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1、第三章第三章DNA的提取与纯化的提取与纯化基因工程需要三种不同的DNA:总总DNA 质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA学习内容：制备细胞总制备细胞总DNADNA 培养、搜集细菌细胞培养、搜集细菌细胞 制备细胞提取物制备细胞提取物 DNADNA纯化、浓缩纯化、浓缩 从其他生物中提取总从其他生物中提取总DNADNA质粒质粒DNADNA提取提取 根据分子大小分离根据分子大小分离 根据结构分离根据结构分离 质粒扩增质粒扩增提取噬菌体提取噬菌体DNADNA 噬菌体的培养噬菌体的培养 制备非溶源性噬菌体制备非溶源性噬菌体 收集噬菌体收集噬菌体 从从 噬菌体中纯化噬菌体中纯化DNA DNA 纯化纯化M13 D
2、NA M13 DNA The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteriaBasic Steps1.制备总DNA基本步骤：1)收集细菌细胞2)打碎细胞，释放内容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩培养、搜集细菌细胞两种类型的细菌培养基的成分：M9培养基：Na2HPO4(6.0)KH2PO4(3.0)NaCl(0.5)NH4Cl(1.0)MgSO4(0.5)Glucose(2.0)CaCl2(0.015)LB培养基：Yeast extract(5)NaCl(10)培养、收集细菌细胞37C，
3、150-250rpm达到最大浓度2-3109cell/ml,600nm下的OD值，1OD相当于0.8109cell/ml Figure3.2 Estimation of bacterial cell number by measurement of optical density Harvesting bacteria by centrifugation1.2 制备细胞提取物利用溶菌酶、EDTA或两者结合。溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。EDTA络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解DNA酶的活性。一般溶菌酶或EDTA足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入SD
4、S。Preparation of a cell extract.Preparation of a cell extractPreparation of a cell extract Removal of protein contaminants by phenol extraction.Purification of DNA from a cell extractPurification of DNA from a cell extract1.制备细胞总DNA1.4 DNA的浓缩与浓度测定最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。260nm下测定吸光度
5、，1OD相当于50g双链DNA/ml。A260/A280，2说明有RNA Collecting DNA by ethanol precipitation.Concentration of DNA samples The CTAB method for purification of plant DNA Plant DNA(CTAB法法)十六烷基三十六烷基三甲基溴化铵甲基溴化铵 The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purification.阴离子交换层析法阴离子交换层析法2 质粒DNA提取质粒DNA的大小（8%）。DN
6、A的构造 Alkaline denaturation Ethidium bromide（溴化二氨乙苯啡（溴化二氨乙苯啡啶）啶）-caesium chloride（氯化铯）（氯化铯）density gradient centrifugation2质粒DNA提取2.1 根据分子大小提取质粒DNAsphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。问题：裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA质粒分子非常大时，将与染色体DNA共沉淀Figure3.9 Preparation of a cleared lysatelysate.Sphaeroplast残壁细胞残壁细胞2质粒DNA提
7、取2.2 根据分子构造提取碱裂解法 基本原理：在非常窄的基本原理：在非常窄的pHpH范围内，非螺旋化的范围内，非螺旋化的DNADNA会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解液中加入氢氧化钠，调液中加入氢氧化钠，调pHpH值至值至12.012.5,12.012.5,破坏破坏氢键，使氢键，使DNADNA变性。加入酸，变性的细菌变性。加入酸，变性的细菌DNADNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。另外一个优点，利用另外一个优点，利用SDSSDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（Sodium dodecyl sulfat
8、eSodium dodecyl sulfate，SDSSDS），裂解，），裂解，KAcKAc中和可以去掉大部分的蛋白质和中和可以去掉大部分的蛋白质和RNARNA。Two conformation of circular double-stranded DNA.Two conformation of circular double-stranded DNATwo conformation of circular double-stranded DNA Plasmid purification by the alkaline denaturation method.Alkaline denatur
9、ation2质粒DNA提取2.2 EBCsCl密度梯度离心法在大离心力条件下，形成梯度，生物大分子形成条带。条带的位置取决于其浮力密度。最上部是蛋白质，中间是DNA，下部是RNA。CsCl density gradient centrifugation.CsCl density gradient centrifugation2.2 EBCsCl密度梯度离心法EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。Partial unwinding of the DNA double helix by
10、EtBr intercalation between adjacent base parirs.EBEB如何与如何与DNA结合结合?Purification of plasmiod DNA by EtBr-CsCl density gradient centrifugation如何分离质粒如何分离质粒DNA？2质粒DNA提取2.3 质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如氯霉素，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。Plasmid amplification Plasmid
11、amplificationInhibitor of protein synthesis:Chloramphenical,12h,3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。然而获得大量的噬菌体DNA是一个障碍。每ml菌液可以获得1010噬菌体，但只能产生500ngDNA。3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备3.1 噬菌体的培养自然培养的噬菌体是溶源性的。要获得大量的细胞外噬菌体，必须经过诱导培养使所有的噬菌体都进入裂解周期，使细胞死亡释放噬菌体。3.1 噬菌体的培养大部分实验室都使用cI突变的温度敏感突变体。cI基因可以使噬
12、菌体保持整合状态，突变后转变成溶菌性的。在cIts突变体中，cI基因在30C条件下正常表达，在42C时，不能正常表达，产生溶菌性。Induction of a clts lysogen（溶原菌）（溶原菌）by transferring from 30 to 42Lysogenic phageLysogenic phageAt 30 At 30,clts gene,clts gene protein works,Keep protein works,Keep lysogenylysogeny（溶原性）（溶原性）（溶原性）（溶原性）:At 42 At 42,clts gene,clts gene
13、protein does not protein does not work,produce work,produce extracellular phageextracellular phage（细胞外抗菌素）（细胞外抗菌素）（细胞外抗菌素）（细胞外抗菌素）.Achieving the right balance between culture age and inoculum size when preparing a sample of a non-lysogenic phageNon-lysogenic Non-lysogenic phage phage（Lytic)Lytic)由于缺
14、失修饰，大由于缺失修饰，大多数基因工程载体多数基因工程载体属于此类型。属于此类型。3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备3.3 收集噬菌体 噬菌体颗粒非常小，所以只有高速离心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可以收集噬菌体，重新溶解在少量的溶液中。3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备3.4 从噬菌体中纯化DNA PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌DNA。这些组成部分可以通过梯度离心去掉。除去CsCl后可以获得纯净的噬菌体。然后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。Collection of phage particles by polyethylene（聚乙烯）
15、（聚乙烯）glycol（乙二醇）（乙二醇）(PEG)precipitation Collection of phage particlesCollection of phage particlesPurification of phage Purification of phage particles by CsCl density gradient centrifugation.3.5 纯化M13 DNA 每ml菌液可以获得1012的噬菌体。这意味着少量的培养物可以获得大量的噬菌体，如5ml或更少。由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解物的问题，也不需要CsCl梯度离心。Preparation of M13 DNA from an infected culture of bacteria.Preparationof M13 DNANext chapNext Chap中国基因工程研究进展中国基因工程研究进展*The end！Thanks！测验一根据你的理解，回答以下三个问题。1、什么是基因工程技术？基因工程的意义何在？2、简要说明基因工程研究的基本步骤？3、谈谈你对基因工程技术未来的发展趋势及构想。