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1、超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)(SOD)活性测定活性测定(NBT(NBT法法)一、测定意义一、测定意义二、目的要求二、目的要求三、原理三、原理四、仪器设备四、仪器设备五、试剂配制五、试剂配制六、植物材料六、植物材料七、操作步骤七、操作步骤八、结果计算八、结果计算九、注意事项九、注意事项十、思考题十、思考题一、意义一、意义：细胞内自由基的产生和消除处于动态平细胞内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，自由基水平很低，不会伤害细衡状态，自由基水平很低，不会伤害细胞。胞。植物正常情况下植物正常情况下植物逆境胁迫下植物逆境胁迫下O O-.-.2 2、H H2 2O O2 2、OHOH的产量增加；
2、的产量增加；SODSOD、CATCAT、PODPOD活性降低；活性降低；VtEVtE、VtCVtC、CARCAR、GSHGSH含量降低；含量降低；从而伤害细胞。从而伤害细胞。植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破什么叫逆境？什么叫逆境？逆境逆境是指对植物生存生长是指对植物生存生长不利的各种环境因素的总称不利的各种环境因素的总称.逆境的种类逆境的种类?为什么要测定为什么要测定完全液和缺素完全液和缺素苗的苗的SODSOD活性？活性？二、目的要求：二、目的要求：1.了解SOD活力测定的实践意义；2.掌握SOD测定的原理及操作要点；3.比较完全液溶液和缺素溶液培养的 玉米
3、苗叶片SOD活性的差异。三、原理：三、原理：三、原理：三、原理：依依据据SODSOD能能抑抑制制氮氮蓝蓝四四唑唑（NBTNBT）在在光光下下的的还还原原作作用用来来确确定定酶酶活活性性大大小小。在在有有氧氧化化物物质质存存在在下下，核核黄黄素素可可被被光光还还原原，被被还还原原的的核核黄黄素素在在有有氧氧条条件件下下极极易易再再氧氧化化而而产产生生O O2 2.-.-，可可将将氮氮蓝蓝四四唑唑还还原原为为蓝蓝色色的的甲甲腙腙，后后者者在在560560nmnm处处有有最最大大吸吸收收。而而SODSOD可可清清除除O2.-，从从而而抑抑制制了了甲甲腙腙的的形形成成。于于是是光光还还原原反反应应后后
4、，反反应应液液蓝蓝色色愈愈深深，说说明明酶酶活活性性愈愈低低，反反之之酶酶活活性性愈愈高。据此可以计算出酶活性大小。高。据此可以计算出酶活性大小。四、仪器设备四、仪器设备研钵；玻璃试管研钵；玻璃试管;40;40W W荧光灯荧光灯;移液管等。移液管等。五、试剂配制五、试剂配制 1 1、提取介质提取介质5050mmol/L(pH7.0)mmol/L(pH7.0)磷酸缓冲液磷酸缓冲液。2 2、反反应应介介质质5050mmol/L(pH7.8)mmol/L(pH7.8)磷磷酸酸缓缓冲冲液液,内内含含mol/Lmol/L硝基四唑蓝硝基四唑蓝mmolmmol蛋氨酸。蛋氨酸。3、mol/Lmol/L核核 黄
5、黄 素素 溶溶 液液:用用 含含 有有 mmol/L mmol/L EDTAEDTA的的5050mmol/L(pH7.8)mmol/L(pH7.8)的磷酸缓冲液配制。的磷酸缓冲液配制。SODSOD反应混合液反应混合液ml反应介质反应介质ml mol/Lmol/L核黄素溶液核黄素溶液六、植物材料六、植物材料:玉米叶片玉米叶片:完全液培养苗完全液培养苗 缺素液培养苗缺素液培养苗七、操作步骤七、操作步骤将玉米叶片剪细将玉米叶片剪细混合均匀混合均匀称称0.0.2g2g(用保鲜膜包好放低温用保鲜膜包好放低温冰箱预冻冰箱预冻)研研磨磨成成匀匀浆浆再再加加入入3 3mlml缓缓冲冲液液,研研磨磨均均匀匀后后
6、,将将匀匀浆浆液液倒倒入入聚聚乙乙烯烯离离心心管管中中低低温温(0 044)下下、48004800rpmrpm离离心心1010minmin上上清清液液即即为为酶酶液液，将将上清液倒入小青霉瓶，低温下贮存，供上清液倒入小青霉瓶，低温下贮存，供SODSOD活性测定。活性测定。1、酶液的提取：、酶液的提取：加入加入2 2mlml冰冷的冰冷的磷酸缓冲液及少量的磷酸缓冲液及少量的石英砂石英砂 研钵研钵 2.2.SODSOD活性测定：活性测定：取取6 6支支试试管管,编编号号,按按下下表表加加入入试试剂剂。将将1 1号号管管用用黑黑纸纸袋袋套套上上,与与其其它它试试管管一一起起放放荧荧光光灯灯下下,光光强
7、强30003000LxLx照照光光1010min,min,到到时时间间后后关关灯灯,用用黑黑布布罩罩上上试试管管(如如室室内内光光线线不不强强,不不罩罩黑黑布布也也可可),),以以1 1号号试试管管溶溶液液为为参参比比,测测定定样样品品在在560560nmnm处处的的吸吸光光度度。不不加加酶酶的的2 2号号试试管管溶溶液液颜颜色色最最深深;加加入入酶酶的的由于由于SODSOD抑制了硝基四唑蓝的光还原抑制了硝基四唑蓝的光还原,颜色变浅。颜色变浅。2、活性测定：取6支干燥的、玻璃质量一致的普通试管，按下表顺序加入试剂式中：式中：A Ackck为为2 2号对照管溶液在号对照管溶液在560560nmn
8、m处的吸光度值处的吸光度值;A AE E为样品测定管溶液在为样品测定管溶液在560560nmnm处的吸光值处的吸光值;V V为酶液总体积（为酶液总体积（ml)ml)；W W为提取酶液的植物材料的鲜重（为提取酶液的植物材料的鲜重（g)g)；VtVt为测定时酶液的用量为测定时酶液的用量(ml)ml)。八、结果计算：八、结果计算：（Ack-AE)V SOD活性活性(U/g鲜重鲜重)AckWVt50 一一个个酶酶活活单单位位定定义义为为将将硝硝基基四四唑唑蓝蓝的的还还原原抑抑制制到到对对照照一一半半(50(50)时所需的酶量。时所需的酶量。九、注意事项九、注意事项:1.1.所用试管的玻璃质量要一样。包
9、括厚度、直径、质量等。所用试管的玻璃质量要一样。包括厚度、直径、质量等。2.2.照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。3.3.要多做对照消除日光灯管的光质差异。要多做对照消除日光灯管的光质差异。4.植植物物组组织织中中的的酚酚类类物物质质对对测测定定有有干干扰扰，对对酚酚类类含含量量高高的的材材料料提提取取酶酶液液时时可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。5.5.结果计算时要用相邻对照管代入公式计算。结果计算时要用相邻对照管代入公式计算。十、思考题十、思考题:SODSOD活活性性测测定定中中为为什什么么设设照照光光和和暗暗中中两两
10、个对照管。个对照管。2.2.影影响响本本实实验验准准确确性性的的主主要要因因素素是是什什么？应如何克服？么？应如何克服？1.1.下次实验：下次实验：改良半叶法测定植物光合速率改良半叶法测定植物光合速率2.请请按按植植物物生生理理生生化化实实验验B补补充充材材料料认认真书写预习报告！真书写预习报告！3.实实 验验 适适 宜宜 时时 间间：晴晴 天天 上上 午午 89点点 开开 始始。具具体体时时间间要要看看气气候候，如如果果本本周周日日晴晴天天，就就先先测测定定光光合合速速率率，“叶叶绿绿体体色色素素定定量量测测定定”可可以以调调到下周上。请转告今晚请假的同学。到下周上。请转告今晚请假的同学。柯柯通知：