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1、第三章 细 菌 质 粒（Plasmid）质粒的定义 是一种细胞质遗传因子，是细菌细胞内独立于染色体外的一种复制子，它在细胞分裂时能衡定的传给子代细胞，并能给细胞带来表型效应，但它的消失并不影响细胞的生存。质粒质粒第一节 质粒的检测一消除法（一消除法（curing）间接推测间接推测 二直接观察法二直接观察法（三）电镜直接观察（一）氯化铯溴化乙锭（CsCLEB）密度梯度离 心（图3-1）（二）琼脂糖凝胶电脉三重新感染试验法三重新感染试验法柯赫法则柯赫法则 123412341234abc1.蛋白质蛋白质3.质粒质粒DNA2.染色体染色体DNA图3-1 CsCI密度梯度示意图第二节第二节 细菌质粒的种
2、类细菌质粒的种类 细菌质粒种类繁多,目前主要根据其表型效应命名并划分为不同的类型,目前在大肠杆菌中发现的质粒类型主要有三种:即性质粒性质粒、抗性质粒抗性质粒和产大肠杆菌素质粒产大肠杆菌素质粒。1性质粒性质粒：具有促进细胞结合的表型效应。2Col质粒质粒（又称大肠杆菌质粒）：可以产大肠杆菌素的大肠杆菌质粒。一细菌质粒种类的划分一细菌质粒种类的划分3抗性质粒抗性质粒：能对不同物质，其中包括抗生素、化学药物、重金属等物质表现出抗性的一大类质粒的统称。4降解质粒降解质粒：这一类质粒能利用许多不容易为一般细菌分解的物质作为碳源供细菌生长。目前只在假单胞杆菌中发现。5Ti质粒质粒（Tumor induci
3、ng），Ti质粒是一种寄生在根瘤农杆菌（Agradacterium tumefacxiens）中，并能感染植物（主要是双子叶）的茎形成寇瘿瘤的一种质粒。7共生固氮质粒共生固氮质粒：存在于不同根瘤菌中，并能相应的豆科植物进行共生固氮的一类质粒。6隐蔽质粒隐蔽质粒：目前还没有发现它表现出任何性状的质粒。A直接法：根据质粒分子量和质粒DNA的总量来测定B间接法：1）使质粒处于不复制状态下，测定开始出现不含质粒的细菌所经历的分裂次数；2数量数量：测定质粒的数量是以拷贝数来表示，拷贝数的测定一般有两种方法：1大小大小：一般分子量在1-10106d 的质粒，大于此分子量的为大质粒。二质粒的大小和数量二质粒
4、的大小和数量二质粒的大小和数量二质粒的大小和数量拷贝数拷贝数=质粒的质粒的DNA总量总量质粒分子量质粒分子量 三、质粒复制的类型三、质粒复制的类型严谨型（严谨型（strigent）质粒）质粒：它的复制除变自身的基因控制外，还要严格的受染色体的控制。松驰型（松驰型（relaxed）质粒）质粒：它的复制主要受自身基因的控制，受染色体控制影响极少。四质粒转移类型四质粒转移类型（一）质粒的转移与供受体细菌的关系（二）带动转移 2）利用质粒的某些表型效应来测定。五质粒的不亲和群（五质粒的不亲和群（五质粒的不亲和群（五质粒的不亲和群（incompatible groupincompatible group
5、）质粒产生不相溶性存在的两种假说：1两个质粒结构相同，复制能力相同，一个先进入细胞复制后产生阻遏物抑制了后一质粒的复制。2膜位点假说：两个质粒的复制位点相同，互相竞争同一位点而产生不相溶性 0102025102050 1000102001020Km,APAP,SmKm,SmABC繁殖代数双重抗性细菌（%）大肠杆菌质粒的不亲和性和亲和性现象和pSC101-AP的不亲和现象；和ColE1-SmSu的不亲和现象；C.pSC101-Km和ColE1-SmSu的亲和现象。Km:卡那霉素；Ap:氨苄西林；Sm:链霉素；Su:磺胺。第三节 细菌质粒的复制 以大肠杆菌的F质粒为例，证明严谨型质粒的复制既受寄主
6、染色体的控制又受质粒自身的控制（图3-2）二复合复制子的复制二复合复制子的复制 1质粒与染色体合并后的复合复制子质粒与染色体合并后的复合复制子 1）整合后，质粒随（受）染色体控制 2）整合后，染色体的复制受质粒控制一一严谨型质粒的复制特点严谨型质粒的复制特点F-lac.涂布Lac-300C培养影印影印300C培养EMB培养420C培养EMB培养300C红白Fts-lac+(质粒的复制呈敏感突变）质粒的复制呈敏感突变）将将Fts-lac引入一个非温度引入一个非温度敏感的宿主敏感的宿主丫啶消除丫啶消除Fts-lac质粒质粒Lac-Fts-lac+42 白（质粒本身性质）42 红（染色体结构红（染色
7、体结构控制了控制了F的复制）的复制）引进一个野生型的F-lac+Lac-F-lac+42 白（染色体控制）42 红（质粒本身的性质决定）红（质粒本身的性质决定）图3-22质粒与质粒合并后形成嵌合质粒的复制质粒与质粒合并后形成嵌合质粒的复制 1）当两种嵌合质粒的复制都不受抑制情况下，复合复制子受拷贝数多的质粒控制 PSC101和COLE1是大肠杆菌的两种质粒，它们的特征见表3-3。表3-3质质粒粒分子量分子量（道（道尔尔顿顿）每一每一细细胞胞中中质质粒数粒数转转移移性性标记标记复制条件复制条件PSC101PSC1015.8105.8106 66 6非非TCTCR R细细菌的蛋白菌的蛋白质质合合成
8、成COLE1COLE14.2104.2106 61818非非 细细菌的菌的DNADNA多聚多聚酶酶2)当它们整合后形成的嵌合质粒为PSC134，它们的复制特征见表3-4。表3-4宿主宿主细细菌和所菌和所带带的的质质粒粒复制开始的部复制开始的部位位COLE1 PSC101COLE1 PSC101相当于每相当于每一染色体一染色体的的质质粒数粒数宿主宿主细细胞的胞的四四环环素抗性素抗性(单单位位/毫升毫升)CR34POLA1CR34POLA1+(PSC134)(PSC134)36 036 016168080W3110POLA1W3110POLA1-(PSC134)(PSC134)0 140 146
9、62525CR34POLA1CR34POLA1+(PSC101)(PSC101)-5 52525C600POLA1C600POLA1+(COLE1,(COLE1,PSC101)PSC101)-18,518,53030三三三三.复合质粒的复制机制复合质粒的复制机制复合质粒的复制机制复合质粒的复制机制 对于复合质粒的复制机制,目前存在着两种假说模型:一种是正控制假说模型；另一种是负控制假说模型。对于正控制假说模型正控制假说模型又有两种解释：1膜位点的正控制模型：该模型认为质粒必须附着在细胞膜的某一特写部位才能开始进行复制，而且每一专一的膜位点控制着复制的拷贝数。2物质扩散的正控制模型：这种模型假定
10、为细胞内能产生一种可以扩散的物质，此物质促使DNA开始复制。负控制假设模型负控制假设模型认为：质粒复制的过程中，细胞产生一种专一的阻遏蛋白，它能抑制质粒进一步复制，只有当阻遏物稀释到一定的浓度（即消除了阻遏），质粒的复制才又开始，所以每一质粒总保持一定的拷贝数。第四节 质粒在遗传工程中的应用 一遗传工程的概念一遗传工程的概念狭义的遗传工程即通常称为基因工程。（一）（一）遗传工程遗传工程定义定义 是采用类似工程设计的方式，按照人们预先设计的蓝图，把我们所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下进行剪切，获得我们所需要的目的基因，然后把它和载体DNA连接起来，巧妙地输入到某一
11、受体细胞中去，使外源DNA在其中复制、扩增、转录、翻译，以至最后能表达，这就是基因工程的全部过程。（二）遗传工程与一般细胞发生的重组的区别 细胞内基因重组的特点细胞内基因重组的特点：1外源DNA需要整合致染色体上；2由于重组，所以受同源的限制，有同源性才能发生重组；3同源重组是在细胞内进行的；4基因产物少。遗传工程的特点遗传工程的特点：1遗传工程不需要在细胞内进行，而是在体外人工地进行重组，所以基因工程是分子水平的操作，细胞水平的表达；（三）基因工程的过程4从受体细胞群体中筛选出含有重组DNA分子的细胞，建立无性繁殖系。1获得目的的基因（直接从生物体中分离或人工合成）；2把目的基因和载体结合成
12、重组DNA分子（体外重组）；3把重组DNA分子引入到相应的受体中去（转化或传染）；2外源DNA不是整合到染色体上，而是结合在另一个小的复制子上（载体），由于载体能独立复制，所以重组不受同源的干扰，产物也能成倍增加（拷贝数多）。二、质粒在遗传工程中的运用二、质粒在遗传工程中的运用6安全性能要好（一般要求是非转移型的）（一）质粒作为遗传工程的载体必须符合以下条件：1要求在宿主的细胞内能独立复制，最好是松驰型的2要求有一定的选择性标记3要有单一的限制性核酸内切酶的酶切位点4分子量要尽可能的小5要利于外源基因的表达（二）载体的改造1利用限制酶把作为载体的质粒上某些不必要的片段（即不影响复制的前提下）尽量去掉质粒PBR322的改造过程如图3-4 4质粒安全性能的改造 2便于检出重组质粒，要求作载体的质粒必须带上某种标记，一般以抗药性标记为最好。3利于外源基因表达的改造三、遗传工程中的工具酶三、遗传工程中的工具酶1限制性核酸内切酶和修饰酶2连接酶3末端转移酶4单链核酸酶5反向转录酶