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1、第第十二十二章章色谱分析法色谱分析法一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法 的特点的特点二、流程及主要部件二、流程及主要部件三、三、影响分离的因素影响分离的因素四、四、高效液相色谱法高效液相色谱法 的主要分离类型的主要分离类型第第1 1节节高效液相色谱法高效液相色谱法2022/10/272022/10/27液相色谱仪（液相色谱仪（1）2022/10/272022/10/27液相色谱仪（液相色谱仪（2）2022/10/272022/10/27液相色谱仪（液相色谱仪（3）2022/10/272022/10/27液相色谱仪（液相色谱仪（4）2022/10/272022/10/27一、一、高效液相色谱法
2、的特点高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2022/10/272022/10/27二、流程及主要部件二、流程及主要部件2022/10/272022/10/27(1)(1)高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵 主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035010350105 5 PaPa。为为了了获获得得高高柱
3、柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（1010mm），液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，将将产产生生很很高高的的压压力力，因因此此高高压压、高高速是高效液相色谱的特点之一。速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2022/10/272022/10/27(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。混合后进入色谱柱。内梯度
4、内梯度内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,通过比例通过比例调节阀调节阀,将两种或多种不同将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。入高压泵中混合。2022/10/272022/10/27(3)进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：2022/10/272022/10/27(4)高效分离柱高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径1 16 6 mmmm，柱长柱长柱长柱长5
5、540 40 cmcm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2022/10/272022/10/27(5)高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器 紫外光度检测器（紫外光度检测器（UVUV）：）：最小检测量最小检测量1010-9-9gmLgmL-1-1，对流对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。最常用的检测器。2022/10/272022/10/27光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 光光光光电电电电二二二二极极
6、极极管管管管阵阵阵阵列列列列检检检检测测测测器器器器：10241024个个个个二二二二极极极极管管管管阵阵阵阵列列列列，各各各各检检检检测测测测特特特特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2022/10/272022/10/27三、三、影响分离的因素影响分离的因素 在在高高效效液液相相色色谱谱中中,速速率率方方程程中中的的分分子子扩扩散散项项B/UB/U较较小小，可以忽略不计，而只有两项，即：可以忽略不计，而只有两项，即：H=A+C uH=
7、A+C u 故液相色谱故液相色谱H-uH-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。2022/10/272022/10/271.影响分离的因素影响分离的因素流速流速 流速大于流速大于0.5 0.5 cm/scm/s时时,H Hu u曲线是一段斜率不大的直曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量很大。但在实际操作中，流量仍是
8、一个调整分离度和出峰时仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。间的重要可选择参数。2022/10/272022/10/272.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；选择短柱、细内径提高
9、分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。研制高效柱填料是一活跃领域。2022/10/272022/10/273.流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性 （1 1）可可可可显显显显著著著著改改改改变变变变组组组组分分分分分分分分离离离离状状状状况况况况的的的的流流流流动动动动相相相相选选选选择择择择在在在在液液液液相相相相色色色色谱谱谱谱中中中中显显显显得得得得特特特特别别别别重重重重要要要要。液液液液相相相相色色色色谱谱谱谱的的的的流流流流动动动动相相相相又又又又称称称称为为为为：淋淋淋淋洗洗洗洗液液液液，洗洗洗洗脱脱脱脱剂。剂。剂。剂。（2 2）亲亲亲亲水水水水性性性性固固固固定定定定液液液
10、液常常常常采采采采用用用用疏疏疏疏水水水水性性性性流流流流动动动动相相相相，即即即即流流流流动动动动相相相相的的的的极极极极性性性性小小小小于于于于固固固固定定定定相相相相的的的的极极极极性性性性，称称称称为为为为正正正正相相相相液液液液液液液液色色色色谱谱谱谱法法法法，极极极极性性性性柱柱柱柱也也也也称称称称正正正正相柱。相柱。相柱。相柱。（3 3）若若若若流流流流动动动动相相相相的的的的极极极极性性性性大大大大于于于于固固固固定定定定液液液液的的的的极极极极性性性性，则则则则称称称称为为为为反反反反相相相相液液液液液液液液色色色色谱谱谱谱，非非非非极极极极性性性性柱柱柱柱也也也也称称称称为
11、为为为反反反反相相相相柱柱柱柱。组组组组分分分分在在在在两两两两种种种种类类类类型型型型分分分分离离离离柱柱柱柱上上上上的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。2022/10/272022/10/27流动相组成流动相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度
12、淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采采采采用用用用二二二二元元元元或或或或多多多多元元元元组组组组合合合合溶溶溶溶剂剂剂剂作作作作为为为为流流流流动动动动相相相相可可可可以以以以灵灵灵灵活活活活调调调调节节节节流流流流动动动动相相相相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。的极
13、性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2022/10/272022/10/27选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：（1 1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2 2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而
14、使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。相等。相等。相等。（3 3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4 4）流动相同时还应满足
15、检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。2022/10/272022/10/27四、四、高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型1.1.1.1.吸附色谱（液吸附色谱（液吸附色谱（液吸附色谱（液-固吸附色谱）固吸附色谱）固吸附色谱）固吸附色谱）以以以以固固固固体体体体吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂为为为为固固固固定定定定相相相相，如如如如硅硅硅硅
16、胶胶胶胶、氧氧氧氧化化化化铝铝铝铝等等等等，较较较较常常常常使使使使用用用用的的的的是是是是5 51010mm的的的的硅硅硅硅胶胶胶胶吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂。流流流流动动动动相相相相可可可可以以以以是是是是各各各各种种种种不不不不同同同同极极极极性的一元或多元溶剂。性的一元或多元溶剂。性的一元或多元溶剂。性的一元或多元溶剂。2.2.2.2.分配色谱（液分配色谱（液分配色谱（液分配色谱（液-液分配色谱）液分配色谱）液分配色谱）液分配色谱）早早早早期期期期通通通通过过过过在在在在担担担担体体体体上上上上涂涂涂涂渍渍渍渍一一一一薄薄薄薄层层层层固固固固定定定定液液液液制制制制备备备备固固固固定定定
17、定相相相相,现现现现多多多多为为为为化化化化学学学学键键键键合合合合固固固固定定定定相相相相，即即即即用用用用化化化化学学学学反反反反应应应应的的的的方方方方法法法法通通通通过过过过化化化化学学学学键键键键将将将将固固固固定定定定液结合在担体表面。液结合在担体表面。液结合在担体表面。液结合在担体表面。2022/10/272022/10/273.3.离子交换色谱离子交换色谱 固固定定相相为为离离子子交交换换树树脂脂，流流动动相相为为无无机机酸酸或或无无机机碱碱的的水水溶溶液液。各各种种离离子子根根据据它它们们与与树树脂脂上上的的交交换换基基团团的的交交换能力的不同而得到分离。换能力的不同而得到分离。4.4.4.4.凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱（空间排阻色谱）（空间排阻色谱）以以凝凝胶胶为为固固定定相相。凝凝胶胶是是一一种种经经过过交交联联的的、具具有有立立体体网网状状结结构构和和不不同同孔孔径径的的多多聚聚体体的的通通称称。如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼脂脂糖糖等等软软质质凝凝胶胶；多多孔孔硅硅胶胶、聚聚苯苯乙乙烯烯凝凝胶胶等等硬硬质质凝凝胶；胶；2022/10/272022/10/27