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1、如何申请如何申请国家自然科学基金国家自然科学基金第一部分第一部分基金委面上项目基金委面上项目评审基本程序及重要环节评审基本程序及重要环节 初初 审：审：由各学科处组织实施。由各学科处组织实施。申请者不具备申请资格或违反有关规定；申请者不具备申请资格或违反有关规定；手续不完备或申请书不符合要求手续不完备或申请书不符合要求;内容不符合资助范围或超出资助能力内容不符合资助范围或超出资助能力;申请者以往资助项目执行不利。申请者以往资助项目执行不利。查查 重：重：由基金委信息中心组织实施。由基金委信息中心组织实施。高职申请与承担（含参加）面上、重点、重大高职申请与承担（含参加）面上、重点、重大高职申请与
2、承担（含参加）面上、重点、重大高职申请与承担（含参加）面上、重点、重大 累计不超过累计不超过累计不超过累计不超过3 3 3 3项；项；项；项；在职研究生不作为限项申请的条件但只可申请在职研究生不作为限项申请的条件但只可申请在职研究生不作为限项申请的条件但只可申请在职研究生不作为限项申请的条件但只可申请 面上项目；面上项目；面上项目；面上项目；申请者同期只能申请一项，每个项目申请者限申请者同期只能申请一项，每个项目申请者限申请者同期只能申请一项，每个项目申请者限申请者同期只能申请一项，每个项目申请者限 为一人为一人为一人为一人;高职申请者当年申请及承担的在研面上项目累高职申请者当年申请及承担的在
3、研面上项目累高职申请者当年申请及承担的在研面上项目累高职申请者当年申请及承担的在研面上项目累 计不超过计不超过计不超过计不超过3 3 3 3项项项项;不具有高职的申请者申请及负责的在研面上项不具有高职的申请者申请及负责的在研面上项不具有高职的申请者申请及负责的在研面上项不具有高职的申请者申请及负责的在研面上项 目不超过一项目不超过一项目不超过一项目不超过一项;青年基金只能获得一项资助。青年基金只能获得一项资助。青年基金只能获得一项资助。青年基金只能获得一项资助。同行评议（同行评议（一审）一审）：由基金委各学科处组织实施。由基金委各学科处组织实施。由基金委各学科处组织实施。由基金委各学科处组织实
4、施。基本程序：基本程序：每份申请书选择同行评议专家（每份申请书选择同行评议专家（每份申请书选择同行评议专家（每份申请书选择同行评议专家（5 5 5 5位）；位）；位）；位）；函请同行评议：对项目进行定性定量评价；函请同行评议：对项目进行定性定量评价；函请同行评议：对项目进行定性定量评价；函请同行评议：对项目进行定性定量评价；收回评议卡；收回评议卡；收回评议卡；收回评议卡；对定量部分进行计算机判读、打分、排序；对定量部分进行计算机判读、打分、排序；对定量部分进行计算机判读、打分、排序；对定量部分进行计算机判读、打分、排序；据学科资助项目数据学科资助项目数据学科资助项目数据学科资助项目数13013
5、0130130确定第二轮评审项目。确定第二轮评审项目。确定第二轮评审项目。确定第二轮评审项目。专家评审组或专业委员会评审（二审）。专家评审组或专业委员会评审（二审）。主要对一审推荐项目进行评议，筛除主要对一审推荐项目进行评议，筛除主要对一审推荐项目进行评议，筛除主要对一审推荐项目进行评议，筛除 30303030。再次对二审会确定资助项目进行审查：再次对二审会确定资助项目进行审查：进一步查重；进一步查重；以往承担项目是否按期完成；以往承担项目是否按期完成；是否有违反基金委有关申请规定。是否有违反基金委有关申请规定。基金委员会委务会审议。基金委员会委务会审议。下发批准、未批准通知。下发批准、未批准
6、通知。第二部分第二部分 如何撰写国家自然科学基金如何撰写国家自然科学基金申请书申请书一、摘一、摘 要（限要（限400400字）字）包括：包括：研究方法、内容、目标、科学意义等研究方法、内容、目标、科学意义等 如：如：“用用方法（手段）进行方法（手段）进行研究，探索研究，探索/证证明明问题，对阐明问题，对阐明机制机制 揭示揭示规律有重要意规律有重要意义，为义，为奠定基础提供奠定基础提供思路思路”探索肺炎探索肺炎链球菌感受球菌感受态形成形成对毒力表达的影响毒力表达的影响 细菌在自然状菌在自然状态下可下可获得感受得感受态而而发生生转化，化，这种基因重种基因重组方式是方式是许多重要生命多重要生命现象和
7、生命象和生命过程的起始和源程的起始和源头。本研究通本研究通过插插入复制失活或替代失活的方法，构建肺炎入复制失活或替代失活的方法，构建肺炎链球菌感受球菌感受态缺陷菌株，用体内缺陷菌株，用体内环境信号境信号探探讨肺炎球肺炎球菌的致病是否与其感受菌的致病是否与其感受态的形成和的形成和转化有关。化有关。为揭示揭示转化化过程程对于肺炎于肺炎链球菌球菌致病能力的影响机制提供理致病能力的影响机制提供理论依据。依据。二、立论依据二、立论依据对对基基础础研研究究，着着重重结结合合国国际际科科学学发发展展趋趋势势，论论述述项目科学意义项目科学意义 对对应应用用基基础础研研究究，着着重重结结合合学学科科前前沿沿，围
8、围绕绕国国民民经经济济和和社社会会发发展展中中的的重重要要科科技技问问题题论论述述其其应应用用前景前景在研究领域（疾病防治）层面在研究领域（疾病防治）层面从研究方向展开从研究方向展开围绕本项目拟解决的问题围绕本项目拟解决的问题进行归纳分析进行归纳分析提出设想提出设想从研究领域从研究领域（疾病防治）（疾病防治）切入切入研究意义研究意义立论依据立论依据1 1、项目的研究意义、项目的研究意义 存在问题：存在问题：存在问题：存在问题：对科学意义阐述不足或夸大。对科学意义阐述不足或夸大。对科学意义阐述不足或夸大。对科学意义阐述不足或夸大。撰写方法：撰写方法：撰写方法：撰写方法：从疾病入手，简述其特点、危
9、害，目前从疾病入手，简述其特点、危害，目前从疾病入手，简述其特点、危害，目前从疾病入手，简述其特点、危害，目前 主要的治疗方法及其存在的问题。主要的治疗方法及其存在的问题。主要的治疗方法及其存在的问题。主要的治疗方法及其存在的问题。简要分析该病发病机理和主要研究热点，引出目前存简要分析该病发病机理和主要研究热点，引出目前存简要分析该病发病机理和主要研究热点，引出目前存简要分析该病发病机理和主要研究热点，引出目前存在的主要问题，也就是本项目要解决的问题，以此为切在的主要问题，也就是本项目要解决的问题，以此为切在的主要问题，也就是本项目要解决的问题，以此为切在的主要问题，也就是本项目要解决的问题，
10、以此为切入点提出假设，阐述如果实现预期目标，对该病甚至相入点提出假设，阐述如果实现预期目标，对该病甚至相入点提出假设，阐述如果实现预期目标，对该病甚至相入点提出假设，阐述如果实现预期目标，对该病甚至相关疾病的预防、治疗具有的理论意义和临床价值。关疾病的预防、治疗具有的理论意义和临床价值。关疾病的预防、治疗具有的理论意义和临床价值。关疾病的预防、治疗具有的理论意义和临床价值。基基因因的的转转移移，是是基基因因重重组组最最原原始始的的方方式式。我我们们可可以以从从肿肿瘤瘤组组织织中中找找到到病病毒毒的的基基因因，也也可可以以发发现现某某些些病病原原体体的的DNADNA在在不不同同宿宿主主之之间间的
11、的传传递递过过程程中中发发生生着着变变异异，例例如如耐耐药药性性在在细细菌菌中中的的传传播播，这这都都是是自自然然界界中中普普遍遍存存在在的的基基因因转转移移现现象象。而而细细菌菌基基因因的的转转移移包包括括结结合合（conjugationconjugation）、转转导导（transductiontransduction）、融融合合（fusionfusion）及及转转化化（transformationtransformation）四种方式，我们这里所要讨论的是转化。四种方式，我们这里所要讨论的是转化。什么叫做转化呢？它是指细菌在一定状态（感什么叫做转化呢？它是指细菌在一定状态（感什么叫做转化
12、呢？它是指细菌在一定状态（感什么叫做转化呢？它是指细菌在一定状态（感受态受态受态受态-指细菌能够摄取外来游离或质粒指细菌能够摄取外来游离或质粒指细菌能够摄取外来游离或质粒指细菌能够摄取外来游离或质粒DNADNADNADNA的一种状的一种状的一种状的一种状态，它可以在实验室中诱导产生，也可发生于细菌态，它可以在实验室中诱导产生，也可发生于细菌态，它可以在实验室中诱导产生，也可发生于细菌态，它可以在实验室中诱导产生，也可发生于细菌自然生长的某一阶段）下摄取外来自然生长的某一阶段）下摄取外来自然生长的某一阶段）下摄取外来自然生长的某一阶段）下摄取外来DNADNADNADNA的过程。的过程。的过程。的
13、过程。已发已发已发已发现有五种细菌可以在自然状态下产生感受态而发生现有五种细菌可以在自然状态下产生感受态而发生现有五种细菌可以在自然状态下产生感受态而发生现有五种细菌可以在自然状态下产生感受态而发生转化：转化：转化：转化：肺炎链球菌，肺炎链球菌，肺炎链球菌，肺炎链球菌，S.pn)S.pn)S.pn)S.pn)、枯草杆菌（）、流感嗜、枯草杆菌（）、流感嗜、枯草杆菌（）、流感嗜、枯草杆菌（）、流感嗜血杆菌（）、血链球菌（）和淋病奈瑟氏菌血杆菌（）、血链球菌（）和淋病奈瑟氏菌血杆菌（）、血链球菌（）和淋病奈瑟氏菌血杆菌（）、血链球菌（）和淋病奈瑟氏菌（N.gonorrhea N.gonorrhea
14、N.gonorrhea N.gonorrhea），），），），其中肺炎链球菌的转化效率最其中肺炎链球菌的转化效率最其中肺炎链球菌的转化效率最其中肺炎链球菌的转化效率最高高高高,转化的结果是细菌的遗传特征发生变化，表现出转化的结果是细菌的遗传特征发生变化，表现出转化的结果是细菌的遗传特征发生变化，表现出转化的结果是细菌的遗传特征发生变化，表现出与亲代不同的遗传性状。与亲代不同的遗传性状。与亲代不同的遗传性状。与亲代不同的遗传性状。1928 1928年年GriffthGriffth发现了肺炎链球菌发现了肺炎链球菌(S.(S.pneumoniae)pneumoniae)荚膜转化的现象，荚膜转化的现象
15、，19441944年年AreryArery等证实了转化物的化学本质是等证实了转化物的化学本质是DNADNA，证明生命，证明生命的遗传物质是的遗传物质是DNADNA。细菌转化不仅是许多重要细菌转化不仅是许多重要生命现象的起始和源头，转化机理的研究也生命现象的起始和源头，转化机理的研究也一直是生命科学中一个非常重要的问题。一直是生命科学中一个非常重要的问题。本本研究从肺炎链球菌的转化入手来探讨其对细研究从肺炎链球菌的转化入手来探讨其对细菌毒力表达的影响。菌毒力表达的影响。尽管肺炎链球菌的转化机制尚不十分清尽管肺炎链球菌的转化机制尚不十分清楚，楚，但其过程大致可分为但其过程大致可分为6 6个阶段：个
16、阶段：1 1）肺炎）肺炎链球菌被诱导成为感受态；链球菌被诱导成为感受态；2 2）外来）外来DNADNA吸附吸附于细菌壁上；于细菌壁上；3 3）核酸酶与外来）核酸酶与外来DNADNA结合；结合；4 4）核酸酶降解其中一条链，使之成为单链核酸酶降解其中一条链，使之成为单链（ssDNAssDNA）；）；5 5）ssDNAssDNA被摄入细菌胞内被摄入细菌胞内6 6）进）进入细胞内的入细胞内的ssDNAssDNA以同源重组的方式整合于肺以同源重组的方式整合于肺炎链球菌的染色体上。炎链球菌的染色体上。肺炎链球菌作为一种肺炎链球菌作为一种自然界广泛存在自然界广泛存在的致的致病菌，肺炎链球菌可引起脑膜炎、中
17、耳炎、鼻病菌，肺炎链球菌可引起脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎和败血症等疾病。窦炎和败血症等疾病。在在7070年代，未经治疗肺年代，未经治疗肺炎球菌感染死亡率为炎球菌感染死亡率为30-35%30-35%11，经几十年的研，经几十年的研究，其感染引起的菌血症死亡率仍高达究，其感染引起的菌血症死亡率仍高达25-25-30%30%22。抗生素的应用由于耐药菌的迅速增加而。抗生素的应用由于耐药菌的迅速增加而越来越失去治疗价值。而最新的肺炎链球菌多越来越失去治疗价值。而最新的肺炎链球菌多价结合疫苗的特异性和有效性远远未达到令人价结合疫苗的特异性和有效性远远未达到令人满意的程度满意的程度33。寻找体内新的毒力基因，
18、揭示寻找体内新的毒力基因，揭示肺炎球菌致病机理，才能从根本上解决其感染肺炎球菌致病机理，才能从根本上解决其感染的治疗问题。的治疗问题。2 2、国内外现状分析（综述）、国内外现状分析（综述）存在问题：存在问题：存在问题：存在问题：文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，提出的问题别人已解决提出的问题别人已解决提出的问题别人已解决提出的问题别人已解决-低水平重复低水平重复低水平重复低水平重复。对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用，对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用，对研究方
19、法不熟悉，简单移植或夸大其作用，对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用，缺乏实际应用的可行性缺乏实际应用的可行性缺乏实际应用的可行性缺乏实际应用的可行性-无法实现预期目标无法实现预期目标无法实现预期目标无法实现预期目标。对国内外现状只是简单罗列，缺乏归纳分析，对国内外现状只是简单罗列，缺乏归纳分析，对国内外现状只是简单罗列，缺乏归纳分析，对国内外现状只是简单罗列，缺乏归纳分析，缺乏逻辑性和针对性缺乏逻辑性和针对性缺乏逻辑性和针对性缺乏逻辑性和针对性-总结与表达不够总结与表达不够总结与表达不够总结与表达不够。(撰写方法：要撰写方法：要紧紧围绕紧紧围绕本次申请项目的主题。本次申请项目的主题。1、从
20、疾病切入，、从疾病切入，简要论述简要论述国内外研究成果，国内外研究成果，并引出当前的热点研究方向。并引出当前的热点研究方向。2、从研究方向展开，、从研究方向展开，较详细地分析较详细地分析国内外在国内外在本方向的研究进展，引出阐明疾病发病机理或发明本方向的研究进展，引出阐明疾病发病机理或发明新的治疗方法的新的治疗方法的关键问题关键问题所在。所在。3、围绕关键问题，、围绕关键问题，详细论述详细论述国内外以往的研国内外以往的研究结果、当前的现状及今后的发展趋势。综合分析究结果、当前的现状及今后的发展趋势。综合分析后提出后提出目前尚未解决的问题目前尚未解决的问题。4 4 4 4、对拟采用的技术方法进行
21、介绍和分析。、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究的依据。的依据。的依据。的依据。新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究的理论依据和实验依据。的理论依据和实验依据。的理论依据和实验依据。的理论依据和实
22、验依据。要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清楚，绝不能是一种简单的移植。楚，绝不能是一种简单的移植。楚，绝不能是一种简单的移植。楚，绝不能是一种简单的移植。例如：蛋白质的融合表达，理论上可以实现融合，例如：蛋白质的融合表达，理论上可以实现融合，例如：蛋白质的融
23、合表达，理论上可以实现融合，例如：蛋白质的融合表达，理论上可以实现融合，但存在但存在但存在但存在“活性、表达载体选择、纯化活性、表达载体选择、纯化活性、表达载体选择、纯化活性、表达载体选择、纯化”等问题。等问题。等问题。等问题。5 5 5 5、提出本项目的研究设想。、提出本项目的研究设想。、提出本项目的研究设想。、提出本项目的研究设想。肺炎链球菌在正常情况下并不致病，肺炎链球菌在正常情况下并不致病，40%40%的的健康人咽喉部都有寄生健康人咽喉部都有寄生22，其只是在一定条件下，其只是在一定条件下引起疾病，如病毒引起上呼吸道感染时、小儿高引起疾病，如病毒引起上呼吸道感染时、小儿高烧时常转为肺炎
24、。已经肯定环境信号控制着细菌烧时常转为肺炎。已经肯定环境信号控制着细菌毒力基因表达毒力基因表达44。问题是肺炎链球菌致病是否与问题是肺炎链球菌致病是否与环境因素诱导其感受态的形成和转化有关？从我环境因素诱导其感受态的形成和转化有关？从我们目前掌握的资料来看，国内外尚未见到类似报们目前掌握的资料来看，国内外尚未见到类似报道或想法。道或想法。目前对肺炎链球菌转化机理的研究概况：操目前对肺炎链球菌转化机理的研究概况：操纵子纵子comCDEcomCDE为多种环境因素如为多种环境因素如CaCa2+2+、O O2 2浓度、生浓度、生长阶段、细菌密度等调节其感受态发生的唯一共长阶段、细菌密度等调节其感受态发
25、生的唯一共同调控点同调控点55，6 6，77，也是肺炎链球菌控制许多蛋白，也是肺炎链球菌控制许多蛋白质基因表达的开关质基因表达的开关88。而已。而已有文献报道当进入感有文献报道当进入感受态后，可启动一些蛋白包括自溶素的表达受态后，可启动一些蛋白包括自溶素的表达99，而自溶素是的一种比较重要的毒力因子而自溶素是的一种比较重要的毒力因子,当其被当其被激活后可释放细胞壁毒力因子和溶血素；最新研激活后可释放细胞壁毒力因子和溶血素；最新研究发现，有三个可被感受态刺激蛋白（究发现，有三个可被感受态刺激蛋白（CspCsp）诱）诱导表达的蛋白基因变异时，肺炎链球菌的毒力减导表达的蛋白基因变异时，肺炎链球菌的毒
26、力减弱弱1010。根据以上研究背景，根据以上研究背景，我们的研究思路为：我们的研究思路为：采用插入失活的手段，分别使基因采用插入失活的手段，分别使基因comCcomC、D D、E E失活，从而构建一系列感受态缺陷菌株。通过失活，从而构建一系列感受态缺陷菌株。通过体内毒力实验及体外粘附实验比较其与野生菌体内毒力实验及体外粘附实验比较其与野生菌株的致病能力，以确定自然条件下形成的感受株的致病能力，以确定自然条件下形成的感受态与细菌致病的关系。态与细菌致病的关系。本研究从转化过程中感受态的形成方面探本研究从转化过程中感受态的形成方面探讨其对肺炎链球菌毒力影响，讨其对肺炎链球菌毒力影响，意义在于意义在
27、于:1.1.由于感受态的发生与细菌多种蛋白的表达调控由于感受态的发生与细菌多种蛋白的表达调控有关，而其形成与多种环境因素相关，因此本有关，而其形成与多种环境因素相关，因此本课题为从体内研究环境因素对于肺炎链球菌致课题为从体内研究环境因素对于肺炎链球菌致病性的影响开辟了一条新的途径。病性的影响开辟了一条新的途径。2.2.同时感受态的形成可引起细菌发生转化，可能同时感受态的形成可引起细菌发生转化，可能会导致外源基因的整合，使肺炎链球菌的生物会导致外源基因的整合，使肺炎链球菌的生物性状发生改变，这也可能与其致病相关，本研性状发生改变，这也可能与其致病相关，本研究探讨转化过程对于肺炎链球菌致病能力的影
28、究探讨转化过程对于肺炎链球菌致病能力的影响，为进一步深入理解细菌的致病机理提供新响，为进一步深入理解细菌的致病机理提供新的依据。的依据。注意事项注意事项 注意逻辑性和层次感，并随时点题。注意逻辑性和层次感，并随时点题。文字表达要精雕细琢，避免假大空。文字表达要精雕细琢，避免假大空。参考文献必须提供作者全名、出处。参考文献必须提供作者全名、出处。参考文献必须引用近年的文献。参考文献必须引用近年的文献。要注意参考国内相关专业知名专家的论著。要注意参考国内相关专业知名专家的论著。文献回顾不能回避国内外最新研究进展。文献回顾不能回避国内外最新研究进展。三、研究方案三、研究方案 1 1、研究目标、研究目
29、标 存在问题：存在问题：存在问题：存在问题：目标过大目标过大目标过大目标过大 撰写要求：撰写要求：撰写要求：撰写要求：有限目标，与研究内容相呼应有限目标，与研究内容相呼应有限目标，与研究内容相呼应有限目标，与研究内容相呼应 如：探索如：探索如：探索如：探索问题，明确问题，明确问题，明确问题，明确关系，揭示关系，揭示关系，揭示关系，揭示规律，规律，规律，规律，阐明阐明阐明阐明原理（机制），建立原理（机制），建立原理（机制），建立原理（机制），建立方法等方法等方法等方法等 本研究的目标是：本研究的目标是：探探讨讨的的感感受受态态发发生生是是否否与与其其致致病病相相关关，重重点点阐明阐明:1 1）体
30、体内内环环境境是是否否诱诱导导的的转转化化过过程程（感感受受态态的的发生）。发生）。2 2）毒毒力力因因子子的的表表达达是是否否与与体体内内环环境境诱诱导导细细菌菌感受态形成与转化过程相关。感受态形成与转化过程相关。2 2、研究内容：、研究内容：存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成；存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成；存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成；存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成；内容分散，不能集中阐明研究目标。内容分散，不能集中阐明研究目标。内容分散，不能集中阐明研究目标。内容分散，不能集中阐明研究目标。撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成；撰写要求：内容要
31、适当，确保研究周期内完成；撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成；撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成；与目标相辅相成，为研究目标服务。与目标相辅相成，为研究目标服务。与目标相辅相成，为研究目标服务。与目标相辅相成，为研究目标服务。篇幅要适度，注意与技术路线区别。篇幅要适度，注意与技术路线区别。篇幅要适度，注意与技术路线区别。篇幅要适度，注意与技术路线区别。确定研究目标、内容的依据：确定研究目标、内容的依据：确定研究目标、内容的依据：确定研究目标、内容的依据：回答一个科学问题；回答一个科学问题；回答一个科学问题；回答一个科学问题；根据研究周期、资助强度来确定。根据研究周期、资助强度来确定
32、。根据研究周期、资助强度来确定。根据研究周期、资助强度来确定。研究内容研究内容(一一)：通过的操纵子：通过的操纵子comCDEcomCDE的基因的基因失活及体外转化实验得到感受态缺陷的菌株失活及体外转化实验得到感受态缺陷的菌株。1.分别设计的基因分别设计的基因comCcomC、comDcomD、comEcomE的中游的中游PCRPCR引物，构建含有的引物，构建含有的comCcomC、comDcomD、comEcomE中游基因序中游基因序列的列的pEVP3pEVP3质粒。质粒。2.2.将将构构建建的的pEVP3pEVP3质质粒粒转转化化得得到到感感受受态态缺缺陷陷菌菌，并通过体外转化实验以确定其
33、感受态缺陷。并通过体外转化实验以确定其感受态缺陷。研究内容研究内容研究内容研究内容(二二二二)：构建可被荧光报告是否发生感受态：构建可被荧光报告是否发生感受态：构建可被荧光报告是否发生感受态：构建可被荧光报告是否发生感受态的菌株。（的菌株。（的菌株。（的菌株。（cinAcinAcinAcinA是感受态发生之后表达的蛋白基因，是感受态发生之后表达的蛋白基因，是感受态发生之后表达的蛋白基因，是感受态发生之后表达的蛋白基因，与外源基因的同源重组有关，因此将荧光蛋白基因与外源基因的同源重组有关，因此将荧光蛋白基因与外源基因的同源重组有关，因此将荧光蛋白基因与外源基因的同源重组有关，因此将荧光蛋白基因接
34、于其后，荧光表达可报告感受态的发生）接于其后，荧光表达可报告感受态的发生）接于其后，荧光表达可报告感受态的发生）接于其后，荧光表达可报告感受态的发生）1)1)1)1)将绿色荧光蛋白（将绿色荧光蛋白（将绿色荧光蛋白（将绿色荧光蛋白（gfpgfpgfpgfp）基因替代）基因替代）基因替代）基因替代pEVP3pEVP3pEVP3pEVP3质粒中的质粒中的质粒中的质粒中的LacZLacZLacZLacZ基因，得到荧光报告质粒。基因，得到荧光报告质粒。基因，得到荧光报告质粒。基因，得到荧光报告质粒。2)2)2)2)设设设设计计计计的的的的cinAcinAcinAcinA基基基基因因因因下下下下游游游游的
35、的的的PCRPCRPCRPCR引引引引物物物物，构构构构建建建建含含含含有有有有cinAcinAcinAcinA基基基基因因因因下下下下游游游游序序序序列列列列的的的的荧荧荧荧光光光光质质质质粒粒粒粒(pEVP4)(pEVP4)(pEVP4)(pEVP4)。将将将将pEVP4pEVP4pEVP4pEVP4质质质质粒粒粒粒转转转转化感受化感受化感受化感受态态态态缺陷和非缺陷的，得到缺陷和非缺陷的，得到缺陷和非缺陷的，得到缺陷和非缺陷的，得到转转转转化菌株。化菌株。化菌株。化菌株。研研究究内内容容(三三)：体体外外转转化化实实验验以以验验证证感感受受态态缺缺陷陷菌菌不不能能发发生生转转化化，且且荧
36、荧光光表表达达的的确确可可报报告感受态的发生。告感受态的发生。1)1)做做体体外外转转化化实实验验，验验证证所所构构建建的的菌菌株株能能被被荧荧光光表表达达报报告告感感受受态态的的发发生生，且且感感受受态态缺缺陷菌不能发生转化。陷菌不能发生转化。2)2)检检测测基基因因comC、D、E的的表表达达情情况况，进进一一步佐证所构建的菌株为需要的菌株。步佐证所构建的菌株为需要的菌株。研研研研究究究究内内内内容容容容(四四四四)：通通通通过过过过感感感感受受受受态态态态缺缺缺缺陷陷陷陷和和和和非非非非缺缺缺缺陷陷陷陷菌菌菌菌的的的的粘粘粘粘附附附附实实实实验验验验及及及及体体体体内内内内毒毒毒毒力力力
37、力实实实实验验验验分分分分析析析析细细细细菌菌菌菌的的的的感感感感受受受受态态态态发发发发生生生生是是是是否否否否与与与与其致病毒力相关。其致病毒力相关。其致病毒力相关。其致病毒力相关。1)1)1)1)分分分分别别别别用用用用感感感感受受受受态态态态缺缺缺缺陷陷陷陷和和和和非非非非缺缺缺缺陷陷陷陷菌菌菌菌处处处处理理理理A A A A549549549549细细细细胞胞胞胞,观察二者处理后细胞粘附的菌落的多少变化。观察二者处理后细胞粘附的菌落的多少变化。观察二者处理后细胞粘附的菌落的多少变化。观察二者处理后细胞粘附的菌落的多少变化。2)2)2)2)分分分分别别别别将将将将感感感感受受受受态态态
38、态缺缺缺缺陷陷陷陷和和和和非非非非缺缺缺缺陷陷陷陷菌菌菌菌注注注注射射射射入入入入BALB/ctBALB/ctBALB/ctBALB/ct小鼠体内，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。小鼠体内，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。小鼠体内，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。小鼠体内，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。3)3)3)3)分别将感受态缺陷和非缺陷菌滴入分别将感受态缺陷和非缺陷菌滴入分别将感受态缺陷和非缺陷菌滴入分别将感受态缺陷和非缺陷菌滴入QSQSQSQS小鼠的鼻黏小鼠的鼻黏小鼠的鼻黏小鼠的鼻黏膜上，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。膜上，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。膜上，观察二者
39、感染小鼠的致死率是否不同。膜上，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。研研究究内内容容(五五)：检检测测感感受受态态缺缺陷陷及及非非缺缺陷陷菌菌基基因因comCcomC、D D、E E在在体体外外和和体体内内的的表表达达情情况况，以以进进一一步步验验证证细细菌菌毒毒力力的的改改变变是是否否与与其其感感受受态的形成有关。态的形成有关。1)1)1)1)合合合合 成成成成 基基基基 因因因因 comCcomCcomCcomC、D D D D、E E E E的的的的 探探探探 针针针针，做做做做 northern northern northern northern blotblotblotblot。2
40、2 2 2）制备基因）制备基因）制备基因）制备基因comCcomCcomCcomC、D D D D、E E E E蛋白的抗体，做蛋白的抗体，做蛋白的抗体，做蛋白的抗体，做western western western western blotblotblotblot。3 3、拟解决的关键问题：、拟解决的关键问题：存在问题：未能抓住关键问题或抓得不准。存在问题：未能抓住关键问题或抓得不准。存在问题：未能抓住关键问题或抓得不准。存在问题：未能抓住关键问题或抓得不准。撰写要求：找出关键问题，写出解决办法。撰写要求：找出关键问题，写出解决办法。撰写要求：找出关键问题，写出解决办法。撰写要求：找出关键问
41、题，写出解决办法。什么是关键问题什么是关键问题什么是关键问题什么是关键问题？-研究过程中对达预期目标有重要影响的研究过程中对达预期目标有重要影响的研究过程中对达预期目标有重要影响的研究过程中对达预期目标有重要影响的 某些研究内容或因素。某些研究内容或因素。某些研究内容或因素。某些研究内容或因素。-为达预期目标所必须掌握的关键技术或为达预期目标所必须掌握的关键技术或为达预期目标所必须掌握的关键技术或为达预期目标所必须掌握的关键技术或 研究手段。研究手段。研究手段。研究手段。4 4、研究方法、研究方法 存在问题：存在问题：存在问题：存在问题：过于简单：在实验方案中只有方法名称而无具体步骤。过于简单
42、：在实验方案中只有方法名称而无具体步骤。过于简单：在实验方案中只有方法名称而无具体步骤。过于简单：在实验方案中只有方法名称而无具体步骤。过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。撰写要求：撰写要求：撰写要求：撰写要求：以研究项目的需求为前提，尽量采用目前以研究项目的需求为前提，尽量采用目前以研究项目的需求为前提，尽量采用目前以研究项目的需求为前提，尽量采用目前 最先进的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体最先进的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体最先进的方法和手段，并将其操作步骤
43、和关键环节体最先进的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体 现在技术路线当中。现在技术路线当中。现在技术路线当中。现在技术路线当中。5 5、技术路线、技术路线 存在问题：存在问题：存在问题：存在问题：不清楚，不详细。不清楚，不详细。不清楚，不详细。不清楚，不详细。撰写要求：撰写要求：撰写要求：撰写要求：清晰、详细、注意逻辑性。清晰、详细、注意逻辑性。清晰、详细、注意逻辑性。清晰、详细、注意逻辑性。撰写方法：撰写方法：撰写方法：撰写方法：以时间顺序为主线设计技术路线以时间顺序为主线设计技术路线以时间顺序为主线设计技术路线以时间顺序为主线设计技术路线以研究内容为主线设计技术路线以研究内容为主线设计
44、技术路线以研究内容为主线设计技术路线以研究内容为主线设计技术路线分大小标题，突出逻辑关系。分大小标题，突出逻辑关系。分大小标题，突出逻辑关系。分大小标题，突出逻辑关系。详细地写清楚每个具体步骤。详细地写清楚每个具体步骤。详细地写清楚每个具体步骤。详细地写清楚每个具体步骤。6 6、可行性分析、可行性分析 理论分析理论分析理论分析理论分析 研究手段、方法分析研究手段、方法分析研究手段、方法分析研究手段、方法分析 预实验结果分析预实验结果分析预实验结果分析预实验结果分析 所用特殊实验材料（试剂）的分析所用特殊实验材料（试剂）的分析所用特殊实验材料（试剂）的分析所用特殊实验材料（试剂）的分析 对所具备
45、的实验条件进行分析对所具备的实验条件进行分析对所具备的实验条件进行分析对所具备的实验条件进行分析 对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析 CP1250CP1250肺肺炎炎链链球球菌菌及及质质粒粒pEVP3pEVP3由由MorrisonMorrison教教授授赠赠送送，人人肺肺癌癌上上皮皮A A549549细细胞胞已已从从中中科科院院上上海海细细胞胞所所购购得得，流流式式细细胞胞仪仪荧荧光光记记数数测测定定在在我我校校儿儿童童医医院院完完成成，PCRPCR引引物物由由
46、北北京京赛赛北北盛盛生生物物有有限限公公司司合成。合成。研究发现，肺炎链球菌在感受态产生后可使研究发现，肺炎链球菌在感受态产生后可使一些蛋白表达，其中包括自溶素，这表明其感受一些蛋白表达，其中包括自溶素，这表明其感受态的产生与细菌毒力的改变相关，因此研究转化态的产生与细菌毒力的改变相关，因此研究转化过程与细菌致病之间的关系是有事实基础的。过程与细菌致病之间的关系是有事实基础的。目目前前的的研研究究表表明明肺肺炎炎链链球球菌菌的的感感受受态态形形成成都都受受到到操操纵纵子子comCDEcomCDE的的调调控控，因因此此失失活活基基因因comCcomC或或comDcomD或或comEcomE可可使
47、使菌菌株株不不能能产产生生感感受受态态，已已有有通通过过失失活活这这几几种种基基因因构构建建感感受受态态缺缺陷陷菌菌株株的的文文献献报报道道。cinAcinA为为转转化化相相关关基基因因，因因此此用用它它为为报报告告基基因因以以确确定定肺肺炎炎链链球球菌菌在在体体内内是是否否发发生生感感受受态态，已已有有构构建建cinA-LacZcinA-LacZ融合基因菌株的报道。融合基因菌株的报道。本本实实验验室室已已掌掌握握肺肺炎炎链链球球菌菌体体外外转转化化的的方方法法，而而粘粘附附及及毒毒力力实实验验的的方方法法已已有有多多篇篇报报道道。因因此此本本研研究究的的技技术术路路线线从从理理论论上上讲讲是
48、是合合理理的的，而而方方法法是是成熟的。成熟的。7 7、创新性、创新性 对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。原始创新：原始创新：原始创新：原始创新：填补空白或修改传统的理论；填补空白或修改传统的理论；填补空白或修改传统的理论；填补空白或修改传统的理论；新技术、新方法的发明创造。新技术、新方法的发明创造。新技术、新方法的发明创造。新技术、新方法的发明创造。跟踪创新：跟踪创新：跟踪创新：跟踪创新：在前人工作基础上补充、完善现有理论；在前人工作基础上补充、完善现
49、有理论；在前人工作基础上补充、完善现有理论；在前人工作基础上补充、完善现有理论；对原有技术、方法进行修改后产生对原有技术、方法进行修改后产生对原有技术、方法进行修改后产生对原有技术、方法进行修改后产生1 1 1 11 1 1 12 2 2 2的的的的 效果。效果。效果。效果。细细菌菌在在宿宿主主体体内内是是处处于于一一个个生生存存竞竞争争的的战战场场，其其是是否否致致病病取取决决于于机机体体内内环环境境与与细细菌菌相相互互斗斗争争、相相互互适适应应的的结结果果。在在体体内内寻寻找找细细菌菌毒毒力力因因子子的的表表达达是是目目前前研研究究病病原原菌菌致致病病机机理理的的热热点点。细细菌菌致致病病
50、机机理理已已研研究究多多年年，由由环环境境信信号号诱诱导导细细菌菌感感受受态态形形成成影影响响毒毒力力表表达达的的路路线线，国国外外鲜鲜见见报报道道。本本研研究究从从缺缺失失肺肺炎炎链链球球菌菌感感受受态态形形成成的的关关健健环环节节comCcomC、D D、E E基基因因入入手手，深深入入探探讨讨环环境境信信号号、细细菌菌转转化化过过程程与与毒毒力力表表达达的的关关系系，这这是是该该项项研研究究的的特特色色和和创创新新之处。通过本项研究可完成：之处。通过本项研究可完成：1 1）分分析析肺肺炎炎链链球球菌菌感感受受态态的的形形成成是是否否受受到到comCDEcomCDE操纵子调控。操纵子调控。