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1、第一章 发酵的流程及菌种扩大培养第一节 发酵的特点及流程一、发酵的特点一、发酵的特点发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主要特点如下：1、发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。2、发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。3、发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单的代谢产物。4、由于生物体本身所具有的反应机制，能够
2、专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。5、发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。6、微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。7、工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，可以取得显著的经济效益。基于以上特点，工业发酵日益引起人们重
3、视。和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌来进行反应；反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。二、发酵过程的组成部分二、发酵过程的组成部分1 1、发酵过程的组成、发酵过程的组成除某些转化过程外，典型的发酵过程可以划分成六个基本组成部分：（1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定；（2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；（3）培养有活性、适量的纯种，接种入生产容器中；（4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵
4、罐中生长；（5）产物萃取和精制；（6）过程中排出的废弃物的处理。六个部分之间的关系如图所示。在建立发酵过程以前，首先要分离出产生菌，并改良菌种，使所产生的产物符合工业要求。3、发酵生产的条件（1）某种适宜的微生物（2）保证或控制微生物进行代谢的各种条件（培养基组成，温度，溶氧pH等）（3）进行微生物发酵的设备（4）提取菌体或代谢产物，精制成产品的方法和设备第二节第二节 生产菌种的扩大培养生产菌种的扩大培养 发酵罐容积几百立方米。生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；营养、温度、需氧
5、等条件要求均有所不同。种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。种种子子扩扩大大培培养养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；（2）生理性状稳定；（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染；（5）保持
6、稳定的生产能力。在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段：（1）实验室种子制备阶段（2）生产车间种子制备阶段一、实验室种子的制备一、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可用液体培养法。（一）孢子的制备1、细菌的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富。培养温度一般为37。细菌菌体培养时间12d，产芽孢的细菌培养510d。2、霉菌的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的
7、温度一般为25-28。培养时间一般为414d。3、放线菌的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和无机盐等。培养温度一般为28。培养时间5-14d。（二）液体种子制备1、好氧培养对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下：试管三角瓶摇床种子罐 2、厌氧培养酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）其种子的制备过程如下：试管三角瓶卡式罐种子罐例如例如:生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培
8、养基配制：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g葡萄糖和20g琼脂于1L水中）的斜面上，于4冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培养2-3d。再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培养2d.移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20培养3-5d即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利与酵母菌的增殖。二、生产车间种子制备二、生产车间种子制备 种子罐的培养基因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用
9、的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，需氧菌，还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布。1、种子罐的作用使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。2、种子罐级数的确定 种种子子罐罐级级数数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；（2）所采用发酵罐的容积。比如：细菌细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27,40h孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（27，10-24h，菌体迅速繁殖，粗壮
10、菌丝体）发酵罐放线菌放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 3、确定种子罐级数需注意的问题（1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会（2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会（3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。第三节第三节 种子质量的控制种子质量的控制一一、影响种子质量的因素及控制、影响种子质量的因素及控制影响种子质量的因素通常有：培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等。1、培养基种子质量
11、不稳定的主要原因是原材料质量波动。例如：在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响不同。原材料质量的波动，也会影响孢子质量。如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。解决措施解决措施：（1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；（2）严格控制灭菌后培养基的
12、质量；（3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；（4）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。2、培养条件（1）温度 如土霉素生产菌种在高于37培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般要严格控制孢子子斜面的培养温度。（2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子数量和质量有较大影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子制备时发现：气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由
13、于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。表2-1不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响相对湿度（%）斜面外观活孢子计数（亿/支）16.51925364045上部稀薄下部稠略黄上部薄中部均匀发白一片白，孢子丰富，稍皱1.22.35.73、培养时间和冷藏时间（1）培养时间一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。解决措施解决措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。（2）冷藏时间斜面冷藏对孢子质量影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4d左右即于4冰箱保存，发现冷藏
14、7-8d菌体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发现自溶。冷藏时间对孢子生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6冷藏两个月后发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。4、接种量 接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。也影响到菌种的适应期。二、影响种子质量的因素及控制生产过程中影响种子质量的因素通常有：孢子的质量、培养基、培养条件、种龄、接种量。1、培养基种子培养基要满足以下要求：（1）营养成分适合种子培养的需要（2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；（3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用；（4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要
15、高（5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近。2、培养条件（1）温度（2）通气量在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。3、种龄种种龄龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种
16、工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好（见下图）。4、接种量接种量接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%三、种子质量的控制措施三、种子质量的控制措施种子质量
17、的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。因此在生产过程中通常进行以下两项检查。（1）菌种稳定性的检查（2）无（杂菌）检查 四、种子质量标准四、种子质量标准1、细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。2、生化指标种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。3、产物生成量在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生
18、成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。4、酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。五、种子异常分析五、种子异常分析 菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团菌丝粘壁 感染噬菌体第四节第四节 实例实例一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵罐1、斜面菌种的培养菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。(1)斜面培养基组成葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.02.5%，（传代和保藏
19、斜面不加葡萄糖）。(2)培养条件3334，培养1824h。2、一级种子培养一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。(1)培养基组成葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.1%，玉米浆2.53.5%(按质增减)，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，。(2)培养条件用1000mL三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程、频率96次/min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度3334。(3)一级种子质量要求种龄：12h，pH值：光密度：净增OD值以上残糖：以下无菌检查：(-)噬菌体检查：(-)镜检：菌体生长均匀、
20、粗壮，排列整齐革兰氏阳性反应。3、二级种子培养为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。(1)培养基组成培养基组成（%）T6-13B9T738AS1.299水解糖玉米浆磷酸氢二钾硫酸镁尿素Fe+（ppm）Mn+（ppm）pH2.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.20.050.5227.02.52.50.10.040.5226.5-6.8(2)培养条件接种量：培养温度：3234培养时间：78h通风量：5
21、0L种子罐搅拌转速340rmin；250L种子罐搅拌转速300rmin500L种子罐搅拌转速230rmin(3)二级种子的质量要求种龄：78hpH：左右OD值净增左右无菌检查(-)噬菌体检查(-)二、啤酒酵母的扩大培养二、啤酒酵母的扩大培养一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。1、实验室扩大培养三、三、生产发酵罐的无菌接种生产发酵罐的无菌接种生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐；从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。（1）从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种通常有两种方式由于微生物传代过程中不断产生变异，
22、即遗由于微生物传代过程中不断产生变异，即遗传变异是绝对的，而稳定是相对的。菌株的优良传变异是绝对的，而稳定是相对的。菌株的优良性状不可能永久保持下去，即发生衰退（或退化）性状不可能永久保持下去，即发生衰退（或退化）。这就需要通过创造适宜的环境来限制退化速度，。这就需要通过创造适宜的环境来限制退化速度，并且要掌握如何让退化的菌种恢复其原来的优良并且要掌握如何让退化的菌种恢复其原来的优良性状（复壮）的方法。性状（复壮）的方法。第四节第四节 菌种的衰退、复壮及保藏菌种的衰退、复壮及保藏u衰退（退化）衰退（退化）：由于菌种的自发突变使其由于菌种的自发突变使其典型性状，特别是产量性状发典型性状，特别是产
23、量性状发生负变的现象。生负变的现象。一、菌种的衰退一、菌种的衰退u引起菌种退化变异的因素：引起菌种退化变异的因素：v遗传基因型的分离遗传基因型的分离v丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复杂性，为群体繁殖，往往出现物质基础有多样性的复杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离，这是数量遗传的自体调节现象。遗传基因型的分离，这是数量遗传的自体调节现象。v自发变异的产生：自发变异的产生：负向变异为多数，结果：目的代谢负向变异为多数，结果：目的代谢产物产量下降，生长逐步变弱变慢，孢子形成能力低产物产量下降，生长逐步变弱变慢，孢
24、子形成能力低下等。下等。v原因原因可能有：长期保藏；频繁传代（例：斜面保藏；可能有：长期保藏；频繁传代（例：斜面保藏；发酵厂种子制备）；菌体在代谢过程中产生具有诱变发酵厂种子制备）；菌体在代谢过程中产生具有诱变作用的物质；存在增变作用的物质；存在增变v人工诱变导致的退化变异人工诱变导致的退化变异一、一、菌种的衰退菌种的衰退u衰退的防止：衰退的防止：v控制传代次数：不超过控制传代次数：不超过7 7代，易变异的不过代，易变异的不过5 5代代v砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3 3次，以防次，以防污染。污染。v选择良好的保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性
25、及选择良好的保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状原有典型性状v良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件。（保藏培良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件。（保藏培养基、活化培养基）养基、活化培养基）v采用不同类型的细胞进行接种采用不同类型的细胞进行接种v产孢子霉菌产孢子霉菌v细菌细菌一、菌种的衰退一、菌种的衰退v复壮复壮：广义广义是指在菌种的生产性状尚未衰退前，就经常有是指在菌种的生产性状尚未衰退前，就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定，从而使菌种的生意识的进行纯种分离和生产性能的测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一种措施。产性能逐步提高的一种措施。狭义狭义指菌种已经发生衰退
26、后，再通过纯种分离和指菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，性能测定的办法从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有典型性状的一种措施。以达到保持该菌种原有典型性状的一种措施。二、菌种的复壮二、菌种的复壮 复壮的方法通常有两种 纯种分离 淘汰已衰退的个体二、菌种的复壮二、菌种的复壮v根本目的根本目的是保持原有典型形状，防止退化、死亡是保持原有典型形状，防止退化、死亡及杂菌污染及杂菌污染v途径途径：挑取其休眠体（分生孢子、芽孢），在其：挑取其休眠体（分生孢子、芽孢），在其休眠后停止生长的条件下保藏。即缺乏营养、缺休眠后停止生长的条件下保藏
27、。即缺乏营养、缺水、缺氧、低温等。水、缺氧、低温等。v重要因素重要因素：低温：低温v要求不损伤要求不损伤cellcell，缓慢冷冻易使，缓慢冷冻易使cell死亡，快速不死亡，快速不易死亡。易死亡。三、菌种保藏三、菌种保藏v适于适于98%98%以上各类别的微生物，但不适于不产孢子以上各类别的微生物，但不适于不产孢子的丝状真菌的菌丝体的丝状真菌的菌丝体v原理原理:在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止，为防止冷冻和水燥，使微生物的生长和酶活动停止，为防止冷冻和水分升华中对细胞的损害，采用保护剂代替干燥中丢失分升华中对细胞的
28、损害，采用保护剂代替干燥中丢失的结合水而稳定细胞的构型。防止细胞膜因冻结而破的结合水而稳定细胞的构型。防止细胞膜因冻结而破坏，还可以起支撑作用，使微生物疏松的固定在上面。坏，还可以起支撑作用，使微生物疏松的固定在上面。（一）冻干保藏（一）冻干保藏步骤：步骤：v安瓿管准备安瓿管准备v D=8mmD=8mm，H=100mmH=100mm的中性安瓿管，用的中性安瓿管，用2%HCL2%HCL浸泡浸泡2424小时小时自来水冲自来水冲净净蒸馏水洗蒸馏水洗1-21-2次次烘干烘干管口塞上棉塞管口塞上棉塞121121，3030分钟分钟v保护剂制备保护剂制备：v脱脂牛乳或血清、乳糖、葡萄糖等（不含抗生素），脱脂
29、牛乳或血清、乳糖、葡萄糖等（不含抗生素），蒸馏水配成蒸馏水配成17%-20%17%-20%的脱脂乳（在无菌的干燥三角瓶中）的脱脂乳（在无菌的干燥三角瓶中）121,5min or 108,15min 121,5min or 108,15min 杀菌（血清等用过滤杀菌（血清等用过滤除菌）除菌）（一）冻干保藏（一）冻干保藏v菌种准备及分装菌种准备及分装菌悬液的制备：菌悬液的制备：v斜面斜面（稳定期）（稳定期）v 孢子孢子（新鲜成熟）（新鲜成熟）每个斜面加每个斜面加2-3ml2-3ml灭菌保护剂灭菌保护剂用用接种环将菌苔刮起（若液体培养，则应离心收集菌体，接种环将菌苔刮起（若液体培养，则应离心收集菌体
30、，并经灭菌生理盐水洗涤，收集的菌体用保护剂制成菌并经灭菌生理盐水洗涤，收集的菌体用保护剂制成菌悬液）制成悬液）制成菌悬液菌悬液（10109 9-10-101010CFCFU U/mL/mL）用灭菌的滴管用灭菌的滴管将菌悬液滴加至将菌悬液滴加至安瓿管安瓿管底部，装量一般为球体的底部，装量一般为球体的2/32/3左左右位置（视干燥剂性能而定）右位置（视干燥剂性能而定）管口塞好管口塞好灭菌棉灭菌棉（一）冻干保藏（一）冻干保藏v预冻：预冻：-70-70至全部冻结至全部冻结v冷冻干燥：冷冻干燥：v冷冻干燥器密封冷冻干燥器密封开启降温至开启降温至-50-50开真空泵开真空泵冷干块或松散片状（冷干块或松散片
31、状（1%-3%1%-3%水分）水分）停机，放气停机，放气（传感器）（传感器）v取出，用酒精喷灯烧焙密封，低温保藏（取出，用酒精喷灯烧焙密封，低温保藏（44或或-18-18）（一）冻干保藏（一）冻干保藏冻干菌种冻干菌种冻干管的启用：冻干管的启用：冻干管的启用：冻干管的启用：取出安瓿管取出安瓿管取出安瓿管取出安瓿管酒精表面消毒酒精表面消毒酒精表面消毒酒精表面消毒近顶部在酒精灯火焰上灼烧近顶部在酒精灯火焰上灼烧近顶部在酒精灯火焰上灼烧近顶部在酒精灯火焰上灼烧迅速滴上冷无菌水迅速滴上冷无菌水迅速滴上冷无菌水迅速滴上冷无菌水管破裂（敲或掰）管破裂（敲或掰）管破裂（敲或掰）管破裂（敲或掰）加入加入加入加入
32、0.3-0.5ml0.3-0.5ml液体培养基溶解冻干菌块成悬液液体培养基溶解冻干菌块成悬液液体培养基溶解冻干菌块成悬液液体培养基溶解冻干菌块成悬液用无菌滴管或接种环移至液体或斜面上进行培养用无菌滴管或接种环移至液体或斜面上进行培养用无菌滴管或接种环移至液体或斜面上进行培养用无菌滴管或接种环移至液体或斜面上进行培养v斜面孢子，液态孢子，斜面种子斜面孢子，液态孢子，斜面种子44保藏保藏v一般只宜一般只宜1-21-2个月（水分浓度较高）个月（水分浓度较高）v注意：不宜用于生产菌种保藏，也不适于注意：不宜用于生产菌种保藏，也不适于名贵菌种保藏。名贵菌种保藏。（二）低温保藏法（二）低温保藏法：v传统方
33、法：少数冷冻保存易死亡的菌种用此法传统方法：少数冷冻保存易死亡的菌种用此法v步骤与方法步骤与方法：v斜面菌种斜面菌种低温干燥处低温干燥处每每3-63-6个月移植个月移植v穿刺培养：含穿刺培养：含0.6%-0.8%0.6%-0.8%琼脂培养基装试管灭菌琼脂培养基装试管灭菌用用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心适温培养适温培养长好后低温保存长好后低温保存v大肠杆菌此法可保藏两年以上，不发生明显变异。大肠杆菌此法可保藏两年以上，不发生明显变异。v 缺陷：易发生遗传变异（连续传代丢失或减弱缺陷：易发生遗传变异（连续传代丢失或减弱形状，也易污染杂菌）
34、。不宜用于贵重菌株或形状，也易污染杂菌）。不宜用于贵重菌株或生产优良菌株。生产优良菌株。（三）低温定期移植法（三）低温定期移植法：（四）石蜡油低温保藏（四）石蜡油低温保藏适适适适用用用用于于于于不不不不产产产产孢孢孢孢子子子子的的的的菌菌菌菌种种种种（如如如如：平平平平菇菇菇菇菌菌菌菌种种种种）不不不不适适适适用用用用于于于于利利利利用用用用石石石石蜡蜡蜡蜡的的的的石石石石油油油油微微微微生生生生物物物物斜斜斜斜面面面面菌菌菌菌种种种种（斜斜斜斜面面面面不不不不宜宜宜宜过过过过长长长长)石蜡油石蜡油三角瓶中，经三角瓶中，经121121，1-21-2小时小时140140-160-160烘箱中干热
35、处理烘箱中干热处理以去除灭菌时渗入的水分以去除灭菌时渗入的水分至清澈透明至清澈透明倒入斜面（不能出现气泡）倒入斜面（不能出现气泡）添加量已高出斜面添加量已高出斜面1cm1cm为宜为宜-4-4-4-4保藏保藏v方法：方法：v河砂河砂4040目筛目筛加入加入1%HCL1%HCL置置3030分钟分钟蒸馏水冲洗至蒸馏水冲洗至中性中性烘干黄土（地表烘干黄土（地表1 1尺以下，瘦）尺以下，瘦）晒干磨细，晒干磨细，过过120120目筛，砂：土目筛，砂：土=4=4：1 1（若土粗些，可（若土粗些，可3 3：2 2或或1 1：1 1）溶入小试管（溶入小试管（50*8050*80）装量）装量1cm1cm，塞棉塞，
36、塞棉塞121121，1 1小时或小时或170170，2 2小时小时制菌悬液（孢子制菌悬液（孢子液）液）每增加每增加悬液悬液真空干燥真空干燥3-43-4小时用小时用P P2 2O O5 5或或CaCOCaCO3 3作干燥剂作干燥剂保存与真空干燥状态下，保存与真空干燥状态下，44v适用于保藏产孢子的放线菌，霉菌及产芽孢的适用于保藏产孢子的放线菌，霉菌及产芽孢的细菌（孢子、芽孢）细菌（孢子、芽孢）（五）砂土管保藏（五）砂土管保藏 80%80%甘油高压蒸汽灭菌（甘油高压蒸汽灭菌（121121，30min30min，一小时），一小时）斜面菌种用无菌水制成高浓度（斜面菌种用无菌水制成高浓度（10108 8-10-101010/ml/ml）菌）菌悬液，液体菌种离心并用无菌生理盐水洗涤悬液，液体菌种离心并用无菌生理盐水洗涤各各取等体积入菌种管或离心管（甘油约取等体积入菌种管或离心管（甘油约40%40%），），-2020保存（冻存）保存（冻存）细菌（细菌（LABLAB）、酵母应用均较好）、酵母应用均较好。（六）甘油管保藏（六）甘油管保藏（七）液氮超低温保藏（七）液氮超低温保藏10%10%甘油或甘油或5-10%5-10%的二甲亚枫的二甲亚枫做保护剂做保护剂移入液氮移入液氮冻结每分钟下降每分钟下降每分钟下降每分钟下降1111