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1、现代生物工程制药专题2浅谈基因工程药物浅谈基因工程药物酵母酵母表达系表达系统统高效表达调控研究进展高效表达调控研究进展 主要内容主要内容l基因工程药物基因工程药物 l酵母表达系统酵母表达系统 毕赤酵母表达系统优点 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表达菌株l影响目的基因高效表达的因素影响目的基因高效表达的因素 34浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展1 1基因工程药物基因工程药物基因工程药物研制过程基因工程药物研制过程5浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统
2、高效表达调控研究进展基本原理基本原理 通过先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后利用限通过先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后利用限制性内切酶，从外源基因中将控制该蛋白质合成过程的目的基因取出来，制性内切酶，从外源基因中将控制该蛋白质合成过程的目的基因取出来，再通过再通过 DNA连接酶把目的基因与载体（质粒连接酶把目的基因与载体（质粒 噬菌体噬菌体 病毒）病毒）DNA 连连接，接着转入微生物或细胞内进行克隆，并使目的基因最终在宿主细胞接，接着转入微生物或细胞内进行克隆，并使目的基因最终在宿主细胞内成功表达，获得所需的蛋白质。内成功表达，获得所需的蛋白质。6l 基因工程药物治疗
3、肿瘤基因工程药物治疗肿瘤l 基因工程药物治疗病毒感染基因工程药物治疗病毒感染l 基因工程药物治疗心脑血管疾病基因工程药物治疗心脑血管疾病l 基因工程药物治疗其他疾病基因工程药物治疗其他疾病浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展 最新进展最新进展7酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统其他酵母表达系统其他酵母表达系统 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展2 酵母表达系统酵母表达系统8指可利用甲醇做单一碳源的
4、一类酵母。指可利用甲醇做单一碳源的一类酵母。毕赤酵母（毕赤酵母（Pichia pastoris)汉森酵母（汉森酵母（Hansenula ploymorpha）假丝酵母（假丝酵母（Candia boidinii）浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展甲醇酵母（甲醇酵母（methylotrophic yeast）9具有强有力的乙醇氧化酶具有强有力的乙醇氧化酶(AlocholOxidase,AOX1)基因启动子。基因启动子。对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰。营养要求低营养要求低,生长
5、快生长快,培养基廉价培养基廉价,便于工业化生产。便于工业化生产。具有强烈的好氧生长偏爱性具有强烈的好氧生长偏爱性,可进行细胞高密度培养可进行细胞高密度培养。遗传稳定遗传稳定,表达量高表达量高。所分泌的糖蛋白的免疫原性较低所分泌的糖蛋白的免疫原性较低,而且表达产物不含有毒物质和致热原。而且表达产物不含有毒物质和致热原。表达的蛋白可分泌到胞外表达的蛋白可分泌到胞外,十分有利于纯化。十分有利于纯化。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展2.1 毕赤酵母系统优点毕赤酵母系统优点 10 自我复制型的游离载体自我复制型的游离
6、载体 整合型载体整合型载体 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展2.2 毕赤酵母表达载体毕赤酵母表达载体 表达载体与宿主染色体表达载体与宿主染色体重组，将外源基因表达重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。实现外源基因的表达。11 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展 启动子、外源基因克隆位点、分泌信号、终止子、选择标记、报告基因、复制起点、信号肽序列等毕赤酵母模式表达载体表达载体 12乙
7、醇氧化酶乙醇氧化酶(Alochol Oxidase,AOX1）启动子被最早成）启动子被最早成功地应用，也是目前最常用的启动子，它的甲醇诱导性很强，功地应用，也是目前最常用的启动子，它的甲醇诱导性很强，使在它控制下的外源基因能得到较高的表达。使在它控制下的外源基因能得到较高的表达。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展毕赤酵母的启动子毕赤酵母的启动子 13 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展毕赤酵母中有毕赤酵母中有 2个醇氧化酶基
8、因个醇氧化酶基因:AOX1和和AOX 2。AOX 1可受甲醇专一诱导而高水平表达可受甲醇专一诱导而高水平表达;AOX 2虽然在序列上与虽然在序列上与AOX 1的同源性达的同源性达 97%及以上且及以上且表达的蛋白具有相似的生物学活性表达的蛋白具有相似的生物学活性,但但AOX 1的表达水平的表达水平却明显高于却明显高于AOX 2，即，即启动能力强启动能力强AOX 1AOX 2。14AOX 1基因主要受诱导和抑制机制调控基因主要受诱导和抑制机制调控 当以甲醇为唯一碳源时当以甲醇为唯一碳源时,AOX 1基因的表达可被甲醇严格调基因的表达可被甲醇严格调控控,使得外源基因可严格保持在表达使得外源基因可严
9、格保持在表达(有甲醇有甲醇)-不表达不表达(无甲醇无甲醇)的模式。的模式。当以甘油或葡萄糖为碳源时当以甘油或葡萄糖为碳源时,AOX 1的转录被抑制。的转录被抑制。当当AOX 1基因缺失时基因缺失时,AOX 2表达水平很低表达水平很低,乙醇氧化酶活乙醇氧化酶活力极大丧失力极大丧失,细胞利用甲醇能力极大降低。细胞利用甲醇能力极大降低。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展15 作为筛选标记的基因和在细菌中进行复制起始点作为筛选标记的基因和在细菌中进行复制起始点 和选择标记和选择标记(如如ColEI 复制起始点和抗氨苄
10、基因复制起始点和抗氨苄基因)浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展毕赤酵母选择标记毕赤酵母选择标记 选择标记抗性标记对应于营养缺陷型受体的野生型基因，如HIS4、ARG4、URA3 16外源蛋白的分泌需要信号肽引导表达蛋白沿一定外源蛋白的分泌需要信号肽引导表达蛋白沿一定途径分泌至细胞外，外源蛋白的天然信号肽基因途径分泌至细胞外，外源蛋白的天然信号肽基因可与外源蛋白基因共同装入表达载体。可与外源蛋白基因共同装入表达载体。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展
11、系统高效表达调控研究进展分泌信号肽序列分泌信号肽序列 17 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展甲醇营养型酵母表达系统一般利用两种来源的信号甲醇营养型酵母表达系统一般利用两种来源的信号肽序列：肽序列：一是外源基因本身携带的信号肽序列；一是外源基因本身携带的信号肽序列；二是来源于酵母的信号肽序列，二是来源于酵母的信号肽序列，如如因子、因子、PHO1信号肽序列。信号肽序列。18许多基因特定的许多基因特定的A+T 富含区可作为多聚腺苷酸或转录终止信富含区可作为多聚腺苷酸或转录终止信号号,导致仅产生低水平或截短的导致仅
12、产生低水平或截短的mRNA.某些稀有密码子某些稀有密码子,尤其是稀有密码子富集区往往也是制约翻译尤其是稀有密码子富集区往往也是制约翻译速率的因素速率的因素.浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展毕赤酵母表达系统的优化毕赤酵母表达系统的优化 目的基因特性的改造：目的基因特性的改造：对对 策策某些情况下某些情况下,可通过定点突变去除成熟前终止结构域和替换稀可通过定点突变去除成熟前终止结构域和替换稀有密码子有密码子.基因中存在大量基因中存在大量A+T 富含区和稀有密码子密集区时富含区和稀有密码子密集区时,进行全进行全基
13、因合成基因合成,使编码序列符合毕赤酵母偏爱性密码子用法和具有更使编码序列符合毕赤酵母偏爱性密码子用法和具有更高的高的G+C 含量含量.19毕赤酵母可对分泌蛋白进行毕赤酵母可对分泌蛋白进行O-和和 N-连接糖基化修饰连接糖基化修饰.虽然虽然糖基化程度不高糖基化程度不高,但毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白但毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差异而具有潜在的抗源性糖链结构的差异而具有潜在的抗源性.浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展糖基化的消除：糖基化的消除：问问 题题对对 策策尝试胞内表达尝试胞内表达,避免
14、目的蛋白的糖基化避免目的蛋白的糖基化;也可通过对活性中心糖基化位点的突变改造也可通过对活性中心糖基化位点的突变改造,消除糖基化消除糖基化;还可共表达糖链加工酶还可共表达糖链加工酶,是糖链结构更接近哺乳动物是糖链结构更接近哺乳动物,从从而降低免疫原性。而降低免疫原性。20在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等;加例子加例子增加蛋白酶的底物以减少目的蛋白的降解增加蛋白酶的底物以减少目的蛋白的降解;因毕赤酵母可在较宽的因毕赤酵母可在较宽的 pH范围内生存范围内生存,可调节培养基的可调节培养基的pH 值抑制蛋白酶值抑制蛋白酶活性活性
15、;使使 用蛋用蛋 白酶白酶 缺陷缺陷 型型 菌株菌株,如如 SMD1163、SMD1165、SMD1168.可通过共表达蛋白酶抑制物来抑制蛋白酶活性；可通过共表达蛋白酶抑制物来抑制蛋白酶活性；也可尝试将目的蛋白连接上一个过氧化物酶体靶向信号也可尝试将目的蛋白连接上一个过氧化物酶体靶向信号(PT S),使其被分使其被分拣转运如过氧化物酶体贮存起来拣转运如过氧化物酶体贮存起来,免受蛋白酶降解免受蛋白酶降解,还可减少对宿主细胞的还可减少对宿主细胞的毒害作用。毒害作用。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展常用常用方法方
16、法提高产物的稳定性：提高产物的稳定性：21 毕赤酵母表达宿主菌于毕赤酵母表达宿主菌于 80 年代初开发获得年代初开发获得,常用宿主菌常用宿主菌大多是通过野生型石油酵母大多是通过野生型石油酵母Y11430进行突变改造而来进行突变改造而来.在组在组氨酸脱氢酶基因氨酸脱氢酶基因(HIS4)处有一突变处有一突变,用于转化后筛选重组菌用于转化后筛选重组菌株株.其他的一些营养缺陷宿主菌或生物合成基因也可作为筛其他的一些营养缺陷宿主菌或生物合成基因也可作为筛选标记选标记.浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展毕赤酵母表达菌株毕
17、赤酵母表达菌株22 目前主要有目前主要有3 种表达宿主菌种表达宿主菌,它们之间的区别在于它们之间的区别在于AOX,一个或二个基因的缺失而造成对甲醇利用能力高低的变化一个或二个基因的缺失而造成对甲醇利用能力高低的变化.浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展宿主 所含AOX基因 GS115(his4)有 AOX1有AOX2 KM7l 无 AOX1有AOX2MCl00-3 无AOX1无AOX223l 载体稳定性载体稳定性 l 基因剂量基因剂量l 整合位点整合位点l 分泌信号分泌信号l 表达产物的稳定性等表达产物的稳定性
18、等 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展 3影响目的基因高效表达的因素影响目的基因高效表达的因素24同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高lYRp型载体的稳定化型载体的稳定化选择选择非选择培养交替数十代可的稳定整合子。但是，整非选择培养交替数十代可的稳定整合子。但是，整 合位点不确定。合位点不确定。l采用采用Ylp型载体型载体更易实现整合、整合位点清楚更易实现整合、整合位点清楚浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调
19、控研究进展系统高效表达调控研究进展(1)载体稳定性载体稳定性25外源基因表达存在基因剂量效应外源基因表达存在基因剂量效应l筛选多拷贝整合子筛选多拷贝整合子l体外串联多个表达盒体外串联多个表达盒l采用采用YRp型载体稳定化技术获得高拷贝整合子型载体稳定化技术获得高拷贝整合子l构建高拷贝整合子构建高拷贝整合子 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展（2）基因剂量）基因剂量26l外源基因表达和整合于外源基因表达和整合于AOX/MOX或标记基因，或标记基因，均可高效表达。均可高效表达。l毕赤酵母中个别情况整合于毕赤酵母中
20、个别情况整合于His4位点的比位点的比AOX1位位点的低。点的低。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展（3）整合位点）整合位点27分泌表达效率与所利用分泌信号高度相关分泌表达效率与所利用分泌信号高度相关 浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展（4）分泌信号）分泌信号28浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展（5）表达产物稳定性）表达产物稳定性分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素l降低培养基降低培养基PH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低值：蛋白酶在酸性条件下活性较低l培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制l采用蛋白酶缺陷宿主柱：如采用蛋白酶缺陷宿主柱：如 SMD1168.29浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展系统高效表达调控研究进展