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1、 细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法 （凝胶法）（凝胶法）苏州大学 卫生与环境技术研究所 细菌内毒素细菌内毒素v 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的产物细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的产物,它主它主要化学成分是脂多糖。细菌在生活状态下不会释放要化学成分是脂多糖。细菌在生活状态下不会释放出来，只有当细菌死亡后才会表现出毒性。出来，只有当细菌死亡后才会表现出毒性。v 内毒素为外源性内毒素为外源性热原热原物质，它可激活中性粒细物质，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。调节中枢引起发热。细菌内毒素的单位细菌内毒素的单位v
2、 EU称为称为“内毒素单位内毒素单位”,是专指内毒素的活性是专指内毒素的活性单位。单位。v IU 称为称为”国际单位国际单位”是经由国际协商规定出的是经由国际协商规定出的标准单位。标准单位。v 细菌内毒素的生物活性细菌内毒素的生物活性v 1、致热性。、致热性。2、致死性毒性。、致死性毒性。3、白细、白细胞减少。胞减少。4、激活凝血系统。、激活凝血系统。5、降低血压，、降低血压，休克。休克。6、Shwartzman反应。反应。7、刺激淋、刺激淋巴细胞有丝分裂，等等巴细胞有丝分裂，等等。细菌内毒素的耐热性细菌内毒素的耐热性v 细菌内毒素具很强的耐热性，一般的高压灭菌细菌内毒素具很强的耐热性，一般的
3、高压灭菌不能去除细菌内毒素，需不能去除细菌内毒素，需250至少至少30分钟以上的分钟以上的干热灭菌才能使其灭活干热灭菌才能使其灭活。实验用器具的处理实验用器具的处理 内毒素试验中使用的器皿都要经过处理去除可内毒素试验中使用的器皿都要经过处理去除可能存在的外源性内毒素。能存在的外源性内毒素。v 耐高温的玻璃器皿等置于电热干烤箱内耐高温的玻璃器皿等置于电热干烤箱内180干烤至少干烤至少2h或者或者250干烤至少干烤至少30分钟；分钟；v 塑料器皿置于塑料器皿置于30双氧水中浸泡双氧水中浸泡4h，再用细菌，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗，内毒素检查用水充分冲洗，60烘干备用。烘干备用。细菌内毒素与热
4、原的区别与联系细菌内毒素与热原的区别与联系v 热原包括细菌性热原、内源性高分子热原、内热原包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。源性低分子热原及化学热原等。v 一般来说内毒素是热原一般来说内毒素是热原,但热原不全是内毒素。但热原不全是内毒素。v 在药品生产质量管理规范（在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。细菌内毒素意味着不存在热原。细菌内毒素检查法概念细菌内毒素检查法概念v 本方法是利用鲎试剂检测由革兰氏阴性菌产本方法是利用鲎试剂检测由
5、革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查。细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法，由于凝胶法操作简法包括凝胶法和光度测定法，由于凝胶法操作简单快捷、灵敏度高，并且药典规定当不同试验方单快捷、灵敏度高，并且药典规定当不同试验方法的结果存在争议时，除另有规定外，以凝胶法法的结果存在争议时，除另有规定外，以凝胶法为准，所以凝胶法被广泛应用。为准，所以凝胶法被广泛应用。凝胶法概念凝胶法概念v 凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来
6、检测或半定量内毒素的方法。原理来检测或半定量内毒素的方法。凝胶法中用到的仪器和器皿 1.超净工作台超净工作台v 凝胶法中用到的仪器和器皿v2.恒温培养箱恒温培养箱 v孵育样品浸提液以及培养试验结果。孵育样品浸提液以及培养试验结果。凝胶法中用到的仪器和器皿v3.干烤箱干烤箱 v 用于实验用耐高温器皿的去热源，温度范围要求至少300凝胶法中用到的仪器和器皿v4.移液器和无热源的移液尖（或者去热源的刻度吸移液器和无热源的移液尖（或者去热源的刻度吸管）管）v 5.试管试管凝胶法中用到的试剂凝胶法中用到的试剂v 1）鲎试剂（由海洋生物）鲎试剂（由海洋生物鲎鲎的血液提取制成的冻的血液提取制成的冻干粉末）干
7、粉末）v 2）细菌内毒素工作品）细菌内毒素工作品v 3）细菌内毒素检查用水（内毒素含量小于的无）细菌内毒素检查用水（内毒素含量小于的无菌水）菌水）鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验v 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。复核试验。鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验v 根据鲎试剂灵敏度的标示值（根据鲎试剂灵敏度的标示值（）,将细菌内将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀涡混
8、合器上混匀15分钟分钟,然后制成然后制成2、1、和四个、和四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀合器上混匀30秒钟。秒钟。鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验v 取复溶后的支规格的鲎试剂原安瓿取复溶后的支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中支，其中16管分别加入不同浓度的内毒素标准溶液，每一个管分别加入不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做内毒素浓度平行做4管；另外管；另外2管各加入细菌内毒素管各加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照。检查用水作为阴性对照。v 将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放将试管中溶液轻轻混匀后，封
9、闭管口，垂直放入入371的适宜恒温器中，保温的适宜恒温器中，保温60分钟分钟2分钟。分钟。鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验v结果观察结果观察 v 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180时，若管内时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转成凝胶但倒转180后从管壁滑脱者为阴性。后从管壁滑脱者为阴性。v 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验v 若最大浓度管均为阳性，最低浓度
10、管均为阴性，若最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。计算阴性对照管为阴性，试验方为有效。计算反应终点反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（c），计算方法见中国药典。，计算方法见中国药典。v 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。后一个呈阳性结果的浓度。v 当当c在（包括和）时，方可用于细菌内毒素在（包括和）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。为该批鲎试剂的灵敏度。凝胶法的试验步骤凝胶法的试验步
11、骤v 下面我们结合中国药典下面我们结合中国药典2010、医用输液、输医用输液、输血、注射器具检验方法血、注射器具检验方法 以及以及GB 15810一次性无菌一次性无菌注射器注射器 来学习具体试验方法。来学习具体试验方法。实验步骤实验步骤v样品处理方法：样品处理方法：v a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（浸泡器具内腔，在（371）恒温箱中孵育不少恒温箱中孵育不少于于1h，取浸提液进行试验；，取浸提液进行试验；v b）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振荡数次，在内，加入
12、细菌内毒素检查用水振荡数次，在（371）恒温箱中孵育不少于恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进，取浸提液进行试验。行试验。v 制备的供试液储存不应该超过制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求。一般要求供试液的供试液的PH值在之间，如不在该范围内，可用鲎值在之间，如不在该范围内，可用鲎试剂厂家提供的试剂厂家提供的PH缓冲液调节浸提液的缓冲液调节浸提液的PH值。值。实验步骤实验步骤v 浸提介质（细菌内毒素检查用水）体积计算公示：浸提介质（细菌内毒素检查用水）体积计算公示：v V浸提介质体积，单位为（浸提介质体积，单位为（ml）；）；v L产品细菌内毒素限值（该产品允许含有的产品细菌内毒素限值（该产
13、品允许含有的细菌内毒素的量），单位为细菌内毒素的量），单位为EU/件；件；v 鲎试剂灵敏度的标示值，单位为鲎试剂灵敏度的标示值，单位为EU/ml。实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤v检测方法检测方法:1、A溶液：在注射器中抽取细菌内毒素检查用水至总刻度溶液：在注射器中抽取细菌内毒素检查用水至总刻度容量容量,放置放置37保温不少于保温不少于1小时。小时。2、复溶细菌内毒素工作品，得到浓度为、复溶细菌内毒素工作品，得到浓度为10EU/ml的工作的工作品溶液。品溶液。v 3、B溶液：用样品浸提液制备溶液：用样品浸提液制备1EU/ml浓度的样品阳性对浓度的样品阳性对照液。照液。4、C溶液：用检查用水制备
14、溶液：用检查用水制备1EU/ml浓度的内毒素溶液，浓度的内毒素溶液，作为阳性对照。作为阳性对照。v 5、加样反应，取、加样反应，取 8 支的鲎试剂，各加的细菌内毒素检查支的鲎试剂，各加的细菌内毒素检查用水复溶。然后分别加用水复溶。然后分别加A、B、C、D溶液，溶液，四种溶液各做两四种溶液各做两个平行管。个平行管。6、放到、放到37度水浴或恒温培养箱中反应度水浴或恒温培养箱中反应60分钟，观察结果。分钟，观察结果。结果观察结果观察 B、C溶液的反应管必须要阳性，就是轻轻倒转溶液的反应管必须要阳性，就是轻轻倒转180度过来，鲎试剂安瓿里的反应溶液形成了凝胶体，度过来，鲎试剂安瓿里的反应溶液形成了凝
15、胶体，不滑落。不滑落。而而D溶液，就是细菌内毒素检查用水那溶液，就是细菌内毒素检查用水那2管，管，必须要阴性，必须要阴性，3个条件都满足，就说明试验结果是可个条件都满足，就说明试验结果是可信的。最后看信的。最后看A溶液的反应情况：溶液的反应情况：v 阳性就说明原套器具每件大于阳性就说明原套器具每件大于20EU，判定为不，判定为不合格；合格；v 阴性就说明小于阴性就说明小于20EU,结果是合格的；结果是合格的；v 1管阳性、管阳性、1管阴性则要重新复查，复试时，溶管阴性则要重新复查，复试时，溶液液A需做需做4支平行管，若所有平行管均为阴性则判断支平行管，若所有平行管均为阴性则判断合格；否则判断为
16、不合格。合格；否则判断为不合格。注意事项注意事项v1.每批鲎试剂在用于试验前首先要进行灵敏度的每批鲎试剂在用于试验前首先要进行灵敏度的复核试验；复核试验；v 2.安瓿开启前应先用砂石划痕安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环不管是色点或包环易折安瓿易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。v3.在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应准确，缓缓加入避免气泡。应准确，缓缓加入避免气泡。v4.保温过程中不可随时取出观察，防止形成的凝胶保温过程中不可随时取出观察，防止形成的凝胶受到振动后变形而误判为阴性。受到振动后变形而误判为阴性。注意事项注意事项v5.冻干的鲎试剂应存放在冻干的鲎试剂应存放在2-8下；避免长时间放下；避免长时间放置在高于置在高于25的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放在歇使用过程中最好放在2-8的冰箱里，可存放的冰箱里，可存放24小时，在小时，在-20以下，可存放四个星期，鲎试剂只以下，可存放四个星期，鲎试剂只能冻融一次。能冻融一次。谢谢 谢谢鲎鲎v返回