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1、 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验工业微生物与育种学工业微生物与育种学实验实验Part 实验基本操作技能实验基本操作技能实验二实验二 微生物的分离纯化微生物的分离纯化 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验分离分离纯化纯化形态观察形态观察内容提要内容提要 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验半固体培养基：穿刺接种半固体培养基：穿刺接种液体培养基接种液体培养基接种普通琼脂培养基：涂布平板，平板划线接种，斜普通琼脂培养基：涂布平板，平板划线接种，斜面划线接种面划线接种浅盘固体接种浅盘固体接种（1）接种）接种 宜宜宾宾学学院院
2、工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验无菌操作：无菌操作：在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验划线分离划线分离 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验划线接种注意要点划线接种注意要点划线时接种环与平皿约成划线时接种环与平皿约成30-40度角度角,轻轻接触轻轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂不能划破琼脂.第一次划线应占
3、平皿面积的第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线以后每次划线约占面积的约占面积的1/41/5.划线为连续划线划线为连续划线,不能间断不能间断.应占满平皿应占满平皿.划线不划线不能交叉重复能交叉重复.每次划完后接种环应灭菌每次划完后接种环应灭菌.宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验稀稀释释分分离离涂涂布布平平板板 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验稀稀释释分分离离倾倾注注平平板板 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验厌氧微生物的分离厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱厌氧罐厌氧手套箱 宜宜宾宾学学院院工
4、工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验细菌的分离1、一般采用NA培养基，加加入入抗抗真真菌菌剂剂(如如放放线线菌菌酮酮和和制制霉霉素素)，掺掺加加浓浓度度一一般般为为50gm1，以抑制真菌的生长。以抑制真菌的生长。2、琼脂平板在使用前应置于、琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育培养箱中孵育l、2天。天。3、培养基的生物物理学参数，如、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。调节到与试样的生态系统参数值相近。宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验 放线菌分离培养需考虑的生态参数：放线菌分离培养需考虑的生态参数：温度、温度、p
5、H、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。一般采用高氏一般采用高氏1号培养基，大多数放线菌的分离培号培养基，大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在天内在分离平板上缓慢形成菌落。分离平板上缓慢形成菌落。选择性地添加抗生素，通常加入抗真菌剂制霉菌素选择性地添加抗生素，通常加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。放线菌的分离 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实
6、实验验真菌分离利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。菌的迁涉生长。一般采用一般采用PDA培养基培养基改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。培养时应加以考虑。宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验（2）纯化）纯化将分离得到的
7、单菌落分别接种到单个平将分离得到的单菌落分别接种到单个平板上板上 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验t 颜色反应：分离特定的菌株；t 牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；待分离的微生物的生长特征明显不同 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验液体培养基分离纯培养液体培养基分离纯培养 稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）
8、表）表现为不生长。现为不生长。单细胞（孢子）分离单细胞（孢子）分离 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操作难度与细胞或个体的大小成反比；作难度与细胞或个体的大小成反比；宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验（3）形态观察）形态观察 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验菌落（菌落（colony）：）：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、可以形成肉眼可见的、有一定形态结构
9、的子细胞有一定形态结构的子细胞生长群体生长群体众多菌落连成一片众多菌落连成一片菌苔（菌苔（lawn）宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验（4）菌种保藏）菌种保藏最常见的保藏方法：
10、斜面最常见的保藏方法：斜面细菌的保藏：甘油保藏细菌的保藏：甘油保藏真菌的保藏：石蜡油保藏、孢子保藏真菌的保藏：石蜡油保藏、孢子保藏 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验 菌菌 连续在培养基上（内）移种连续在培养基上（内）移种 种种 生活态生活态 传代培养保藏法传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种连续在活宿主上（内）移种 保保 固体斜面固体斜面 藏藏 湿法湿法 半固体琼脂柱半固体琼脂柱 方方 休眠态休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法法 干法干法 藏在玻璃管内藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上吸附在合适的载体上菌种保藏的方法 宜
11、宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验方法：方法：低温保藏法低温保藏法方法：菌种管置方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。石蜡油低温保藏法：石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。干燥保藏法干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。宜宜宾宾学学院院工工业业
12、微微生生物物与与育育种种学学实实验验真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。时间长，是目前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（温冰箱中（-196）。）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验几种常用菌种保藏方法的比较几
13、种常用菌种保藏方法的比较方法名称方法名称主要措施主要措施适宜菌种适宜菌种保藏期保藏期评评价价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固冰箱保藏法（半固体）体）石蜡油封藏法石蜡油封藏法*沙土保藏法沙土保藏法冷冻干燥法冷冻干燥法低温低温低温低温低温、缺氧低温、缺氧干燥、无营养干燥、无营养干燥、无氧、低干燥、无氧、低温、有保护剂温、有保护剂各大类各大类细菌、酵母菌细菌、酵母菌各大类各大类*产孢子微生物产孢子微生物各大类各大类36月月612月月12年年110年年515年年以上以上简便简便简便简便简便简便简便简便有效有效简便简便有效有效 宜宜宾宾学学院院工工业业微微生生物物与与育育种种学学实实验验微生物学实验室的常规操作程序