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1、第二章第二章 酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学在生物反应工程中的地位酶促反应动力学在生物反应工程中的地位生物反应动力学生物反应动力学生物反应器生物反应器生物反应过程的放大与缩小生物反应过程的放大与缩小酶促反应动力学酶促反应动力学微生物反应动力学微生物反应动力学废水生物处理反应动力学废水生物处理反应动力学生物反应工程的研究内容包括哪些？生物反应工程的研究内容包括哪些？酶促反应动力学的生物学基础酶促反应动力学的生物学基础酶的基本概念酶的基本概念什么是酶？什么是酶？酶是生物体为其自身代谢活动而产生的生物催化剂。“经典”酶学理论：酶蛋白质。部分RNA也具有生物催化能力，通常称之为“核酶”。1
2、982年，美国T.Cech等人发现四膜虫的RNA有催化活性，具有自身切接能力。核酶的数量少，多作用于核酸。2.1.1.1 酶的分类酶的分类根据国际酶学委员会的规定，按照酶进行催化反应的类型，可将酶分为6类：1.氧化还原酶（oxidoreductases）：羰基还原酶；2.转移酶（transferases）：氨基转移酶；3.水解酶（hydrolases）：腈水解酶；4.裂合酶（lyases）：丙酮酸脱羧酶；5.异构酶（isomerases）：葡萄糖异构酶；6.转接（或合成）酶（ligases)：T4 DNA转接酶。蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶？2.1.1.2 酶的功能酶的功能酶的催化共性：酶的催化共性
3、：a a、降低反应的活化能；、降低反应的活化能；b b、酶可改变反应速率；、酶可改变反应速率；c c、不改变反应的平衡常数。、不改变反应的平衡常数。H2O2的分解75.31KJ/mol8.37KJ/mol2.1.1.2 酶的功能酶的功能酶的生物催化特性：酶的生物催化特性：a a、有很强的专一性：、有很强的专一性：底物专一性、反应专一性、立体专一性等；底物专一性、反应专一性、立体专一性等；b b、有较高的催化效率：、有较高的催化效率：比非催化反应高比非催化反应高108-1020倍；倍；c c、酶的调节功能：、酶的调节功能：抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修
4、饰调节和变构调节等共价修饰调节和变构调节等酶的催化效率可用酶活表示。酶活的定义：国际酶学委员会规定，在一定条件下，1 min能催化1 umol底物转化为产物所需要的酶量为一个国际酶活单位（IU)。2.1.1.3 酶的稳定性酶的稳定性引起酶失活的原因：引起酶失活的原因：a a、酶活性中心特定氨基酸（或其它）残基、酶活性中心特定氨基酸（或其它）残基 被化学修饰；被化学修饰；b b、外部环境的影响；、外部环境的影响；c c、酶的高级结构变化；、酶的高级结构变化；d d、多肽链的断裂。、多肽链的断裂。2.1.1.3 酶的稳定性酶的稳定性稳定化方法稳定化方法稳定的原因稳定的原因低温低温（冷冻保存）（冷冻
5、保存）难以被化学物质或蛋白酶等破坏难以被化学物质或蛋白酶等破坏添加盐类添加盐类加入高浓度硫酸铵后，酶高级结构的稳定性增强加入高浓度硫酸铵后，酶高级结构的稳定性增强添加底物添加底物保护酶的活性中心保护酶的活性中心添加有机溶剂添加有机溶剂如加丙酮，但机制不清楚如加丙酮，但机制不清楚化学修饰化学修饰稳定酶的高级结构，保护酶的活性中心稳定酶的高级结构，保护酶的活性中心加入强变性剂加入强变性剂只要保留一级结构，仍可再生只要保留一级结构，仍可再生加入蛋白质加入蛋白质保护在稀薄状态下易发生变性失活的酶类保护在稀薄状态下易发生变性失活的酶类结晶化结晶化有利于高级结构的稳定有利于高级结构的稳定固定化固定化防止或
6、减少蛋白酶的作用防止或减少蛋白酶的作用保持酶稳定的方法保持酶稳定的方法 均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学z什么是均相反应？指酶与反应物系处于同一相（液相）的酶催化反应。葡萄糖脱氢酶葡萄糖葡萄糖酸水相水相酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础锁钥模型（Lock and Key Model）酶与底物的作用机理酶与底物的作用机理解释了酶的专一性；局限性：无法解释可逆反应。酶与底物的作用机理酶与底物的作用机理诱导契合模型（Induced-Fit Model）像手与手套的像手与手套的关系。关系。当底物接近酶当底物接近酶的活性中心并的活性中心并与之结合时，与之结合时，酶的构象能发酶的构象能发生改变，更适
7、生改变，更适合于底物的结合于底物的结合。合。影响酶促反应的因素影响酶促反应的因素浓度因素（酶浓度，底物浓度，产物浓度等）外部因素（温度，pH，压力，溶液的介电常数，离子强度等）内部因素（酶的结构等）反应速率及其测定反应速率及其测定若用单位时间内生成物浓度的增加来表示，则：反应速率反应速率：单位时间内反应物或生成物浓度的改变。设瞬时dt内反应物浓度的很小的改变为dS，则：酶促反应动力学分类酶促反应动力学分类-反应级数反应级数零级反应零级反应 反应速率与底物的浓度无关，称为零级反应。反应速率与底物的浓度无关，称为零级反应。（S-S-底物浓度，底物浓度，r rmaxmax-最大反应速率）最大反应速率
8、）酶促反应动力学分类酶促反应动力学分类-反应级数反应级数一级反应一级反应 反应速率与底物浓度的一次方成正比，称为一级反应。反应速率与底物浓度的一次方成正比，称为一级反应。即酶催化即酶催化ABAB的过程。的过程。（S-S-底物浓度，底物浓度，k1-一级反应速率常数）一级反应速率常数）酶促反应动力学分类酶促反应动力学分类-反应级数反应级数二级反应二级反应 反应速率与两个反应物的浓度成正比，称为二级反应。反应速率与两个反应物的浓度成正比，称为二级反应。该反应可以是两个相同的反应物反应生成产物（2S P）；也可以是两个不同的反应物反应生成产物（AB P）。（S-S-底物浓度；底物浓度；AA、B-B-底
9、物底物A A、B B的浓度；的浓度；k2-二级反应速率常数）二级反应速率常数）单底物酶促反应动力学单底物酶促反应动力学最简单的酶促反应：最简单的酶促反应：单底物不可逆酶促反应单底物不可逆酶促反应。k1k-1ESESEk2P反应机制：反应机制：反应动力学方程如何求取？1.Michaelis-Menten快速平衡学说2.Briggs-Haldane稳态学说反应动力学方程的推导反应动力学方程的推导快速平衡法的几点假设条件：快速平衡法的几点假设条件：1.1.底物浓度底物浓度SS远大于酶的浓度远大于酶的浓度EE，因此，因此ESES的形成不会降的形成不会降低底物浓度低底物浓度SS，底物浓度以初始浓度计算。
10、，底物浓度以初始浓度计算。2.2.不考虑不考虑P+EESP+EES这个可逆反应的存在。这个可逆反应的存在。3.3.ESES在反应开始后与在反应开始后与E E及及S S迅速达到动态平衡。迅速达到动态平衡。快速平衡学快速平衡学说k1k-1ESESEk2Pk1k-1ESESEk2快速平衡学快速平衡学说由假由假设2可得到可得到产物的合成速率物的合成速率为：(2)(1)P由假由假设3可得到：可得到：反应体系中反应体系中酶量守恒酶量守恒：(3)由前面的公式由前面的公式(2)得：得：代入公式代入公式(3),变换后得：变换后得：(4)(5)代入公式代入公式(1),变换后得：变换后得：式中：式中：rp,max=
11、k2E0:最大反应速率最大反应速率 如果酶的量发生改变，最大反应速率相应改变。如果酶的量发生改变，最大反应速率相应改变。KS=k-1/k1:解离常数解离常数，饱和常数，饱和常数 低低KS值值意味着酶与底物结合力意味着酶与底物结合力越强越强。(6)稳态学说稳态学说稳态学说的几点假设条件：稳态学说的几点假设条件：1.1.底物浓度底物浓度SS远大于酶的浓度远大于酶的浓度EE，因此，因此ESES的形成不会降的形成不会降低底物浓度低底物浓度SS，底物浓度以初始浓度计算。，底物浓度以初始浓度计算。2.2.在反应的初始阶段，产物浓度很低，在反应的初始阶段，产物浓度很低，P+EESP+EES这个可逆反应这个可
12、逆反应的速率极小，可以忽略不计。的速率极小，可以忽略不计。3.3.ESES的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变化。化。k1k-1ESESEk2PExperimental data demonstrated the concentration profiles.当反当反应系系统中中 ES的生成速率与分解速率相等的生成速率与分解速率相等时，ES浓度度保持不保持不变的状的状态称称为稳态。由于由于SE0，所以，所以SES,S-ESS根据根据稳态假假说，(7)(3)(8)(Km米氏常数米氏常数)(9)(10)式中：式中：对米氏方程的讨论：当SKm时
13、，属零级反应。当SKm时，。米氏常数Km的意义Km值代表反应速率达到rpmax/2时的底物浓度。Km是酶的一个特性常数，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。但底物种类、反应温度、pH和离子强度等因素会影响Km值。因此可以用Km值来鉴别酶。vrmax/2KmS快速平衡稳态假设假设 不考虑逆反应的存在。即：不考虑逆反应的存在。即：ES在反应开始后与在反应开始后与E及及S迅速达到动态平衡。迅速达到动态平衡。ES的生成速率与其解离的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随而速率相等，其浓度不随而变化。变化。底物浓度远高于酶的浓度。底物浓度远高于酶的浓度。SE 酶量守恒酶量守恒 产物生成速率产物生成
14、速率动力学方程动力学方程 与与 动力学参数的求解l对rmax和Km的确定的方法有：Lineweaver-Burk法；Hanes-Woolf法；Eadie-Hofstee法；积分法积分法 等。Linewever-Burk双倒数法将米氏方程式两侧取双倒数，得到下列方程式：以作图,得到一直线缺点：实验点过分集中在直线的左下方，影响Km和Vmax的准确测定。例例例例：在在在在、1515下下下下所所所所测测测测定定定定的的的的用用用用葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖淀淀淀淀粉粉粉粉酶酶酶酶水水水水解解解解麦麦麦麦芽芽芽芽糖糖糖糖的的的的反反反反应应应应初初初初速度速度速度速度V V0 0如表所示。求如表所示。求
15、如表所示。求如表所示。求这这这这一一一一酶酶酶酶促反促反促反促反应应应应的的的的动动动动力学参数力学参数力学参数力学参数r rmaxmax和和和和K Kmm。表表表表1-1 1-1 葡萄糖淀粉葡萄糖淀粉葡萄糖淀粉葡萄糖淀粉酶酶酶酶水解麦芽糖的反水解麦芽糖的反水解麦芽糖的反水解麦芽糖的反应应应应初速度与底物初速度与底物初速度与底物初速度与底物浓浓浓浓度度度度SS（mmol/Lmmol/L）V V0 0（mmol/Lmmol/L minmin）5.555.550.1630.1638.338.330.2110.21111.1111.110.2410.24113.8913.890.2760.27616
16、.6616.660.3010.30122.2222.220.3390.33927.7727.770.3470.347 解解解解：采采采采用用用用Lineweaver-BurkLineweaver-Burk法法法法，对对实实验验数数数数据据据据回回回回归归，有有有有则则 2.2.2.2 操作参数对酶促反应的影响操作参数对酶促反应的影响 pH改变可破坏酶的空间构象，引起酶活的丧失。pH的改变影响酶活性中心催化基团的解离，从而使得底物转变成产物的过程受到影响。pH的改变影响活性中心结合基团的解离状态，使得底物不能与其结合或者结合后不能生成产物。z pH对酶反应速度的影响2.2.2.2 操作参数对酶促
17、反应的影响操作参数对酶促反应的影响z 温度对酶反应速度的影响 A、在一定范围内，当温度升高时，与一般的化学反应一样，反应速度加快。B、当温度过高，会导致酶的变性，从而失去活性。抑制剂对酶促反应速率的影响抑制剂对酶促反应速率的影响u失活与抑制 【失活】(inactivation)：由于酶蛋白分子变性而引起的酶活力丧失的现象称为失活。【抑制】(inhibition)：由于酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失，称为抑制作用。竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制可逆抑制可逆抑制【可逆抑制可逆抑制】(reversible inhibition)
18、：抑制剂与酶以：抑制剂与酶以非非共价键共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复性，这种抑制作用是可逆的，称除去抑制剂而使酶复性，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。为可逆抑制。【不可逆抑制不可逆抑制】：如果抑制剂与酶的基团成共价结合，：如果抑制剂与酶的基团成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如：重金属离子对酶的抑制作用。永久性地失活。例如：重金属离子对酶的抑制作用。不可逆抑制不可逆抑制抑制抑制可逆抑制和不可逆抑制可逆抑制和不可逆抑制竞争性抑制竞争性
19、抑制(competitive inhibitions)ESIEIXPE+S+IESE+PEIK3K1K-1K2K-3当反应物系中存在与底物的结构相似的物质，这一物质也可能与酶的活性部位结合，形成非活性的复合物，阻碍了酶与底物的结合，从而影响酶促反应，这种抑制作用称为竞争性抑制。1、抑制剂是底物的类似物；、抑制剂是底物的类似物；2、提高底物浓度可消除竞争性抑制。、提高底物浓度可消除竞争性抑制。竞争性抑制竞争性抑制(competitive inhibitions)非竞争性抑制非竞争性抑制(Non-competitive Inhibitions)E+S+IES +IE+PEI+SESIK1KmKIK
20、IK-1K2当反应物系中存在与酶的活性部位以外相结合，且这一结当反应物系中存在与酶的活性部位以外相结合，且这一结合与底物的结合无竞争性关系的抑制作用称为非竞争性抑合与底物的结合无竞争性关系的抑制作用称为非竞争性抑制。制。ESEISIXP与竞争性抑制相比较，当有非竞争性抑制剂时，无论如何与竞争性抑制相比较，当有非竞争性抑制剂时，无论如何提高底物的浓度也不会消除其抑制作用。提高底物的浓度也不会消除其抑制作用。非竞争性抑制非竞争性抑制(Non-competitive Inhibitions)反竞争性抑制反竞争性抑制(Uncompetitive Inhibitions)SEI+ESESIXP这种抑制剂
21、仅能与这种抑制剂仅能与ES复合物复合物结合，而与结合，而与游离酶游离酶不能直接结不能直接结合。合。E+SES +IE+PESIK1KIK-1K2各种抑制的比较各种抑制的比较竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制Vmax不不变变减小减小减小减小Km增大增大不不变变减小减小EE底物抑制底物抑制(Substrate Inhibitions)S+SXPSESS底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底物抑制。E+SES +SE+PESSK1KSIK-1k2应用用稳态理理论，可得到底物抑制的，可得到底物抑制的酶促促反反应动力学方程力学方程为产物
22、抑制产物抑制(product inhibitions)EESEPPSPE+S+PESE+PEPKmKPk2产物抑制：酶促反应中，有时随产物浓度提高，产物与酶形成复合物，阻碍了底物与酶的结合，从而降低了酶促反应的速度。多底物酶促反应动力学多底物酶促反应动力学前面讨论的都是指单底物的酶催化反应，而实际酶催化反应更复杂，可用下列通式表示：A+B+C+=P+Q+R+这里仅讨论双底物的酶促反应，根据反应过程中形成的中间复合物的不同，可分为：顺序反应机制顺序反应机制;乒乓反应机制。乒乓反应机制。顺序反应机制顺序反应机制顺序反应顺序反应是指所有底物与酶结合之后再释放产物。有序顺序反应随机顺序反应顺序反应有序
23、顺序反应随机顺序反应乒乓反应机制乒乓反应机制乒乓反应是酶先与一种底物结合后即释放一种产物，酶发生了必要的变构，然后再结合另一种底物，再释放一种产物，释放产物之后酶一般恢复为最初状态。QAPB各种抑制的比较各种抑制的比较Km抑制抑制抑制抑制竞争性竞争性反竞争性反竞争性非竞争性非竞争性Vmax抑制抑制变大变大不变不变不变不变变小变小变小变小变小变小 固定化酶促反应动力学固定化酶促反应动力学2.3.1 固定化酶促反应动力学基础固定化酶促反应动力学基础2个个W和和1个个H?vWhat?什么是固定化酶？固定化酶：固定化酶：水溶性酶通过物理和化学的方法，使之与不水溶性酶通过物理和化学的方法，使之与不溶性载
24、体结合形成的一种不再溶解的酶。溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。酶的固定化技术：是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电吸附，共价键等与载体，如角叉菜胶、离子交换树脂等材料，制成固相酶的技术。2.3.1 固定化酶促反应动力学基础固定化酶促反应动力学基础2个个W和和1个个H?vWhy?为什么要固定化？生物工业用酶大多为水溶性，酶促反应体系为均相体系，均相体系简单，但存在一个缺点，就是酶难以回收利用，同时，酶和产物混在一起，给产物的提取带来困难。解决此问题可采用酶的固定化技术。2.3.1 固定化酶促反应动力学基础固定化酶促反应动力学基础2个个W和和1个个H?vHOW?如何进行固定化？载体结合法载
25、体结合法 交联法交联法 包埋法包埋法 1.载体结合法制备固定化酶载体结合法制备固定化酶 定义：定义：将酶利用共价键或离子键、物理吸附等方法结合于不溶性载体上的固定化方法。按载体结合形式分为：按载体结合形式分为：共价键结合法 离子键结合法 物理吸附法载体结合法载体结合法共价键结合法共价键结合法 酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。优缺点：优缺点：优点优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长 时间使用。缺点：缺点：制备条件复杂，酶蛋白活性中心易破坏。酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶。
26、常用载体：纤维素的衍生物，离子交换树脂。载体结合法载体结合法离子键结合法离子键结合法优点：优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶。缺点：缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落。优缺点：优缺点：优点：优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的高级结构；方法简单，成本低。缺点：缺点：酶吸附不牢固，易脱落；防止吸附的酶蛋白质与载体发生变性反应。载体结合法载体结合法物理吸附法物理吸附法通过物理吸附或静电引力将酶吸附在活性炭、氧化铝、离子交换树脂等具有活泼表面的载体上。常用载体：无机物：活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶。无
27、机物：活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶。有机物高分子化合物：淀粉麸质、大孔树脂、有机物高分子化合物：淀粉麸质、大孔树脂、DEAEDEAE纤维素、纤维素、DEAEDEAE葡聚糖葡聚糖凝胶。凝胶。优缺点：优缺点：定义：将酶包埋在凝胶的微细格子中或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子不能从凝胶的网络中漏出，而小分子的底物和产物可自由通过凝胶网络的固定化方法。包埋方法有两种：格子型微胶囊型2.包埋法制备固定化酶包埋法制备固定化酶原理：原理：以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。包埋法包埋法格子型固定化酶格子型固定化酶原理：原理：把
28、酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。包埋法包埋法微型胶囊法微型胶囊法特点：特点：微囊直径几微米几百微米。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。与酶反应后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内。包埋法包埋法微型胶囊法微型胶囊法定义：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶的方法。发生作用的氨基酸残基：发生作用的氨基酸残基：酪氨酸的酚基 半胱氨酸的巯基 N末端的a氨基常用的双功能或多功能试剂：常用的双功能或多功能试剂：戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺
29、3.交联法制备固定化酶交联法制备固定化酶固定化酶的制法及其特性比较固定化酶的制法及其特性比较 特性特性制备方法制备方法共价键共价键结合法结合法离子离子结合法结合法物理物理吸附法吸附法包埋法包埋法制备方法难易易难酶活力高高高低底物特异性易变不变不变不变结合能力强中弱弱再生不可可能可能不可交联法交联法难中易变强不可酶固定化后的性质变化酶固定化后的性质变化底物专一性的改变底物专一性的改变 稳定性增强稳定性增强 热稳定性、保存和使用稳定性。热稳定性、保存和使用稳定性。最适最适pHpH值和最适温度变化值和最适温度变化 酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位受影酶固定化后，酶蛋白质的电子
30、状态会发生改变，载体表面的电位受影响。响。动力学参数的变化动力学参数的变化 固定化酶有利于实现酶促反应的连续化和自动控制。固定化酶反应历程固定化酶反应历程微胶囊包埋法固定化酶为例微胶囊包埋法固定化酶为例底物传递至载体外表面；底物由外表面向内扩散；酶促反应；产物由内向外表面扩散；产物传递到流体主体。固定化酶的催化反应受两方面影响：物质传递和酶促反应。影响固定化酶促反应的主要因素影响固定化酶促反应的主要因素分子构象的改变（常见于吸附法和共分子构象的改变（常见于吸附法和共价偶联法）价偶联法）位阻效应位阻效应 微扰效应微扰效应 分配效应分配效应 （可用可用Kp Kp 定量描述定量描述）分配系数：载体内
31、外底物分配系数：载体内外底物(或其他物质或其他物质)浓度之比。浓度之比。Kp=CKp=Csi/C/Cso Kp Kp的测定：已知底物浓度的测定：已知底物浓度(C CS S)，体积，体积(V(V0 0)的溶的溶液中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜液中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度(C(Cso)。分配系数分配系数 (Kp)Csi:微环境的底物浓度；微环境的底物浓度；Cso:界面外的底物浓度。界面外的底物浓度。影响固定化酶促反应的主要因素影响固定化酶促反应的主要因素分子构象的改变（常见于吸附
32、法和共分子构象的改变（常见于吸附法和共价偶联法）价偶联法）位阻效应位阻效应 微扰效应微扰效应 分配效应分配效应 （可用可用Kp Kp 定量描述定量描述）扩散限制扩散限制 （可定量描述）（可定量描述）水溶酶水溶酶水溶酶水溶酶本征动力学参数本征动力学参数本征动力学参数本征动力学参数本征速率和动力学参数本征速率和动力学参数本征速率和动力学参数本征速率和动力学参数固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶构象改变、位阻效应等构象改变、位阻效应等构象改变、位阻效应等构象改变、位阻效应等分配效应分配效应分配效应分配效应固有速率和动力学参数固有速率和动力学参数固有速率和动力学参数固有速率和动力学参数扩散限制扩散限制扩
33、散限制扩散限制表观速率和动力学参数表观速率和动力学参数表观速率和动力学参数表观速率和动力学参数本征速率本征速率本征速率本征速率：考虑到固定化后考虑到固定化后酶分子的结构改变酶分子的结构改变，底物作用底物作用及及位位阻效应阻效应等诸因素后，固定化酶的反应速率称为本征速率。等诸因素后，固定化酶的反应速率称为本征速率。固有速率固有速率固有速率固有速率：假定底物和产物在酶的假定底物和产物在酶的微环境微环境及及宏观环境宏观环境之间的传之间的传递是递是无限迅速无限迅速，也就是在没有扩散阻力情况下的反应速率。，也就是在没有扩散阻力情况下的反应速率。不同反应速率与参数及其相互关系不同反应速率与参数及其相互关系
34、2.3.2 固定化酶促反应中的过程分析固定化酶促反应中的过程分析2.3.2.1 外部扩散过程外部扩散过程 以表面固定化酶为例以表面固定化酶为例底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率:式中式中 V V d d底物由液相主体扩散到载体表面的扩散底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率，（速率，（mol/L smol/L s）;k kL L液膜传质系数；液膜传质系数；a a 传质比表面积；传质比表面积；SS液相主体的底物浓度液相主体的底物浓度,(mol/L),(mol/L)；S SS S固
35、定化酶表面处底物浓度固定化酶表面处底物浓度,(mol/L),(mol/L)。在载体外表面的酶促反应符合在载体外表面的酶促反应符合M-MM-M方程：方程：式中式中 V VS S 载体外表面的底物消耗速率，载体外表面的底物消耗速率，(mol/L s);(mol/L s);SSS S载体外表面的底物浓度载体外表面的底物浓度(mol/L)(mol/L)。在稳定的状态下有在稳定的状态下有在稳定的状态下有在稳定的状态下有:当外扩散速率很快时，此时无外扩散的限制当外扩散速率很快时，此时无外扩散的限制当外扩散速率很快时，此时无外扩散的限制当外扩散速率很快时，此时无外扩散的限制:V VS S0 0为在外扩散速率
36、为在外扩散速率很快时的最大的反很快时的最大的反应速率。应速率。S S 当外扩散速率很慢时，外扩散为限制步骤，此当外扩散速率很慢时，外扩散为限制步骤，此当外扩散速率很慢时，外扩散为限制步骤，此当外扩散速率很慢时，外扩散为限制步骤，此时时时时:V Vd d为在外扩散速率很慢时的最大的传质速率。为在外扩散速率很慢时的最大的传质速率。当当SS 较低较低时，时，V VS S0 0 V Vd d为外扩散限制，此时为外扩散限制，此时 当当SS较高较高时，时，V VS S0 0V Vd d为反应限制，此时为反应限制，此时令：令：无因次形式：达姆科勒准数达姆科勒准数 (Da)DaDa准数是准数是C*C*的函数，
37、其物理意义是的函数，其物理意义是最大反应速率最大反应速率与与最大最大传质速率传质速率之比。之比。外扩散效率因子外扩散效率因子 (out)out=有外扩散影响时的实际反应速率无外扩散影响时的固定化酶外表面的反应速率out：表示固体催化剂颗粒催化反应进行的有效程度。：表示固体催化剂颗粒催化反应进行的有效程度。out=(Da)Da准数是决定效率因子的唯一参数，是表征传质过准数是决定效率因子的唯一参数，是表征传质过程对反应速率影响的基本准数。程对反应速率影响的基本准数。当Da准数愈小，固定化酶表面浓度Ss愈接近于主体浓度S，out越接近于1，表明最大传质速率愈大于最大反应速率，过程为反应反应控制；反之
38、，Da准数愈大，固定化酶表面浓度Ss愈小，愈趋近零，out越小，表明最大反应速率愈大于最大传质速率，过程为传质传质控制。讨论：1、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面积积a，但由于粒径减小会伴随压强增加，因，但由于粒径减小会伴随压强增加，因此应用中综合考虑，确定合适的粒径。此应用中综合考虑，确定合适的粒径。2、使固定化酶表面流体处于湍流状态以增、使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大大kL。3、适当提高液相主体的底物浓度，可提高、适当提高液相主体的底物浓度，可提高传质速率，降低外扩散的限制。传质速率，降低外扩散的限制。降低外扩散效应的技术措施降低外扩散效应的技术
39、措施2.3.2 固定化酶促反应中的过程分析固定化酶促反应中的过程分析2.3.2.1 内部扩散过程内部扩散过程固定化载体内的底物浓度的分布特点：固定化载体内的底物浓度的分布特点：酶、细胞的反应速度与底物浓度是密切相关的酶、细胞的反应速度与底物浓度是密切相关的载体内的底物浓度存在着分布不均的问题载体内的底物浓度存在着分布不均的问题沿着传质的方向有底物、产物的浓度的分布沿着传质的方向有底物、产物的浓度的分布反应速率因底物浓度的分布而在变化反应速率因底物浓度的分布而在变化vv 由于底物在载体内的扩散作用以及酶、细胞的反应由于底物在载体内的扩散作用以及酶、细胞的反应in=颗粒内的实际有效反应速率颗粒内无
40、浓度梯度时的反应速率2.3.2 固定化酶促反应中的过程分析固定化酶促反应中的过程分析2.3.2.1 内部扩散过程内部扩散过程内扩散效率因子内扩散效率因子 (in)酶的失活动力学酶的失活动力学未反应时酶的失活动力学未反应时酶的失活动力学一步失活模型一步失活模型 式中式中:E具有活性的酶，具有活性的酶，D失活的酶。失活的酶。kd失活反应速率常数。失活反应速率常数。建立酶失活动力学方程：边界条件：边界条件：积分，得积分，得未反应时酶的失活动力学未反应时酶的失活动力学几个概念：一步失活常数：一步失活常数 ：半衰期，当：半衰期，当 ：时间常数，：时间常数，三者关系：三者关系：未反应时酶的失活动力学未反应
41、时酶的失活动力学反应中酶的失活动力学反应中酶的失活动力学反应中酶的稳定性与酶的使用寿命直接相关。酶在反应中的稳定性称为操作稳定性（operation stability）。其测定方法有以下3种：分批测定法；连续测定法；利用圆二色性分析方法直接跟踪失活酶的结构变化。本章小结：本章小结：v酶促反应动力学的生物学基础：酶的基本概念、催化特性等；v均相酶促反应动力学：酶与底物的作用方式、影响酶促反应的因素、单底物酶促反应动力学方程的推导。v固定化酶促反应动力学：固定化酶的优点、固定化方法、外扩散、内扩散。v酶的失活动力学：一步失活模型、半衰期等概念。复习题：复习题：v影响酶促反应的主要因素有哪些？v分别利用快速平衡法和稳态法推导竞争性抑制动力学方程。v酶的固定化方法有哪些，各自的优缺点分别是什么？v书本P51,第16题。谢 谢！