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1、第十二章动物细胞培养技术第十二章动物细胞培养技术动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养：指的是从动物组织或细胞从体内取指的是从动物组织或细胞从体内取出，在出，在模拟体内生理环境模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能生存和生长并维持其结构和功能的方法。的方法。细胞培养：细胞培养：培养物是单个细胞和细胞群。培养物是单个细胞和细胞群。第一节第一节 体外培养动物细胞的生物学特性体外培养动物细胞的生物学特性一、体外培养物的细胞生物学特点一、体外培养物的细胞生物学特点（一）（一）动物细胞特点动物细胞特点动物动物细胞大细胞大，无
2、细胞壁，无细胞壁动物细胞动物细胞生长缓慢生长缓慢，倍增时间长，易受污染，倍增时间长，易受污染需氧量少，对机械搅拌或需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感剪切力敏感动物细胞间主要以动物细胞间主要以聚集体聚集体形式存在形式存在原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖50代代即退化死亡即退化死亡培养细胞最多见的表现是：培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞失去原有组织结构和细胞形态形态；分化减弱分化减弱或不显、出现类似或不显、出现类似“反祖反祖”现象；现象；表表现现为为细细胞胞趋趋单单一一化化，或或获获得得不不死死性性，或或变变成成具具有有恶恶性性性状的细胞群。性状的细胞群。（二）（二）体内外细胞的差异体
3、内外细胞的差异二、体外培养细胞的形态二、体外培养细胞的形态（一）体外培养细胞的分类（一）体外培养细胞的分类体外细胞体外细胞生长生长贴附型贴附型贴附型贴附型悬浮型悬浮型悬浮型悬浮型多形型细胞多形型细胞（神经元和神经胶质细胞，呈多角（神经元和神经胶质细胞，呈多角形）形）上皮细胞型上皮细胞型（上皮、肝、胰和肺泡上皮等，源（上皮、肝、胰和肺泡上皮等，源于外胚层和内胚层细胞）于外胚层和内胚层细胞）成纤维细胞型成纤维细胞型（心肌、平滑肌、血管内皮等，（心肌、平滑肌、血管内皮等，源于中胚层细胞）源于中胚层细胞）游走细胞型游走细胞型（单核细胞、巨噬细胞和某些肿瘤（单核细胞、巨噬细胞和某些肿瘤细胞，形状不定）细
4、胞，形状不定）（生长时不贴壁，如淋巴细胞、白细胞和某些肿瘤（生长时不贴壁，如淋巴细胞、白细胞和某些肿瘤细胞）细胞）（二）（二）培养细胞的生长特点培养细胞的生长特点体外细胞体外细胞生长特点生长特点贴壁贴壁接触抑制接触抑制密度抑制密度抑制1 1）细胞贴壁过程）细胞贴壁过程2 2）接触抑制）接触抑制定定义义：细细胞胞从从接接种种到到长长满满底底物物表表面面后后，由由于于细细胞胞繁繁殖殖数数量量增增多多相相互互接接触触后后，不不再再增增加。加。3 3）密度抑制）密度抑制细细胞胞接接触触汇汇合合成成片片后后，虽虽发发生生接接触触抑抑制制，但但只只要要营营养养充充分分，细细胞胞仍仍然然能能够够进进行行增增
5、殖殖分分裂裂，数数量量仍仍在在增增多多，但但当当细细胞胞密密度度进进一一步步增增大大时时，培培养养液液中中营营养养成成分分的的减减少少，细细胞胞营营养养的的枯枯竭竭和和代代谢谢物物的的影影响响，则发生则发生密度抑制，导致细胞分裂停止密度抑制，导致细胞分裂停止。三、培养细胞的增殖能力三、培养细胞的增殖能力（一）培养细胞生命期（一）培养细胞生命期细胞周期细胞周期可分为可分为G1期、期、S期、期、G2期期和和M期。培养细胞单个细胞的生长期。培养细胞单个细胞的生长过程与体内细胞单个细胞的生长过程与体内细胞单个细胞的生长过程相似。过程相似。体外培养细胞的生长增殖过程体外培养细胞的生长增殖过程原代培养期原
6、代培养期:从从体内取出组织接种培养到第一次传代培养体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，这个阶段，一般持续一般持续1-4周。这个阶段周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。传代期传代期：原代培养的细胞一经传代后便称：原代培养的细胞一经传代后便称细胞系细胞系细胞系细胞系。细胞增殖旺盛细胞增殖旺盛，当，当传代传代10-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。衰退期衰退期：细胞增殖：细胞增殖缓慢或不增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。细胞轮廓
7、增强，最后衰退凋亡。1.1.原代培养原代培养（PrimaryCulture）期期：也称也称初代培养初代培养初代培养初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续代阶段，一般持续1一一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。胞分裂，但不旺盛。细胞群是异质的细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。胞相互依存性强。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药检测药物很好的实验对象物很好的实验对象。2 2传代
8、期传代期初代培养细胞一经传代后便改称做初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（细胞系（CellLine）。在在全生命期中此期的全生命期中此期的持续时间最长持续时间最长。在培养条件较好情况下，。在培养条件较好情况下，细细细细胞增殖旺盛胞增殖旺盛胞增殖旺盛胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，并能维持二倍体核型。为保持二倍体细胞性质，为保持二倍体细胞性质，细胞应在细胞应在初代培养期或传代后早期冻存初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代。一般情况下当传代1050次次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。三期。3衰退期衰退期：此期细胞仍然生
9、存，此期细胞仍然生存，增殖很慢或不增殖增殖很慢或不增殖，最后，最后衰退凋亡衰退凋亡。由。由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。细胞可能获得于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。细胞可能获得永永生性生性或或恶性性恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖细胞获持久性增殖能力能力，这样的细胞群体称，这样的细胞群体称无限细胞系无限细胞系，也称也称连续细胞系连续细胞系。核型。核型大多变成大多变成异倍体异倍体。（二）每代细胞的生长过程（二）每代细胞的生长过程细胞培养过程中细胞培养过程中一代一代一代一代指的是指的是从从细胞接种到分离再培养细胞接种到分离再培养细胞接种到分
10、离再培养细胞接种到分离再培养的的一段时间。在细胞一代中细一段时间。在细胞一代中细胞倍增胞倍增36次次。时期：时期：潜伏期；对数生长期；潜伏期；对数生长期；潜伏期；对数生长期；潜伏期；对数生长期；稳定（停滞）期；衰亡期。稳定（停滞）期；衰亡期。稳定（停滞）期；衰亡期。稳定（停滞）期；衰亡期。每代细胞生长曲线每代细胞生长曲线每每代代细细胞胞生生长长过过程程潜伏期潜伏期潜伏期潜伏期指数生指数生指数生指数生长期长期长期长期停滞停滞停滞停滞期期期期细细胞胞接接种种后后，先先进进入入生生长长缓缓慢慢的的滞滞留留阶阶段段，胞胞体体均均呈呈圆圆球球形形悬悬浮浮于于培培养养液液中中，接接着着细细胞胞开开始始附附
11、着着于于支支持持物物表表面面。细细胞胞贴贴壁壁后后，逐逐渐渐伸伸展展，恢恢复复细细胞胞原原有有形形态态，经经过过一个潜伏期，才进入生长和增殖期。一个潜伏期，才进入生长和增殖期。又又称称对对数数期期。此此期期为为细细胞胞增增殖殖最最旺旺盛盛的的阶阶段段，细细胞胞分分裂裂相相增增多多，成成倍倍增增长长，活活力力最最佳佳。又又称称平平台台期期，此此时时细细胞胞数数量量饱饱和和，细细胞胞不不再增殖，但仍有代谢活动。再增殖，但仍有代谢活动。细胞培养的一般过程：细胞培养的一般过程：取材取材、培养培养及及细胞细胞冻存与复苏冻存与复苏。第二节动物细胞体外培养技术第二节动物细胞体外培养技术一、细胞的基本培养技术
12、一、细胞的基本培养技术（一）（一）原代培养原代培养原代培养原代培养是将动物的各种组织从机体取出，经酶是将动物的各种组织从机体取出，经酶(常用胰常用胰蛋白酶蛋白酶)或机械方法处理，分散成单细胞，置培养基中培或机械方法处理，分散成单细胞，置培养基中培养，使细胞生存、生长和繁殖。养，使细胞生存、生长和繁殖。鼠胚组织取材鼠胚组织取材1.1.原代细胞的取材原代细胞的取材鼠肾（或肺）取材鼠肾（或肺）取材组组织织材材料料若若来来自自血血液液、羊羊水水、胸胸水水或或腹腹水水的的悬悬液液材材料料，最最简简单单的的方方法法是是采采用用1000r/min的的低低速速离离心心10分分钟钟。经经离离心心后后由由于于各各
13、种种细细胞胞的的比比重重不不同同可可在在分分层层液液中中形形成成不不同同层层，这这样可根据需要收获目的细胞。样可根据需要收获目的细胞。1 1）悬浮细胞的分离方法）悬浮细胞的分离方法2.2.原代细胞的分离原代细胞的分离消化分离法消化分离法2 2）实体组织材料的分离方法）实体组织材料的分离方法机械分散法机械分散法（物理裂解）（物理裂解）方法方法特特点点:简简便便、快快速速,但但对对组组织织机机械械损损伤伤大大，而而且且细细胞胞分分散散效效果果差差,适适用用于于处处理理纤纤维维成成分分少少的的软软组织组织。机械分散法机械分散法胰胰蛋蛋白白酶酶分分散散原原理理：主主要要作作用用于于赖赖氨氨酸酸或或精精
14、氨氨酸酸相相连连接接的的肽肽键键，使使细细胞胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。酶消化分离法酶消化分离法胰蛋白酶胰蛋白酶胶原酶胶原酶胰蛋白酶胰蛋白酶消化分离法消化分离法1 1）组织块培养法）组织块培养法3.3.原代细胞的培养方法原代细胞的培养方法2 2）分散细胞培养法）分散细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。3 3）悬浮细胞培养法）悬浮细胞培养法（二）（二）传代培养传代培养贴壁生长的细胞贴壁生长的细胞消化法传代消化法传代直接吹打或
15、用硅胶软刮直接吹打或用硅胶软刮悬浮细胞悬浮细胞直接吹打直接吹打自然沉降法自然沉降法传代培养方法传代培养方法（1 1）贴壁细胞的消化传代方法贴壁细胞的消化传代方法（2 2）悬浮细胞传代方法悬浮细胞传代方法直接传代直接传代让悬浮细胞自然沉降让悬浮细胞自然沉降弃掉弃掉1/2-1/31/2-1/3上清上清用吸管轻轻吹打制备成细胞悬液用吸管轻轻吹打制备成细胞悬液分装培养分装培养离心法传代离心法传代将培养液转移到离心管中将培养液转移到离心管中离心收集细胞离心收集细胞弃去上清弃去上清加新的培养液吸管吹加新的培养液吸管吹打制备成细胞悬液打制备成细胞悬液分装培养分装培养体外培养的细胞源于人或动物的胚胎组织，体外
16、培养的细胞源于人或动物的胚胎组织，体内的细胞都体内的细胞都是混杂生长是混杂生长，来源于上述组织的培养材料的，来源于上述组织的培养材料的原代细胞、传原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长代细胞绝大多数都呈混合生长，既有，既有上皮样细胞又有纤维上皮样细胞又有纤维上皮样细胞又有纤维上皮样细胞又有纤维样细胞样细胞样细胞样细胞，混杂的细胞会直接影响实验结果。，混杂的细胞会直接影响实验结果。（三）细胞纯化（三）细胞纯化 1.自然纯化自然纯化 自然纯化是自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势利用某一种类细胞的增殖优势利用某一种类细胞的增殖优势利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中，在长期传代过程中靠自然
17、淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，力，最后留下生长优势旺盛的细胞最后留下生长优势旺盛的细胞最后留下生长优势旺盛的细胞最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。，达到细胞纯化的目的。但这种方法常但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时。此法花费时间长，间长，留下的往往是留下的往往是成纤维细胞成纤维细胞。仅有那些恶变的。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞肿瘤细胞或突变的细胞肿瘤细胞或突变的细胞肿瘤细胞或突变的细胞可可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建
18、立细胞系。以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。2.人工纯化人工纯化人工纯化是利用人为手段造成人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，对某一细胞生长有利的环境条件，对某一细胞生长有利的环境条件，对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长抑制其他细胞的生长抑制其他细胞的生长抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。从而达到纯化细胞的目的。（1）酶消化法）酶消化法酶消化法是比较常用的纯化方法，对贴壁细胞可行，能利用酶消化法是比较常用的纯化方法，对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和上皮细胞和成纤维细胞成纤维细胞对对胰胰蛋白酶蛋白酶的耐受性不同，的耐受性不同，成纤维细胞成纤
19、维细胞先脱壁。先脱壁。（2）机械刮除法）机械刮除法 原代培养时，如果原代培养时，如果上皮细胞和成纤维细胞上皮细胞和成纤维细胞分为区成混杂生长，分为区成混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。可用上。可用硅橡胶刮子硅橡胶刮子去除去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。这样反复多次可以纯化细胞。这样反复多次可以纯化细胞。（3）反复贴壁法）反复贴壁法 成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快成纤维细胞与上皮细胞相比
20、，其贴壁过程快成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞能在，大部分细胞能在短时间内（大约短时间内（大约10-30min）完成附着过程。）完成附着过程。上皮细胞（大部分）上皮细胞（大部分）在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此，利用此差别可以纯化细胞。差别可以纯化细胞。（四）细胞的冻存（四）细胞的冻存和和复苏复苏细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞遗细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞遗传性状的改变和延缓衰老。传性状的改变和延缓衰老
21、。目前，动物细胞一般保存于目前，动物细胞一般保存于液氮中（液氮中（-196）。）。一般在一般在原代或传代原代或传代原代或传代原代或传代2-102-10次次次次内即大量内即大量冻存，作为冻存，作为原种原种。在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。原理：1.1.常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点。2.2.提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤。冷冻保护剂的应用冷冻保护剂的应用冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：当细胞冷到零度以下，可
22、以产生以下变化：细胞器脱水，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快复苏过程应快复苏过程应快复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶融，目的是防止小冰晶形成大冰晶融，目的是防止小冰晶形成大冰晶融，目的是防止小冰晶形成大冰晶。慢冻程序慢冻程序标准程序：标准程序：当温度在当温度在-25以上时，以上时，1
23、2/min当温度达当温度达-25以下时，以下时，510/min当温度达当温度达-100时，可迅速放入液氮中时，可迅速放入液氮中-196-196液氮罐液氮罐普通冰箱普通冰箱低温冰箱低温冰箱解冻程序解冻程序原则原则：快速解冻快速解冻快速解冻快速解冻原因原因：解冻缓慢解冻缓慢时，原有冰晶溶化后，又会以新的晶核为时，原有冰晶溶化后，又会以新的晶核为 中心形成更大的冰晶，称为水的中心形成更大的冰晶，称为水的重结晶重结晶现象。但采现象。但采 用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤。用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤。解冻程序解冻程序：从液氮中取出冷冻管，快速放入从液氮中取出冷冻管，快速放入37-4
24、0水浴水浴 中，轻轻震摇，使冻存细胞尽快解冻（中，轻轻震摇，使冻存细胞尽快解冻（40-60s).二、动物细胞培养的基本方法二、动物细胞培养的基本方法悬滴培养悬滴培养培养瓶培养培养瓶培养旋转管培养旋转管培养克隆培养法克隆培养法细胞同步化培养法细胞同步化培养法动物细胞的大规模培养动物细胞的大规模培养常常用用的的培培养养技技术术单盖玻片单盖玻片将培养液滴于盖玻片上将培养液滴于盖玻片上并铺展开并铺展开 将待培养的将待培养的组织块组织块铺铺展于培养液中央展于培养液中央 将盖玻片翻转放于凹载将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封玻片上，密封 贴壁贴壁24小时内，细胞就小时内，细胞就能从组织块四周游走能从组织块四
25、周游走 （一）（一）（一）（一）悬滴培养法悬滴培养法悬滴培养法悬滴培养法（二）培养瓶培养法（二）培养瓶培养法组织块的接种与培养组织块的接种与培养分离细胞的接种与培养分离细胞的接种与培养（三）（三）旋转管培养法旋转管培养法由由于于旋旋转转作作用用，组组织织块块和和细细胞胞交交替替地地与与培培养养基基和和空空气气直直接接接触。接触。（四）（四）（四）（四）克隆培养法克隆培养法克隆培养法克隆培养法克隆培养法克隆培养法又称又称单单细胞分离培养法细胞分离培养法，将从细胞悬液中获将从细胞悬液中获得的单个细胞用于得的单个细胞用于培养，使之重新繁培养，使之重新繁衍成一个新的细胞衍成一个新的细胞群体的培养技术。
26、群体的培养技术。（五）灌注小室培养法（五）灌注小室培养法（六）培养板培养法（六）培养板培养法 具体做法是将培养细胞接种在具体做法是将培养细胞接种在培养板培养板培养板培养板的孔内，然后在的孔内，然后在CO2培养箱内培培养箱内培养。最常用的培养板有养。最常用的培养板有6孔、孔、24孔和孔和96孔孔培养板，后者最为常用。一般培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。都是一次性使用。三、动物细胞大规模培养技术三、动物细胞大规模培养技术（一）动物细胞大规模培养的方法（一）动物细胞大规模培养的方法转瓶培养转瓶培养反应器贴壁培养反应器贴壁培养细胞贴附于固定的表面生长，不会随搅拌而随细胞贴附于固定的表面生长，
27、不会随搅拌而随培养液一起流动，比较容易更换培养液，不需培养液一起流动，比较容易更换培养液，不需要特殊的分离和培养设备。要特殊的分离和培养设备。将动物培养材料分散成细胞悬浮液将动物培养材料分散成细胞悬浮液 过滤、离心、纯化、漂过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。传代时按比例稀洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。传代时按比例稀释即可继续培养。释即可继续培养。悬浮培养悬浮培养固定化培养固定化培养）微载体法）微载体法微载体是直径微载体是直径60-250um的微珠。一般有天然的的微珠。一般有天然的葡聚糖葡聚糖 或者合成的聚合物组成，如或者合成的聚合物组成，如聚苯乙烯微载体、聚甲基聚苯
28、乙烯微载体、聚甲基丙稀酸羟乙酯微载体丙稀酸羟乙酯微载体等。扩大细胞附着面，提高生长等。扩大细胞附着面，提高生长速率和产量。速率和产量。（1）微载体培养系统）微载体培养系统）多孔载体法多孔载体法多用多用明胶明胶制成。制成。优点：优点：优点：优点：降降低低血血清清用用量量，增增加加细细胞胞固固定定性性。大大的的生生长长空空间间，免免受受机机械械损损伤伤，可可以提高搅拌强度和通气量，强化传质。以提高搅拌强度和通气量，强化传质。多孔载体不仅能培养多孔载体不仅能培养贴壁细胞贴壁细胞，也适合，也适合悬浮细胞悬浮细胞的固定化培养。的固定化培养。（）（）中空纤维培养系统中空纤维培养系统最初使用的空心纤维是一种
29、由最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，。这样，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也可在上面水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也可在上面贴附贴附生长。生长。（）微囊培养系统（）微囊培养系统微囊是一种用人造的微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可自由，小分子物质可自由透过，大分子物质可包裹在其中不能逸出。透过，大分子物质可包裹在其中不能逸出。微囊化培养是将细胞包裹在微囊中，在培养液中悬浮培微囊化培养是将细胞包裹在微囊中，在培养液
30、中悬浮培养。养。细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护，减减少了搅拌对细胞产生的剪切力少了搅拌对细胞产生的剪切力。细胞悬浮于细胞悬浮于海藻酸钠海藻酸钠溶液中，滴入溶液中，滴入氯化钙氯化钙溶液，再用溶液，再用聚聚-L-赖氨酸赖氨酸和和聚乙烯胺聚乙烯胺溶液处理，形成溶液处理，形成半透膜半透膜。按培养细胞的方式不同，反应器可分为以下三类：按培养细胞的方式不同，反应器可分为以下三类：1.悬浮培养用反应器：悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中空纤维反应器、气如搅拌反应器、中空纤维反应器、气升式反应器；升式反应器；2.贴壁培养用反应器：贴壁培养用反应器：如搅拌反应器
31、（微载体培养）、玻璃如搅拌反应器（微载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反应器；珠床反应器、中空纤维反应器；3.包埋培养用反应器：包埋培养用反应器：如流化床反应器、填充床反应器。如流化床反应器、填充床反应器。（二）动物细胞大规模培养用生物反应器种类（二）动物细胞大规模培养用生物反应器种类（二）动物细胞大规模培养用生物反应器种类（二）动物细胞大规模培养用生物反应器种类一、培养细胞的生物学鉴定和细胞系（株）的建立一、培养细胞的生物学鉴定和细胞系（株）的建立（一）细胞形态观察（一）细胞形态观察（一）细胞形态观察（一）细胞形态观察肉眼观察培养物颜色及混浊度肉眼观察培养物颜色及混浊度倒置显微镜观察细胞生
32、长状态倒置显微镜观察细胞生长状态第三节培养细胞常规检查和特性鉴定第三节培养细胞常规检查和特性鉴定细胞生长曲线是观察细胞细胞生长曲线是观察细胞在在一代一代生存期内的增生过生存期内的增生过程的重要指标，以培养时程的重要指标，以培养时间（间（d）为横坐标、细胞）为横坐标、细胞密度为纵坐标所做出的曲密度为纵坐标所做出的曲线。线。（二）细胞生长情况（二）细胞生长情况（二）细胞生长情况（二）细胞生长情况1.1.细胞生长曲线的测定细胞生长曲线的测定细胞生长曲线的测定细胞生长曲线的测定（1 1）细胞计数法）细胞计数法细胞计数法是用血细胞细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中计数板计数细胞悬液中的细胞数目，用
33、以测定的细胞数目，用以测定细胞增殖和调整细胞浓细胞增殖和调整细胞浓度度的一种方法。的一种方法。MTT是是二甲基噻唑二苯基四唑溴盐二甲基噻唑二苯基四唑溴盐，四唑盐（四唑盐（MTT）商品商品名为噻唑蓝。名为噻唑蓝。MTT MTT比色法的原理：比色法的原理：比色法的原理：比色法的原理：活细胞线粒体活细胞线粒体中中琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶能将能将四唑盐还原成四唑盐还原成四唑盐还原成四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物不溶于水的蓝紫色产物不溶于水的蓝紫色产物不溶于水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能死细胞没有这种功能。二甲亚砜二甲亚砜能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜
34、色深浅与所含的能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的蓝紫色产物蓝紫色产物蓝紫色产物蓝紫色产物量成正比。再用量成正比。再用酶标仪测定酶标仪测定OD值值。(2)MTT比色法比色法MTT 法法+DMSODMSO操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：接种细胞于接种细胞于9696孔培养板（孔培养板（10103 3-10-104 4细胞细胞200200微升微升/孔）孔）3737、5 5COCO2 2培养箱中培养一段时间培养箱中培养一段时间加入加入2 2毫克毫升的毫克毫升的MTTMTT液（液（5050微升孔）微升孔）继续培养继续培养3 3小时小时吸出孔内培养液后，加入吸出孔内培养液后，加入D
35、MSODMSO液（液（150150微升孔）微升孔）振荡振荡1010分钟分钟酶标仪检测各孔酶标仪检测各孔ODOD值（检测波长值（检测波长570570纳米）纳米）记录结果，绘制细胞生长曲线记录结果，绘制细胞生长曲线(3)CCK-8 法法（Cell Counting Kit-8）原原理理：试试剂剂中中含含有有WST-8【2-(2-甲甲氧氧基基-4-硝硝基基苯苯基基)-3-(4-硝硝基基苯苯基基）-5-(2,4-二二磺磺酸酸苯苯)-2H-四四唑唑单单钠钠盐盐】，它它在在电电子子载载体体【1-甲甲氧氧基基-5-甲甲基基吩吩嗪嗪鎓鎓硫硫酸酸二二甲甲脂脂】(1-MethoxyPMS)的的作作用用下下被被细细
36、胞胞中中的的脱脱氢氢酶酶还还原原为为具具有有高高度度水水溶溶性性的的黄黄色色甲甲瓒瓒染染料料。甲甲瓒瓒染染料料的的数数量量与与活活细细胞胞数数量量成成正正比比，因因此此可以根据测定可以根据测定吸光度值吸光度值来测定增值细胞和活细胞数。来测定增值细胞和活细胞数。9696孔板接种培养一定时间的细胞（孔板接种培养一定时间的细胞（100 100 l/l/孔）孔）继续培养继续培养2-42-4小时小时加加CCK-8 10CCK-8 10l/l/孔孔测吸光度测吸光度CCK-8 法法 96孔板比色分析孔板比色分析 为为1瓶溶液，即开即用瓶溶液，即开即用 对细胞毒性小对细胞毒性小毋需有机溶剂毋需有机溶剂 灵敏度
37、高灵敏度高Cell Counting Kit-8优点优点2.2.细胞分裂指数细胞分裂指数细胞分裂指数是指分裂期细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的细胞在全部细胞中所占的百分率，百分率，用以表示细胞的用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般计数增殖旺盛程度。一般计数1000个细胞中的细胞分裂个细胞中的细胞分裂指数。指数。公式：公式：3 3.细胞贴壁率细胞贴壁率细胞贴壁率又称细胞贴壁率又称接种存接种存接种存接种存活率活率活率活率，用于观察贴壁附，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映着生长细胞，主要反映细胞的生存能力，和部细胞的生存能力，和部分底物材料的相容性。分底物材料的相容性。4.4.细胞周期细胞
38、周期细胞周期细胞周期是指一个母细胞分是指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一裂结束后形成的细胞至下一次再分裂结束形成两个子细次再分裂结束形成两个子细胞的时间，仅指一个细胞的胞的时间，仅指一个细胞的分裂生长周期时间。分裂生长周期时间。5.5.细胞活力检测细胞活力检测由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排除，因而细胞显示一定的颜可大量进入却不被排除，因而细胞显示一定的颜色。而活细胞由于能排除进入细胞内的染料，故色。而活细胞由于能排除进入细胞内的染料，故不易着色。不易着色。台盼蓝台盼蓝台盼蓝台盼蓝排斥试验排斥试验计数计数1000个细胞中
39、的个细胞中的活细胞（不着色）和死细胞（染上蓝色）活细胞（不着色）和死细胞（染上蓝色）数目。计算活数目。计算活细胞百分比。细胞百分比。trypanblue溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法溴化乙锭（溴化乙锭（EB）和碘化丙锭（）和碘化丙锭（PI）均为荧光染料，可与）均为荧光染料，可与DNA特异结合。特异结合。PhotomicrographsEthidiumBromide荧光染色与计数：荧光染色与计数：取细胞悬液和取细胞悬液和EB或或PI染液各，染液各，混匀。静置混匀。静置1030min后于荧后于荧光显微镜下计数。光显微镜下计数。发橙红色荧发橙红色荧光者为死细胞。光者为死细胞
40、。二、培养细胞的常规检查二、培养细胞的常规检查（一）培养液和（一）培养液和pH鉴定鉴定（二）细胞生长情况分析（二）细胞生长情况分析（三）培养细胞的污染监测和排除（三）培养细胞的污染监测和排除培养细胞污染培养细胞污染微生物微生物真菌真菌细菌细菌支原体支原体病毒病毒化学物质化学物质（非细胞生长所需化学成分）（非细胞生长所需化学成分）细胞细胞（非同种的其他细胞）（非同种的其他细胞）常见的污染及检测方法常见的污染及检测方法(1)(1)(1)(1)细菌的污染及检测细菌的污染及检测细菌的污染及检测细菌的污染及检测常见细菌污染常见细菌污染革兰氏阴性菌（白色葡萄菌）革兰氏阴性菌（白色葡萄菌）假单胞菌假单胞菌检
41、测方法检测方法显微镜观察法显微镜观察法（在倒置显微镜的高倍镜下可见培养（在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量液中有大量圆球状颗粒圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染漂浮，即为细菌污染 ）肉眼直接观察法肉眼直接观察法（培养液变混浊，或略加振荡（培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起）有很多漂浮物漂起）培养检查法培养检查法（采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的（采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，若被污染培养液接种，若被污染24小时内可获得阳性结果）小时内可获得阳性结果）(2)(2)真菌的污染及检测真菌的污染及检测常见真菌污染常见真菌污染检测方法检测方法烟曲菌、黑曲菌烟曲菌、黑曲菌毛霉菌、孢
42、子菌毛霉菌、孢子菌白念球菌、酵母菌白念球菌、酵母菌肉眼直接观察法肉眼直接观察法（培养液变（培养液变混浊混浊，或略加振荡，或略加振荡有很多有很多漂浮物漂浮物漂起）漂起）显微镜观察法显微镜观察法（在倒置显微镜的高倍镜下可见培养（在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中细胞之间有液中细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形丝状、管状、树枝状或卵形的物质的物质常为真菌污染常为真菌污染）fungus 中间长梭型的是正在分裂的念珠菌中间长梭型的是正在分裂的念珠菌 真菌污染真菌污染(3)(3)支原体污染及检测支原体污染及检测支原体是介于支原体是介于细菌与病毒细菌与病毒之间的一种能够独立生之间的一种能够独立生活的最小的微
43、生物，最小直径在活的最小的微生物，最小直径在m之间，无细之间，无细胞壁，可呈现多形性。胞壁，可呈现多形性。支原体污染是细胞培养中支原体污染是细胞培养中支原体污染是细胞培养中支原体污染是细胞培养中常见而又难以解决的问题常见而又难以解决的问题常见而又难以解决的问题常见而又难以解决的问题。支原体污染的检测方法支原体污染的检测方法 支原体在镜下呈支原体在镜下呈暗色微小颗粒暗色微小颗粒，多位于多位于细胞与细胞之间细胞与细胞之间，有时可，有时可见类似于布朗运动的表现。应注见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。粒体等相区别。相差显微镜观察相差显微镜
44、观察Mycoplasma InfectionsMycoplasma Infections 荧荧荧荧光光光光染染染染色色色色法法法法观观观观察察察察 用用荧荧光光染染料料Hoechst33258Hoechst33258，此此染染料料能能与与DNA特特异异地地结结合合，可可使使支支原原体体内内的的DNA着着色色，然然后后用用荧荧光显微镜观察。光显微镜观察。支原体污染细胞的支原体污染细胞的Hoechst33258Hoechst33258染色结果染色结果 电电电电镜镜镜镜检检检检测测测测用用扫扫描描电电镜镜或或透透射射电电镜镜观观察察。一一般般在在细细胞胞培培养养4872小小时时，细细胞胞接接近近汇汇
45、合合前前，用用胰胰酶酶消消化化细细胞胞制制成成细细胞胞悬悬液液后后进进行行。需需经经过过固固定定、包包埋埋、切片后才能进行观察。切片后才能进行观察。扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体众多的圆形颗粒为支原体支原体污染电镜照片支原体污染电镜照片(X30k),(X30k),煎蛋状和其煎蛋状和其他形状他形状 将细胞悬液加入将细胞悬液加入支原体支原体肉汤培养基培养肉汤培养基培养，14天天后观察肉汤培养有后观察肉汤培养有无雾无雾状沉淀状沉淀，再用琼脂培养，再用琼脂培养基做分离培养，基做分离培养，37培培养养3天观察有无天观察有无“荷包蛋荷包蛋”菌落出现。菌落出现。培养检测培养检测 思考题思考题1.简述培养细胞的生命期。简述培养细胞的生命期。2.简述动物细胞生长情况的检测方法。简述动物细胞生长情况的检测方法。