聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体体体体RNARNARNARNA聚合酶，如聚合酶，如聚合酶，如聚合酶，如E.coli BL21E.coli BL21E.coli BL21E.coli BL21（DE3DE3DE3DE3）等等等等2743 bp2743 bp2743 bp2743 bpMCSMCSMCSMCSlaclaclaclacZ Z Z Z P P P PT7T7orioriorioriApApApAprrpGEM-3ZpGEM-3ZpGEM-3ZpGEM-3ZP P P PSP6SP6p
22、GEM-3ZpGEM-3ZpGEM-3ZpGEM-3Z：28第三节第三节 噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体l1 1 噬菌体的基本特征噬菌体的基本特征l裂解周期裂解周期l溶源溶源l2 2 溶源性噬菌体溶源性噬菌体l原噬菌体原噬菌体l溶源菌溶源菌l噬菌体噬菌体，M13M1329l噬菌体颗粒中的噬菌体颗粒中的DNADNA是一线性双链是一线性双链DNADNA分子，长分子，长48 48 502bp502bp。l基因簇集排列基因簇集排列l线线噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期l线性线性噬菌体两端各有噬菌体两端各有1212个碱基的个碱基的55凸出黏性末端凸出黏性
23、末端是互补的是互补的,该互补序列相互作用形成该互补序列相互作用形成coscos位点。位点。作用：进入细胞的作用：进入细胞的DNADNA通过两端的黏性末端环化。通过两端的黏性末端环化。作为内切酶的识别位点作为内切酶的识别位点一、一、噬菌体的生物学噬菌体的生物学3031321 1、对野生、对野生噬菌体的改进噬菌体的改进 A A、删除多余的限制性内切酶的位点。删除多余的限制性内切酶的位点。B B、切除一些非必需序列，增加载体的容量。、切除一些非必需序列，增加载体的容量。C C、设计阳性选择重组子的方法。、设计阳性选择重组子的方法。D D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入、设计可方便地通过转录作用
24、制备外源插入DNADNA的的RNARNA探针的载体探针的载体 E E、发展可以使插入的真核、发展可以使插入的真核cDNAcDNA与与半乳糖苷酶半乳糖苷酶形成融合蛋白的载体。形成融合蛋白的载体。二、基于二、基于噬菌体的克隆载体噬菌体的克隆载体332 2、噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力l噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关，状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关，即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关l
25、删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环二、基于二、基于噬菌体的克隆载体噬菌体的克隆载体343 3、噬菌体载体可分为噬菌体载体可分为q插入型载体：只具有一个可供外源插入型载体：只具有一个可供外源DNADNA插插入的克隆位点。入的克隆位点。失去了非必需区失去了非必需区切点又位于报告基因上，故在切开切点又位于报告基因上，故在切开DNADNA并插入外源基因并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为可插入长度为10kb10kb的外源的外源DNADNA 二、基于二、基于噬菌体的克隆载体噬菌体的克隆
26、载体35两种报告基因的插入型载体两种报告基因的插入型载体lcIcI基因内保留基因内保留HindHindIIIIII和和EcoEcoRIRI单酶切位点，当有单酶切位点，当有外源外源DNADNA在这酶切位点插入时，使在这酶切位点插入时，使cIcI基因失活，感基因失活，感染染hf-hf-大肠杆菌后可形成空斑（大肠杆菌后可形成空斑（如如gt10gt10）。l在噬菌体在噬菌体DNADNA插入的插入的lacZlacZ基因末端设有单一的基因末端设有单一的EcoEcoRR酶切位点酶切位点。在此处插入外源基因，可表达。在此处插入外源基因，可表达-半乳糖苷酶的融合蛋白半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或，利用特
27、异性抗体或DNADNA测序方法可测序方法可筛选重组筛选重组DNADNA。这类载体适宜构建。这类载体适宜构建cDNAcDNA文库文库(如如ZAPII)ZAPII)二、基于二、基于噬菌体的噬菌体的克隆载体克隆载体36q替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA DNA区段可以被外源插入的区段可以被外源插入的DNADNA所取代。所取代。可克隆的片段大，最大可达可克隆的片段大，最大可达23kb23kb，而质粒最大仅，而质粒最大仅10 kb10 kb左左右；右；DNADNA的长度的长度大于大于野生型野生型噬菌体噬菌体DNADNA长度的长度
28、的7575而不超过而不超过其其105105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNADNA的长度短于的长度短于野生型的野生型的75%75%或超过或超过105%105%时，噬菌体的活性就急剧下降，时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求因此要求载体载体DNADNA和外源和外源DNADNA长度之和在长度之和在393953kb53kb之间。之间。二、基于二、基于噬菌体的噬菌体的克隆载体克隆载体37三三 克隆载体的体外包装克隆载体的体外包装l体外包装：体外包装：模拟模拟噬菌体噬菌体DNADNA分子在宿主细胞内发生的分子在宿主细胞内发生的包装过程，将重组的包装过程，将重组的噬菌体噬菌
29、体DNADNA分子包装成成分子包装成成熟的具有感染能力的熟的具有感染能力的噬菌体颗粒噬菌体颗粒l必要性：必要性：噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理，率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理，DNADNA的连接产生的有效分子等原因，使得转染效的连接产生的有效分子等原因，使得转染效率更低率更低38三三 克隆载体的体外包装克隆载体的体外包装39三三 克隆载体的体外包装克隆载体的体外包装l单菌株体系单菌株体系 缺陷型缺陷型噬菌体在噬菌体在coscos位点有突变，位点有突变，噬菌体的噬菌体的DNADNA复制不能完成，但可形成复制不能完
30、成，但可形成外壳蛋白，可以制备包装所必须的各种外外壳蛋白，可以制备包装所必须的各种外壳蛋白壳蛋白。40三三 克隆载体的体外包装克隆载体的体外包装3 3 双菌株的体外包装原理双菌株的体外包装原理A A 噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行B B 头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部C C 尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部D D 两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体外装备形成有活性的噬菌体颗粒外装备形成有活性的噬菌体颗粒41Lyse,mixAdd ATP
31、and concatemerized DNAMature phage particles42重组噬菌体的鉴别重组噬菌体的鉴别 lacZ lacZ基因功能选择方法基因功能选择方法类似于质粒中的蓝白斑筛选类似于质粒中的蓝白斑筛选 cIcI基因功能选择法基因功能选择法cI cI 插入失活的噬菌斑是插入失活的噬菌斑是“清澈清澈”的，而野的，而野生型正常的噬菌斑是生型正常的噬菌斑是“浑浊浑浊”的的435.4 5.4 重组噬菌体的鉴别重组噬菌体的鉴别SpiSpi-（s sensitive to ensitive to P P2 2 i inhibitionnhibition）正选择）正选择 A A 野生型
32、野生型噬菌体，不能在噬菌体，不能在P2P2噬菌体溶源性细菌噬菌体溶源性细菌中生长，为中生长，为SpiSpi+，即对在即对在P2P2噬菌体的抑制成敏感噬菌体的抑制成敏感反应。反应。B B 噬菌体载体中的噬菌体载体中的redred和和gamgam区段被外源片段取区段被外源片段取代后，代后，噬菌体就能在噬菌体就能在P2P2噬菌体溶源性细菌中噬菌体溶源性细菌中生长。生长。445.4 5.4 重组噬菌体的鉴别重组噬菌体的鉴别基于基于基因组大小的筛选基因组大小的筛选l包装体系只能将大小包装体系只能将大小37-52Kb37-52Kb的的DNADNA分子插分子插入到噬菌体的头部结构中入到噬菌体的头部结构中l插
33、入型载体（第六章）通常删除了噬菌体插入型载体（第六章）通常删除了噬菌体的中非必须的基因部分，因此中有重组后的中非必须的基因部分，因此中有重组后介于介于3752Kb3752Kb的分子才能被包装。的分子才能被包装。45二、二、M13 M13 噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体M13M13噬菌一般特点噬菌一般特点l仅仅6407 6407 个核苷酸个核苷酸l有双链环状，单链环状存在形式有双链环状，单链环状存在形式l基因组采取滚环复制形式基因组采取滚环复制形式l适合做载体适合做载体l具有比具有比噬菌体更大的装载能力噬菌体更大的装载能力l单链形式在某些实验过程很重要，如测序、单链形式在某些实验过程很重要，如测序
34、、体外突变等体外突变等4647第四节第四节 外源外源DNADNA和载体的连接和载体的连接481 1、互补黏性末端之间的链接、互补黏性末端之间的链接同一限制酶切割位点连接：同一限制酶切割位点连接：由同一限制性核酸内切酶切割的由同一限制性核酸内切酶切割的不同不同DNADNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNADNA后产生单链后产生单链突出（突出（55突出及突出及33突出）的粘性末端，同时酶切位点附近的突出）的粘性末端，同时酶切位点附近的DNADNA序列不影响连接，那么，当这样的两个序列不影响连接，那么，当这样的两个DNADNA片段一起退火时，片段一起退火时，粘
35、性末端单链间进行碱基配对，然后在粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNADNA连接酶催化作用下连接酶催化作用下形成共价结合的重组形成共价结合的重组DNADNA分子。分子。一、外源一、外源一、外源一、外源DNADNADNADNA和载体连接的方法和载体连接的方法和载体连接的方法和载体连接的方法4950一、外源一、外源 DNA DNA 和载体的连接方法和载体的连接方法2 2、平末端之间的链接、平末端之间的链接DNADNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割切割DNADNA后产生的平
36、端也属配伍末端，可彼此后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互相互连接；若接；若产生的粘性末端生的粘性末端经特殊特殊酶处理，理，使使单链突出突出处被被补齐或削平，或削平，变为平端，也可平端，也可实行平端行平端连接。接。操作方法同黏性末端之间的链接，增加酶的用操作方法同黏性末端之间的链接，增加酶的用量。量。513 3、将粘末端加到平末端分子上、将粘末端加到平末端分子上DNA DNA 接头接头同聚物加尾产生粘性末端同聚物加尾产生粘性末端PCRPCR产物的克隆连接（特例）产物的克隆连接（特例）一、外源一、外源 DNA DNA 和载体的连接方法和载体的连接方法52DNA DNA 接头接头53 同聚物加尾连
37、接是利用同聚物序列，如多同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚聚A A与多聚与多聚T T之间的退火作用完成连接。在末端之间的退火作用完成连接。在末端转移酶转移酶(terminal transferase)(terminal transferase)作用下，在作用下，在DNADNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。也属于粘性末端连接的一种特殊形式。同聚物加尾产生粘性末端同聚物加尾产生粘性末端同聚物加尾产生粘性末端同聚物加尾产生粘性末端54dATP
38、dTTP55PCRPCR产物的克隆连接产物的克隆连接lPCRPCR反应中所使用的聚合酶具有末端转反应中所使用的聚合酶具有末端转移酶的活性，通常在移酶的活性，通常在33末端加上末端加上A A。l经特使处理的载体具有经特使处理的载体具有3 3 突出突出T T碱基，碱基，通过通过T/AT/A互补，进行克隆。属于黏性互补，进行克隆。属于黏性末端的连接，该克隆方式特称末端的连接，该克隆方式特称TATA克隆。克隆。56从生物秀网站下载57二、定向克隆二、定向克隆l将外源DNA按正确的方向插入载体。通常采用不同的内切酶分别处理载体和片段，使线性载体和片段的两段带有不同的粘性末端，通过载体与片段之间的连接，实
39、现定向克隆。58第五节第五节：一个基因在：一个基因在E.coli 中的调节表达中的调节表达59一、研究目的一、研究目的l研究拟南芥中钙结合蛋白研究拟南芥中钙结合蛋白肌钙网蛋白肌钙网蛋白在花中的功能。在花中的功能。l需制备该蛋白的抗体需制备该蛋白的抗体60二、研究基础二、研究基础l获得了基因的获得了基因的cDNAcDNA克隆克隆l获得了原核表达载体和细菌菌株获得了原核表达载体和细菌菌株l获得了纯化蛋白质用的金属螯合层析柱获得了纯化蛋白质用的金属螯合层析柱l具备免疫家兔的实验技术具备免疫家兔的实验技术61三、研究策略三、研究策略l1 1、构建原核表达载体构建原核表达载体l2 2、纯化蛋白纯化蛋白l
40、3 3、免疫家兔、免疫家兔l4 4、检测该蛋白质在花中的表达、检测该蛋白质在花中的表达62MCSMCS将外源片段与载将外源片段与载将外源片段与载将外源片段与载体用相同的内切体用相同的内切体用相同的内切体用相同的内切酶处理后，连接，酶处理后，连接，酶处理后，连接，酶处理后，连接，形成重组分子，形成重组分子，形成重组分子，形成重组分子，构建表达载体构建表达载体构建表达载体构建表达载体1 1 1 1、如何构建载体？、如何构建载体？、如何构建载体？、如何构建载体？63l2 2、原核表达载体、原核表达载体pETpET系统能够表达外系统能够表达外源基因的原理源基因的原理（a a）分别利用分别利用 T7 R
41、NAT7 RNA聚合酶转录目标基因，用聚合酶转录目标基因，用大肠杆菌自身的系统翻译合成目标蛋白质。大肠杆菌自身的系统翻译合成目标蛋白质。（b b）需要大肠杆菌能表达）需要大肠杆菌能表达T7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶（c c）加入诱导物（）加入诱导物（IPTGIPTG，异丙基，异丙基-D-D-硫代半乳硫代半乳糖苷糖苷 ）同时开启）同时开启T7 RNAT7 RNA聚合酶和目标基因的表聚合酶和目标基因的表达。达。（d d）对）对SDSD序列与序列与AUGAUG之间的距离进行了优化之间的距离进行了优化64lac OT7 gene 1lacpromoterE.Coli,RNA 聚合酶lac Ige
42、nelac IrepressorIPTG 诱导Host cellT7 RNA 聚合酶lac OT7 promotertarget genelac Igenelac IrepressorpETT7 RNA polimeraseIPTG induction克隆到克隆到pETpET载体中的基因表达调控策略载体中的基因表达调控策略65lac OT7 gene 1lac promoterE.Coli,RNA polimeraselac I genelac I repressorIPTG inductionHost cellT7 RNA polimeraselac OT7 promotertarget g
43、enelac I genelac I repressorpETT7 RNA polimeraseIPTG inductionpLysSOrET7lysozmegeneT7lysozmeinactive克隆到克隆到pETpET载体中的基因表达调控策略载体中的基因表达调控策略-控制控制T7 RNAT7 RNA聚合酶本底表达聚合酶本底表达66lac OT7 gene 1lac promoterE.Coli,RNA polimeraselac I genelac I repressorIPTG inductionHost cellT7 RNA polimeraselac OT7 promotertar
44、get genelac I genelac I repressorpETT7 RNA polimeraseIPTG inductionpLysSOrET7lysozmegeneT7lysozmeinactive克隆到克隆到pETpET载体中的基因表达调控策略载体中的基因表达调控策略-控制控制T7 RNAT7 RNA聚合酶本底表达聚合酶本底表达67(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXBLigandcontainingNiXBAAu诱导融合蛋白表达后，用裂解液将细菌裂解，释放蛋白。诱导融合蛋白表达后，用裂解液将细菌裂解，释放蛋白。u将裂解液过一个镍柱将裂解液过一个镍柱u将污染的蛋白洗涤后，将目标蛋白洗脱将污染的蛋白洗涤后，将目标蛋白洗脱6869