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1、第三节第三节酶的分离方法酶的分离方法一、沉淀分离二、离心分离三、过滤与膜分离四、层析分离五、电泳分离六、萃取分离沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解溶解度降低度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。程。原理：根据不同物质在溶剂中的原理：根据不同物质在溶剂中的溶解度不同溶解度不同而达到分离的目而达到分离的目的。的。不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间间亲和力的差异亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶
2、剂的而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构化学性质及结构有关。有关。一、沉淀分离一、沉淀分离沉淀分离方法沉淀分离方法适用分子适用分子盐盐析沉淀法析沉淀法多用于各种蛋白多用于各种蛋白质质和和酶酶的分离的分离纯纯化化等等电电点沉淀法点沉淀法用于氨基酸、蛋白用于氨基酸、蛋白质质及其他两性物及其他两性物质质的沉淀，的沉淀，单单独独应应用用较较少，常与其它方法少，常与其它方法结结合使用合使用有机溶有机溶剂剂沉淀法沉淀法 多用于蛋白多用于蛋白质质和和酶酶、多糖、核酸以及生物小分子、多糖、核酸以及生物小分子的分离的分离纯纯化化复合沉淀法复合沉淀法发发展展较较快的新方法快的新方法选择选择性性变变性
3、沉淀性沉淀法法多用于除去某些不耐多用于除去某些不耐热热的和在一定的和在一定pHpH值值下易下易变变性性的的杂杂蛋白蛋白常用的几种沉淀分离方法常用的几种沉淀分离方法1、盐析沉淀法、盐析沉淀法在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为高而降低，这称为盐析现象盐析现象。优点：优点：成本低，不需要特别昂贵的设备成本低，不需要特别昂贵的设备操作简单、安全操作简单、安全对许多生物活性物质具有稳定作用对许多生物活性物质具有稳定作用（1）基本原理）基本原理 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸
4、铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用以硫酸铵最为常用。（2）中性盐的选择）中性盐的选择溶解度大溶解度大：硫酸铵在：硫酸铵在0时仍时仍 有有70.6%（质量分数）的溶解（质量分数）的溶解度，远远高于其它盐类。度，远远高于其它盐类。盐类盐类0 20 80 100 硫酸铵硫酸铵70.675.495.3103硫酸钠硫酸钠4.918.943.342.2硫酸二氢钠硫酸二氢钠1.67.893.8101几种盐在不同温度下的溶解度（几种盐在不同温度下的溶解度（g/100ml水）水）分离效果好分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可能：
5、有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可能除去除去75%的杂蛋白，纯度提高了的杂蛋白，纯度提高了4倍。倍。不易引起变性，有稳定酶的作用不易引起变性，有稳定酶的作用：有些酶用：有些酶用2-3mol/L的硫酸的硫酸铵保存可达数年之久。铵保存可达数年之久。价格便宜，废液不污染环境价格便宜，废液不污染环境（3）盐析的操作方法）盐析的操作方法最常用的是固体硫酸铵加入法。最常用的是固体硫酸铵加入法。研磨硫酸铵成细粉研磨硫酸铵成细粉边搅拌边缓慢均匀少量多次加入边搅拌边缓慢均匀少量多次加入冰浴冰浴离心离心过滤过滤加盐速度尽量慢，加盐速度尽量慢，避免局部硫酸铵避免局部硫酸铵浓度过大而造成浓度过大而造成蛋白质变性蛋
6、白质变性低浓度低浓度高浓度高浓度（4）盐析的影响因素）盐析的影响因素蛋白质浓度蛋白质浓度：2.5%-3.0%（质量分数）较适中，（质量分数）较适中，相当于相当于25-30 mg/mlpH值值：常选在该酶的等电点附近：常选在该酶的等电点附近温度温度：对温度敏感的酶，要求在：对温度敏感的酶，要求在0-4下操作，以下操作，以避免活力丧失避免活力丧失盐析时注意事项：盐析时注意事项：酶不同，结构不同，所需盐浓度不同。另外，酶的来源，杂酶不同，结构不同，所需盐浓度不同。另外，酶的来源，杂质等也对其有影响。质等也对其有影响。盐析后的酶含大量盐分，要进行脱盐处理盐析后的酶含大量盐分，要进行脱盐处理2、有机溶剂
7、沉淀法、有机溶剂沉淀法原理：降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削原理：降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。溶解度降低而沉淀。优点：优点：分辩能力比盐析高分辩能力比盐析高沉淀不用脱盐沉淀不用脱盐缺点：缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。下进行。（1）有机溶剂的选择和浓度计算）有机溶剂的选择和浓度计算原则：能与水互溶原则：能与水互溶常用试剂：乙醇、甲醇和丙酮（糖、核酸常用试剂：
8、乙醇、甲醇和丙酮（糖、核酸等常用的是乙醇）等常用的是乙醇）计算公式：计算公式：V=V0(S2-S1)/(100-S2)需要加需要加入量入量原溶液原溶液体积体积原溶液中原溶液中有机溶剂有机溶剂的体积的体积有机溶剂终有机溶剂终体积体积加入有机溶剂的体积分数加入有机溶剂的体积分数（纯溶液体积分数为（纯溶液体积分数为100%）（2）有机溶剂沉淀的影响因素）有机溶剂沉淀的影响因素温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。溶解度随温度降低而下降。注意！大多数酶在有机溶剂中对温度特别敏感，温度注意！大多数酶在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高
9、就会引起变性！稍高就会引起变性！样品浓度：通常使用样品浓度：通常使用5-20mg/ml的蛋白质初浓度的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的分离效果。为宜，可以得到较好的分离效果。pH值：选在等电点附件，提高分辩能力值：选在等电点附件，提高分辩能力离子强度：不超过离子强度：不超过5%为宜。乙醇溶液不超过原溶为宜。乙醇溶液不超过原溶液液2倍体积为宜。倍体积为宜。离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同分分子大小、密度子大小、密度的物质分离的技术。的物质分离的技术。二、离心分离二、离心分离1、基本原理、基本原理F=m2r 当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物
10、体就受当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。心力越大。2、相对离心力、相对离心力RCF RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数就是实际离心力转化为重力加速度的倍数 RCF=FRCF=F离心力离心力/F/F重力重力=m=m2 2r/mg=r/mg=2 2r/g r/g g g为重力加速度（为重力加速度（2 2)RCF=1.11910 RCF=1.11910-5-5 (r/min)(r/min)2 2 rr3、离心机的主要构造和类型、离心机的主要构造和类型（1）制备性离心机分为三类
11、：）制备性离心机分为三类：A、普通离心机、普通离心机最大转速最大转速6000r/min左右，最大相对离心力近左右，最大相对离心力近6000g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，其转速不能严格控制，通常不带冷液沉降分离，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质。粒物质。Eg：红细胞、酵母细胞等。：红细胞、酵母细胞等。B、高速冷冻离心机、高速冷冻离心机最大转速为最大转速为20000-25000r/min，最大相对离心力为，最大相对离心力为89000g，最大容量可通到，最大
12、容量可通到3L，分离形式也，分离形式也是固液沉降分离。是固液沉降分离。一般有制冷系统，离心室温一般有制冷系统，离心室温度可调节和维持在度可调节和维持在0-4，转，转速、温度和时间都可严格控速、温度和时间都可严格控制。制。C、超速离心机、超速离心机转速可达转速可达50000-80000r/min，相对离心力最大可达相对离心力最大可达510000g名称名称最大转速最大转速（r/min）相对离心力相对离心力（RCF）特点特点常速离心机常速离心机6000 6000 g主要用于细胞、细胞碎片主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等分离。也用于酶的结晶等较大
13、颗粒的分离较大颗粒的分离。高速离心机高速离心机（12.5）10411041105 g主要用于沉淀、细胞碎片主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。和细胞器等的分离。超速离心机超速离心机(2.512)1045105 g主要用于主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的降系数和相对分子质量的测定等。测定等。（2）转子）转子转子类型转子类型固定角式转子固定角式转子(fixed-angle rotor)(fixed-angle rotor)水平转子水平转子(swing
14、-out rotor)(swing-out rotor)垂直转子垂直转子(vertical rotor)(vertical rotor)带状转子带状转子(zonal rotor)(zonal rotor)连续转子连续转子(continuous rotor)(continuous rotor)转子的材质转子的材质铝质：较轻铝质：较轻,耐受强度较弱耐受强度较弱,适合在较低的转速下使用适合在较低的转速下使用;不锈钢：耐受强度最好不锈钢：耐受强度最好,但材质本身太重；但材质本身太重；钛合金：耐受强度不错钛合金：耐受强度不错,重量也比不锈钢轻。重量也比不锈钢轻。A A、固定角式转子、固定角式转子 离心管
15、在离心机中放置的位置与旋转轴心形离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度成一个固定的角度,角度变化在角度变化在14-4014-40之间。之间。常见的角度常见的角度 2020 28 28 34 34 40 40 角式转子的特点角式转子的特点重心低重心低,转速可较高转速可较高样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径“管壁效应管壁效应”：有一定的角度：有一定的角度,在离心过程中撞到离在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。使最后在管底聚成的沉淀较
16、紧密。设设设设40000rpm40000rpm40000rpm40000rpm时时时时R1R1R1R1最小、最小、最小、最小、R2R2R2R2平均、平均、平均、平均、R3R3R3R3最大、最大、最大、最大、RCFRCFRCFRCF值分别值分别值分别值分别67,910g 67,910g 67,910g 67,910g 105,400g105,400g105,400g105,400g144,700g144,700g144,700g144,700gR1R1R2R2R3R3 在离心管的不同部位距旋在离心管的不同部位距旋转中心轴的距离也不同转中心轴的距离也不同,那那么在一定的转速下其么在一定的转速下其R
17、CF值也各不相同值也各不相同B B、水平转子、水平转子 （1 1）转子静止时）转子静止时,处在转子中的离心管中处在转子中的离心管中 心线与旋转轴平行心线与旋转轴平行,（2 2）转子旋转加速时）转子旋转加速时,离心管中心线由离心管中心线由 行位置逐渐过渡到垂直位置行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋即与旋 转轴成转轴成9090角角,（3 3）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本 一致有少量的一致有少量的“管壁效应管壁效应”水平转子的特点水平转子的特点转子的重心位置较高转子的重心位置较高样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径对于多种成分样
18、品分离特别有效对于多种成分样品分离特别有效常用于速率区带离心和等密度离心常用于速率区带离心和等密度离心3、离心方法、离心方法（1）差速沉降离心法）差速沉降离心法分离两种以上大小，密度不同的颗粒。分离两种以上大小，密度不同的颗粒。操作方法：操作方法：分离较大颗粒分离较大颗粒 分离较小颗粒分离较小颗粒适用范围：大小、密度相差较大的颗粒适用范围：大小、密度相差较大的颗粒优点：操作简单、方便优点：操作简单、方便缺点：分离效果差，沉淀中有杂质，沉淀后颗粒在缺点：分离效果差，沉淀中有杂质，沉淀后颗粒在底部易受挤压底部易受挤压上清加大转速和分离时间上清加大转速和分离时间 例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份
19、例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份 已破碎的细胞已破碎的细胞 500g,10500g,10分钟分钟 沉淀沉淀 上清液上清液 (细胞核）细胞核）10,000g,1010,000g,10分钟分钟 沉淀沉淀 上清液上清液 (细胞膜碎片细胞膜碎片,线粒体线粒体,)100,000g,3,)100,000g,3小时小时 溶酶体溶酶体 沉淀沉淀 上清液上清液 (核糖核蛋白体）核糖核蛋白体）(可溶性成份可溶性成份)（2）差速区带离心法（密度梯度离心）差速区带离心法（密度梯度离心）样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数不同样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数不同的颗粒相互分离的方法的颗粒相互分离的方法介
20、质：梯度介质形成梯度范围，不与样品反应，不介质：梯度介质形成梯度范围，不与样品反应，不使样品凝集、变性或失活。使样品凝集、变性或失活。常用：蔗糖常用：蔗糖浓度：浓度：5%-60%；密度：；密度：33操作方法：操作方法：加样加样离心离心收集收集小心放在梯度小心放在梯度溶液表面溶液表面不同颗粒形成不同颗粒形成若干条带若干条带虹吸或切割离心虹吸或切割离心管等方法管等方法（3）等密度离心）等密度离心分离密度不同的颗粒，在离心力作用下上浮或下沉。分离密度不同的颗粒，在离心力作用下上浮或下沉。常用介质：铯盐。如常用介质：铯盐。如CsCl、Cs2SO4等等操作方法：操作方法：混匀样品与介质混匀样品与介质离心离心分离分离4、离心机操作注意事项、离心机操作注意事项必须事先在天平上精密的平衡离心管和其内容物。必须事先在天平上精密的平衡离心管和其内容物。依据不同离心液体选择不同离心管，每次检查转依据不同离心液体选择不同离心管，每次检查转头头低于室温离心时，要先将转头预冷低于室温离心时，要先将转头预冷离心过程中不得随意离开离心过程中不得随意离开了解转头最高离心转速和使用积累限时。了解转头最高离心转速和使用积累限时。