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1、蛋白质工程蛋白质工程Protein engineering Protein engineering蛋白质工程是应用科学，蛋白质工程是应用科学，目的是获得目的是获得有用或有价有用或有价值的蛋白质。值的蛋白质。这是一个年轻的学科，这是一个年轻的学科，目前，蛋白质工程尚未有目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学学科基础上，融合了蛋白质生物
2、学、分子遗传学学科基础上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域蛋白质工程进展蛋白质工程进展蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。福什特（福什特（ForshtForsht）等在）等在19851985年间对酪氨酰年间对酪氨酰tRNAtRNA合成合成酶的分子改造工作。酶的分子改造工作。19871987年枯草杆菌蛋白酶改造活年枯草杆菌蛋白酶改造活力提高力提高1010倍。倍。佩里（佩里（PerryPerry）19841984年溶菌酶
3、分子改造使酶热稳定年溶菌酶分子改造使酶热稳定性提高。性提高。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。蛋白质工程的前景蛋白质工程的前景蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人的前景。的前景。例如，科学家通过对胰岛素的改造，已使例如，科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为
4、速效型药品。其成为速效型药品。生物材料科学家正积极探索将蛋白质工程生物材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面。应用于微电子方面。用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有极为广阔的发展前景。极为广阔的发展前景。实际应用实际应用提高蛋白质的稳定性提高蛋白质的稳定性 融合蛋白质融合蛋白质蛋白质活性的改变蛋白质活性的改变治疗酶的改造治疗酶的改造嵌合抗体和人缘化抗体嵌合抗体和人缘化抗体 蛋白质工程的研究策略蛋白质工程的研究策略蛋白质工程的基本途径蛋白质工程的基本途径蛋白质结构分析蛋白质结构分
5、析 结构、功能的设计和预测结构、功能的设计和预测创造和改造创造和改造 两个战略两个战略合理设计合理设计 蛋白质计算蛋白质计算机机设计。使用计算设计。使用计算机机的方的方法设计蛋白质是最具挑战性的法设计蛋白质是最具挑战性的工作工作。技技术术：定点突变定点突变定向进化。定向进化。蛋白质结构分析蛋白质结构分析 蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。之间关系的理论研究奠定基础。国外有许多
6、研究机构正在致力于研究蛋白质国外有许多研究机构正在致力于研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发开发 具有高度专一性的药用蛋白质。具有高度专一性的药用蛋白质。结构、功能的设计和预测结构、功能的设计和预测 根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，预测一定氨基酸序列肽链空间结据库里的数据，预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；可以根据特定的生物功能，设计构和生物功能；可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验直接
7、考察分析结构与功能之间的关系；等实验直接考察分析结构与功能之间的关系；通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。用以设计、预测蛋白质的结构和功能。计算机辅助蛋白质设计计算机辅助蛋白质设
8、计计算机辅助蛋白质设计（）是指在计算机辅助蛋白质设计（）是指在蛋白质工程中，应用计算机技术，通过对已蛋白质工程中，应用计算机技术，通过对已知的蛋白质顺序、分子构象、结构与功能关知的蛋白质顺序、分子构象、结构与功能关系等数据的分机处理，预测和评估蛋白质改系等数据的分机处理，预测和评估蛋白质改造中各种方案，做出最佳选择，具体地讲，造中各种方案，做出最佳选择，具体地讲，是蛋白质工程中蛋白质设计的软件的研究。是蛋白质工程中蛋白质设计的软件的研究。研究的内容也就是应用软件的开发，研究的内容也就是应用软件的开发，包括数据分析处理算法的研究，蛋白质设计包括数据分析处理算法的研究，蛋白质设计模拟模型的建立以及
9、计算机程序编写和软件模拟模型的建立以及计算机程序编写和软件可用性的研究可用性的研究Protein design Protein design is the design of new protein molecules from scratch,or the deliberate design of a new molecule by making calculated variations on a known structure.Protein design requires an understanding of the process by which proteins fold.by
10、 use of computer models,Protein design is also referred to as inverse folding.Hence,designing a new protein involves the identification of the sequences which have the chosen structure as free energy minimum.蛋白质创造和改造蛋白质创造和改造 蛋白质的改造，从物理、化学法到基因重组。蛋白质的改造，从物理、化学法到基因重组。物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处物理、化学法：对蛋白质进行变性、
11、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；构像等等；生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。生胶连等等。基因重组技术基因重组技术：如：如定位突变技术定位突变技术，盒式突变盒式突变，PCR技术技术定向进化定向进化Directed evolution 定向进化是一种用在蛋白质工
12、程定向进化是一种用在蛋白质工程中的方法中的方法利用定向进利用定向进得到得到在自然界中在自然界中未发现未发现发现蛋发现蛋白质或白质或RNARNA。定向进化定向进化实验步骤实验步骤多样化多样化，Diversification:Diversification:在此步骤中常用的在此步骤中常用的技术技术是是易错易错PCRPCR和和DNADNA改组。突变改组。突变库库选择选择，Selection:Selection:理想突变理想突变的扫描的扫描或选择。或选择。扩增，扩增，Amplification:Amplification:确定的突变复制确定的突变复制扩增扩增，了解了解DNADNA序列序列的的突变。突变
13、。这三个步骤称为一个这三个步骤称为一个“回合回合”定向进化。大多定向进化。大多数实验结果将执行一个以上的回合。上一轮的数实验结果将执行一个以上的回合。上一轮的结果结果供下供下轮创建一个新轮创建一个新库库。在实验结束，蛋白。在实验结束，蛋白质或质或RNARNA突变采用生化方法突变采用生化方法鉴定鉴定。定向进化定向进化与与自然进化自然进化自然进化自然进化自然进化自然进化是是环境压力下物种朝着适应生存环境压力下物种朝着适应生存 环境的方向发展环境的方向发展自然进化自然进化是是漫长时间里通过漫长时间里通过DNADNA复制发生突复制发生突变或通过重组，变或通过重组，自然进化自然进化是是产生了遗传多样性产
14、生了遗传多样性自然进化自然进化是是自发、非常缓慢、自然选择自发、非常缓慢、自然选择定向进化定向进化定向进化定向进化在实验室中模仿自然进化在实验室中模仿自然进化定向进化定向进化的关键步骤：突变、重组和筛选，的关键步骤：突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，定向进化定向进化有效改造蛋白质，使之适于人类有效改造蛋白质，使之适于人类的需要。的需要。定向进化与自然进化的差别定向进化与自然进化的差别定向进化的一般过程定向进化的一般过程酶定向进化的意义定向进化的意义酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的
15、，但是天然酶的许般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。多性质不适应工业生产的条件。选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。要。酶分子定向进化的历史酶分子定向进化的历史Sol Spiegelman在在20世纪世纪60年代利用年代利用RNA噬菌体噬菌体Q进行实验，是进行实验，是第一次在分子水平上第一次在分子水平上定向改造单一分子。定向改造单一分子。RNA噬菌体噬菌体Q定向进化的历史定向进化的历史
16、19811981年，年，B.G.HallB.G.Hall等定向改变等定向改变E.coliK12E.coliK12中中ebgebg酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。能力的酶。19931993年，年，ArnoldArnold研究组提出易错研究组提出易错PCRPCR的方法。的方法。19941994年，年，StemmerStemmer将将DNADNA重组方法引用到酶分子重组方法引用到酶分子的定向进化中。的定向进化中。19991999年，年，StemmerStemmer等把等把DNADNA改组延伸到族改组。改组延伸到族改组。定向进化的历史定向进化的
17、历史酶定向进化的过程酶定向进化通常分酶定向进化通常分3 3步进行：步进行：通过随机突变和通过随机突变和(或或)基因体外重组创造基基因体外重组创造基因多样性；因多样性；导入适当载体后构建突变文库；导入适当载体后构建突变文库；通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可通过灵敏的筛选方法，选择阳这个过程可通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。重复循环，直至得到预期性状性突变子。重复循环，直至得到预期性状的酶。的酶。多样性的产生多样性的产生定向进化的策略定向进化的策略n无性进化无性进化 易错易错PCRPCR、化学诱变剂介导的随机诱变、化学诱变剂介导的随机诱变、由致
18、突变菌株产生的随机突变由致突变菌株产生的随机突变n有性进化有性进化 DNADNA改组技术、随机引物体外重组法、交改组技术、随机引物体外重组法、交错延伸法错延伸法易错易错PCR(error-prone PCR)PCR(error-prone PCR)一种相对简单、快速廉价的随机突变方法一种相对简单、快速廉价的随机突变方法通过改变通过改变PCRPCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。基错配，从而导致目的基因的随机突变。关键是控制关键是控制DNADNA的突变频率。的突变频率。此法的不足之处：此法的不足之处：靶序列长度一般在靶序列长度一
19、般在0.5-1.0kb0.5-1.0kb，应用范围有限；，应用范围有限；中性突变较多；中性突变较多；较为耗时、费力较为耗时、费力；获得的获得的DNADNA序列中碱基的转换高于颠换。序列中碱基的转换高于颠换。此法突变具有一定的密码偏向性。此法突变具有一定的密码偏向性。易错易错PCRPCR连续易错连续易错PCRPCR(Sequential error-prone PCR)该方法是将一次该方法是将一次PCRPCR扩增得到的有益突变扩增得到的有益突变基因作为下一次基因作为下一次PCRPCR扩增的模板，连续扩增的模板，连续反复进行随机诱变，反复进行随机诱变，使得每一次获得的使得每一次获得的少量突变累积而
20、产少量突变累积而产生重要的有益突变。生重要的有益突变。DNADNA改组技术改组技术(DNA shuffling)(DNA shuffling)又称有性又称有性PCRPCR，指，指DNADNA分子的体外重组，是分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予表达产物核苷酸序列创造新基因，并赋予表达产物以新功能。以新功能。分子育种分子育种DNA改组原理改组原理；单个基因的单个基因的DNA改组改组从突变体基因库中分从突变体基因库中分离出的离出的DNADNA片段用脱片段用脱
21、氧核糖核酸酶氧核糖核酸酶I I随机随机切割得到的随机片段切割得到的随机片段经过不加引物的多次经过不加引物的多次PCRPCR循环循环在在PCRPCR循环过程中，随循环过程中，随机片段之间互为模板机片段之间互为模板和引物进行扩增，直和引物进行扩增，直到获得全长的基因，到获得全长的基因，这导致来自不同基因这导致来自不同基因片段之间的重组片段之间的重组基因家族改组技术基因家族改组技术(family shuffling)采用基因家族的改采用基因家族的改组效果明显高于单组效果明显高于单个基因的改组效果。个基因的改组效果。特点特点 改组基因的效率高改组基因的效率高 提高基因突变机率提高基因突变机率基因家族改
22、组基因家族改组随机引物体外重组法随机引物体外重组法(RPR)(RPR)交错延伸原理交错延伸原理DNADNA改组与常规定向进化的比较改组与常规定向进化的比较基因文库的构建基因文库的构建构建理想的基因文库要考虑的因素：构建理想的基因文库要考虑的因素：基因文库的质量基因文库的质量(1)(1)文库的代表性文库的代表性(2)(2)突变基因片段的序列完整性突变基因片段的序列完整性文库筛选可选择的方法文库筛选可选择的方法控制突变库的大小与特定的筛选容量相适控制突变库的大小与特定的筛选容量相适应应突变体基因的构建策略突变体基因的构建策略DNADNA随机酶切随机酶切，片段拼接片段拼接单链单链DNADNA随机拼接
23、（提高不同亲代基因的同随机拼接（提高不同亲代基因的同源片段重组形成嵌合体基因的效率）源片段重组形成嵌合体基因的效率）限制性酶切片段随机拼接（防止限制性酶切片段随机拼接（防止PCRPCR扩增产扩增产生相同的亲代基因）生相同的亲代基因）构建突变基因文库的载体系统构建突变基因文库的载体系统噬菌体载体系统基因文库噬菌体载体系统基因文库：构建中最早使用构建中最早使用插入片段的装载容量大，适合大片段克隆插入片段的装载容量大，适合大片段克隆构建出的基因文库质量高、代表性好构建出的基因文库质量高、代表性好适合长期保存适合长期保存主要缺点是构建成基因文库后，可采用的文主要缺点是构建成基因文库后，可采用的文库筛选
24、方法有限库筛选方法有限质粒载体系统质粒载体系统质粒载体系统质粒载体系统：优点优点体外操作简便，体外操作简便，载体本身的设计上有很大可塑性载体本身的设计上有很大可塑性能实现对基因文库的功能性筛选能实现对基因文库的功能性筛选缺点缺点插入片段的载体容量较小，含有长片段的重组克插入片段的载体容量较小，含有长片段的重组克隆在文库的群体扩增过程中容易丢失隆在文库的群体扩增过程中容易丢失转化效率普遍较低转化效率普遍较低不适合文库的长期保存不适合文库的长期保存文库的筛选建立有效的搜索文库的方法是影响定向进建立有效的搜索文库的方法是影响定向进化成功与否的关键化成功与否的关键采用的定向筛选方法必须灵敏，且应与目采
25、用的定向筛选方法必须灵敏，且应与目的性质相关的性质相关借助检测仪器易实现高通量筛选借助检测仪器易实现高通量筛选定向进化的筛选定向进化的筛选活体筛选法活体筛选法-基于表形观察的筛选基于表形观察的筛选 基于基因编码蛋白质的检测筛选表达文库基于基因编码蛋白质的检测筛选表达文库噬菌体显示法；噬菌体显示法；细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面）细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面）u筛选方法根据各个蛋白质的性质而设筛选方法根据各个蛋白质的性质而设，筛选方法筛选方法根据各个蛋白质的性质而设因此，不具有通用性。根据各个蛋白质的性质而设因此，不具有通用性。u突变体基因筛选能否成功的关键是将基因的表型突变体基因
26、筛选能否成功的关键是将基因的表型和能通过定量表征的筛选手段紧密联系。和能通过定量表征的筛选手段紧密联系。u为加快分离目的基因的过程，已建立起多种在基为加快分离目的基因的过程，已建立起多种在基因发现上具有因发现上具有“高通量高通量”性能的筛选方法。性能的筛选方法。高通量筛选技术高通量筛选技术突变微生物分离突变微生物分离 琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌通过琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。的出现等判断是否具有目的基因。微球细胞固定法与数字成像系统结合微球细胞固定法与数字成像系统结合，将
27、单将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。离和筛选。流式细胞计数法流式细胞计数法:细胞经荧光染色后，通过细胞经荧光染色后，通过 高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细 胞计数仪进行测定。胞计数仪进行测定。酶活力检测酶活力检测反应产物反应产物：显色显色pHpH指示剂显色指示剂显色pHpH指示剂显指示剂显色色，分光光度计和荧光酶标仪分光光度计和荧光酶标仪通过检测底物消耗或产物生成进行终点检通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测测：GC/HPLCGC/HPLC，使用较短的柱子以缩短分析，使用较短的柱子以缩短分析时
28、间时间同位素标记底物同位素标记底物：质谱质谱热力学红外检测热力学红外检测噬菌体显示筛选模式噬菌体显示筛选模式pHpH指示剂显色高通量筛选指示剂显色高通量筛选产物显色筛选产物显色筛选荧光产物筛选荧光产物筛选基于比色法和荧光检测的高通量筛选蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例胰蛋白酶胰蛋白酶金属硫蛋白金属硫蛋白人白细胞介素人白细胞介素-2-2组织纤溶酶原激活因子组织纤溶酶原激活因子枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶组织纤维蛋白溶酶原激活因子组织纤维蛋白溶酶原激活因子组织纤维蛋白溶酶原激活因子组织纤维蛋白溶酶原激活因子(t-PA)(t-PA)是一种是一种血浆糖蛋白，其功能是将单钥活性形式的血血浆糖蛋白
29、，其功能是将单钥活性形式的血浅纤溶酶原（浅纤溶酶原（plg)plg)激活，转变成纤溶酶。溶激活，转变成纤溶酶。溶解血栓，目前进行解血栓，目前进行t-PAt-PA蛋白质工程的研究主蛋白质工程的研究主要是构建长半衰期的要是构建长半衰期的t-PA t-PA 突变体。通过改变突变体。通过改变t-PA t-PA 分子中的某些糖基化的氨基酸而减少或分子中的某些糖基化的氨基酸而减少或避免糖基化，可减缓在血浆中被清除的速率，避免糖基化，可减缓在血浆中被清除的速率，从而获得具有更长半衰期的治疗药剂。从而获得具有更长半衰期的治疗药剂。枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶是重要的工业用酶。朱榴琴等枯草杆菌蛋白酶是重要的工业用酶。朱榴琴等人采用定点突变和随机突变的方法，对枯草杆人采用定点突变和随机突变的方法，对枯草杆菌碱性蛋白酶菌碱性蛋白酶E E基因进行改造，突变后的基因基因进行改造，突变后的基因插入大肠杆菌插入大肠杆菌枯草杆菌穿梭质粒中，在碱性枯草杆菌穿梭质粒中，在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌DBl04 DBl04 中进行中进行表达，得到突变的碱性蛋白酶，各种突变酶具表达，得到突变的碱性蛋白酶，各种突变酶具有抗氧化和增加稳定性的特点，具备了工业用有抗氧化和增加稳定性的特点，具备了工业用酶的条件。酶的条件。