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1、 蛋白质与蛋白质与DNA的相互作用的相互作用 刘兴汉刘兴汉哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室分类：与单链RNA结合 与茎环结构结合 与双链DNA结合：普遍性结合 特异性结合蛋白质与DNA结合的特性：识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。2.蛋白质和DNA的接触区只在DNA的一侧。3.在结合过程中，蛋白质和DNA都有构像改变。4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团形成离子键。5.特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷基接触。蛋白质与DNA的普遍性结合中DNA
2、特点：蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。与DNA硷基序列特异性无关 结构的匹配性：旋转对称性 特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力1.蛋白质和DNA都存在0.7nm 的重复距离 DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是。折叠，N原子间距离是 伸展折叠C间距离是 螺旋，Arg和Lys被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的距离是0.7nm.对称性 平移对称：GCATCT GCATCT CGTAGA CGTAGA 二重轴对称 GCATCT TCTACG CGTAGA AGATGC 二重旋转对称 GCATCT AGATGC CGTAGA TCTACG旋
3、转对称 GCATCT CGTACA CGTAGA GCATGT 蛋白质与DNA特异性结合中DNA特点：大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间形成氢键 NNOHNNNHNNONHCOOCCNHHNHHHGluAgrH蛋白质与DNA普遍结合中蛋白质特点：-折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合 可能是通过识别小沟结构实现 1.富含脯氨酸和碱性氨基酸 组蛋白有重复的SPKK Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg PRGRP序列与A-T碱基对结合 KPRGRPK序列也能与小沟A-T结合 2.碱性螺旋 组蛋白H1C端57个氨基酸 Lys和Gly,Lys在螺旋两侧
4、，Gly夹在中间 3.蛋白磷酸化作用 SP X X：Ser磷酸化 TPKK：Tyr磷酸化 磷酸化后和DNA结合能力下降 磷酸化失去氢键蛋白质与DNA特异性结合中蛋白质特点：1.蛋白质多形成二聚体HTH复合物同源盒结构亮氨酸拉链结构NH2COOH碱性氨基酸碱性氨基酸AgrAgr和和LysLys锌指结构Agr和G形成氢键细胞核蛋白质的提取 收集细胞，洗去血清和培养基 裂解细胞：Triton X-100 NP-40 去胞浆成分 裂解细胞核：高浓度KCl:600mM 变更缓冲液浓度快速抽提 裂解液：提取液：10mM HRPES 250mM Tris 1mM EDTA 60mM KCl 60mM KCl
5、 1mM DTT 1mM DTT 1mM PMSF 0.5%NP-40 1X107细胞100ul裂解液、冰浴5分钟、离心沉淀用不含NP-40的裂解液洗一次100ul提取缓冲液干冰异丙醇速冻，反复冻融3次离心沉淀 800C保存 凝胶滞后试验1.蛋白质和DNA结合复合物半衰期短 电泳缓冲液低离子强度 凝胶的笼效应2.探针以20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合，过大增加非特异性结合。3.用竞争性抑制检测DNA与蛋白质结合的特异性4.加3ug Poly(dI-dC)减少非特异性结合5.超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用6.只能确定结合，无法确定序列DNA足迹分析DNA足迹分析随机水解核苷酸磷酸
6、二酯键 每一个DNA分子最好只切一次2.蛋白质与DNA结合保护DNA不被切割3.电泳用的是变性凝胶：相差一个核苷酸DNA彼此分开 蛋白质从DNA分子上脱落4.可确定与蛋白质结合的DNA序列序列是固定的随机PCR凝胶阻滞试验：蛋白质和DNA结不结合，不能确定结合的序列DNA足迹分析：蛋白质结合DNA的序列 不能确定序列硷基变化对 结合的影响随机PCR:结合序列硷基变化对结合的影响寡核苷酸设计与合成：1.AAGAATTCNNNNNNNNNGGATCCAA2.引物合成3.标准结合反应寡核苷酸的合成4.电泳回收探针标记：合成的含随机序列的单链寡核苷酸 3引物 32PdCTP dNTP(不包括dCTP)
7、Klenow酶电泳纯化凝胶阻滞试验纯化探针1.蛋白质与标准结合寡核苷酸结合 蛋白质与随机寡核苷酸结合 电泳（样品隔开，防污染）2.凝胶回收3.酚、氯仿去蛋白（底物加32PdCTP）产物再做凝胶阻滞试验，反复纯化特异结合序列的克隆和序列分析：酶切随机核苷酸序列与质粒重组 用引物对质粒序列进行分析 N1 N2 N3 N4 N5G 4/0.01 6/0.14 T 17/0.39 13/0.30 11/0.25 4/0.01 T/A A/T/C C C G/A 超过50%：确定不可替换25-50%：两种硷基可替换小于25%：没有硷基特异性 SouthWestern杂交试验确定与DNA结合的蛋白质分子量 蛋白质进行SDS-Page 转移硝酸纤维素膜 与核酸探针杂交亲和层析纯化DNA结合蛋白凝胶阻滞检查DNA能否和蛋白质结合足迹法，测序确定DNA序列合成DNA制备亲和层析柱蛋白过亲和柱纯化 谢谢