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1、生物物理学导论-11第五章 生物能力学(4)5.6 能量转导作用离子的主动传输可以经由ATP酶被ATP水解诱导，那么离于在热力学梯应方向穿过脂的传输能够通过同一ATP酶引起ATP的合成吗？随着与膜相联的ATP合成问题(对线粒体称为氧化磷酸化，对光合作用细胞器称为光合磷酸化)的解决，这一问题有了肯定的答案 在糖酵解反应序列中，ATP的合成(常称为联系底物的磷酸化)通过酶反应发生，在这些反应中，共同的中间体维护产能反应(氧化)与储能反应(磷酸化)的偶联。这些反应发生在细胞的原生质相中，虽然有些细节仍待探讨，但对了解机理并无重大困难。关于同呼吸或光合作用电子传递相偶联的ATP合成的机理，仍无定论。这
2、类能量转导作用的基本观点是其与膜系统相联系；尽管在破碎的膜片段中电子传递可以不被削弱，如果没有线粒体、叶绿体或细菌内膜的完整结构，就没有ATP合成发生。化学假说用解偶联剂获得的实验结果，引出了“高能中间体”的概念。通过类似于联系底物的磷酸化的论证发展起来的一种假说，将这一高能中间体看成一种化学实体。按照这一理论，呼吸或光合作用的氧化还原反应与ADP磷酸化为ATP的偶联，是通过下述方式达到的。设A、B和C是氧化还原反应链中相连的化合物，除非还原产物BH2与一中间体I复合，B被AH2的还原就不能进行。因此，AH2+B A+BH2直接跟随着 BH2+I BH2I还原的复合物BH2I又可以放能反应,还
3、原链中下面的化合物，这一反应的自由能则被波纹号标出的高能键捕获：BH2I+C BI+CH2于是形成高能中间体BI。有磷酸存在时，这一高能中间体被磷酸化，且高能磷酸盐又可磷酸化ADP：BI+Pi IP+B IP+ADPATP+I解偶联剂简单地引起高能中间体BI的水解，从而阻止ATP形成，但却保持氧化还原反应进行。无论是一种磷酸化反应还是两种磷酸化反应的抑制剂。尽管上述概念的化学假说与某些观察是一致的，但它也有困难。到目前为止，没有人能实验证实高能中间体的存在，更不用说分离它了。仅此当然还不足以排斥这种理论，因为复合物可能是极不稳定的，但更为严重的是，实际上这种理论完全没有考虑与其结构的联系。构象
4、假说化学说的改进是构象说。在这种假说里，高能中间体是I因子的音一构象。这一理论用下列反应式来十t替(573)(576)BH2十I(：)B十I。十GH 2 (577)I”十ADPPi。一)ATy十I (E78)其小I。表示I的高能构象。一种类蛋白质成份可能起着?的作用，没有它就没有与电子传递相佣联的磷酸化看来是可能的。这一因素就是已经提到过的悯联园子(54节)，它做联在股上的极小的蘑菇(图522)。悯联因子已在纪粒体及叶绿体和细菌市发现并分离出来。很可能，从腆上去林佃联因子，就会抑制A Lf的形成，而电了传递仍可在这种腹k进行。当把提纯的侗联因子送N到去空了的限系统时，磷酸化作用被恢复。电子传说
5、诱导构象变化的证抿来自这样nt研究，在这种研究中证明，被悯联的磷酸化的抑制剂仅当放电子传递“激励”时，才与悯联因子纳合。因此，在叶绿体中，仅半加入辐射防于时，抑制剂N乙基顺丁烯二欣亚舷才抑创允仑磷酸化。而且，用氢的同位素质(”H)这类放射性示踪物还可证实，抑制剂与悯联因子的结合被光照显著提高。虽然构象理论看来可以克服“化学的”高能中间体酌不可检测性，但它仍然缺乏足够令人满意肋细节。它没有关于电子传递成份与偶联因子间结构关系协任何信息，也不必须膜系统的完整性(膜本身可以是悯联成汾必须酌基质)。化学渗透假说化学渗透说是依据完全不同的概念的一种理论，它把功能性作用归之于一完整的联系着膜的系统。实际上
6、，按这一假说，高能中间体是由氢离子穿过内膜的显著位移而形成的横穿细胞器或细菌)内膜的热力学梯度。这些氢离子是被电子从膜的一例传递到另一例产生的电场移位，因此，电子在膜中的传递是有方向性的，其工作机理示意于团536a(对呼吸链)和536b(对光合作用链)中。氧化还原组份(如图526所示)在膜内以这样的方式排布：在膜两侧，电子裁体(如细胞色素和非血红素铁蛋白)用氢载体(如黄素蛋白和苯i6)替换。通过这样的安排，或者经由底物的还原(在呼吸电子传递约情况下)，或者经由光诱导的初级反应(在光合作用电于传递情况下)，被电子载体传输穿过膜的电子产生一电场，引起质子通过氢载体或者从膜内侧移向外侧(在线粒体内膜
7、酌情况下)，或者从外侧移向内侧(在叶绿体类爱休的情况下)c在这两种情况下，膜原来虽然可以透过水，但透不过氢离子。移位的质子由此形成一浓度梯度，这在实际上就是高能中间体。与膜联接的ATP酶系统(如上面捉到的偶联因子)则可反过来作用，并通过将质子再移位使ATP合成(图536。)，图537示出了可达此目的的简单方式。H梯度以某种未知方式的出现，牵引从ADP和天机磷酸形成ATP时产生的水的经基离子部份去到膜的一侧，而特质子推到另一侧。以这种方式，H的纯移动就能产生ATy。按照这一理论，解偶联剂格提供消除质子梯度酌附加途径，由此阻止ATP酶利用这一梯度来合成ATP6事实L，所有已知的解偶联剂都有“溶解”
8、膜中氢离子酌特性，许多解偶联剂，如二硝基苯(DNP)、碳氧氰化m氯苯踪(cccp)或碳氧氰化P三氟甲气苯踪(FccP)以及许多脂肪酸，既是弱酸又是脂镕的，并能携带质子穿过膜(团538)。因此，酸酌质子化形式可以从一例移向另一侧，放出它的质子，然后作为负离子再穿过膜。许多携带离子的抗卤素或它们的组合，由于其离于裁体特性，都是解佃联剂。解偶联的机理可以通过化学渗透说得到阐明，也是这种理论引人注目的特征之一。这一理论提供的许多预言都要求实验的验证，达在6D年代和70年代激起了大量的研究；球实上，这些预告的很大一部份都被证实了。由于达一戊功，我们感到，尽管仍有一些矛盾(如一个电子传递对应一个质子传返的
9、预测化学计算，到目前为止未能被实验证实)，但这一理论至少可以对部份偶联机理提供正确的解释就足以证明，更完全的讨论是合理的。质子移位在光诱导的电子传递期间有可逆的质子获取过程，这是在叶绿体服中发现的，现在这已是一个普遍现象了。这种光诱导的质子俘获，也可从光合绍菌产生的膜围成的微囊中证实，尽管程度小多了。在用呼吸继底物(NA皿，琥动酸)提供H时，线粒体对之表现出挤压作用。氧化还原组份酌横向定位，即氢鼓体和电子载体的交换，是化学渗透说的关楔性要求，利用特异抗体的研究提供了证实这种排布的证据。膜的对外性(sided rmm)被下述事实令人信服地证明；在线粒体经题声摄荡形成的亚线粒体颗粒个，质子移位在呼
10、吸一刀始就是朗向内侧的，而不像在完整颗粒小那样朝向外侧。发生这一现象是出于内膜在急剧折叠的略的“颈”部优先破裂，碎片的贡封装则得到与完整的线检体相较是“内胡外”的颗粒(图539)。这一在破府之后反转质子移位的现象也可在光合作用的细菌小看到，载包体(光合细菌中围成空泡的膜)与完整的细菌相铰就是“内部外”的。质子运动力质子运动力 按照化学渗透理论，从放能的电子传递得到基本上稳定的能尼形式，是由于n的浓度梯度。电子传递引起质子被“抽”过腆，这一质子梯度建立一核穿腆的电化学势差，它由下式给出；式中，ApnPHI一PHzb A砂1A?一1A?。当氢离于从l运动到2时，APH和AV部为负，这是离子被“抽人
11、”的方向。因此，对叶绿体的类裹体，(1)是外侧，(2)是内例；而对线粒体，情况正好相反。“氢离子泵”或“质子泵”产生的电化学势除以法拉弟常数件，称为质子运动力(P”f)，并以伏特表示。抗衙离子流从式(580)可以看到，Pmf由一浓度项(PH梯度)和一电学项(膜电位)组成。如果无法补偿增长的电荷，随着进入非常少量的质子，后一项也会变得极高。当然，当在磷酸化系统中存在ADp和磷酸时，通过ATP合成引起酌质子运动会使限电位放电，因为它与“质子泵”引起的质子运动方向相反。但是，在缺乏磷酸化底物ADp和磷酸的情况下，补偿的抗衡离子流(凹untefi。M f20w)必然出现以至少在一定程度上阻止膜电位过份
12、升高。因而可以预期，一些正离子在与质子系相反的方向上运动，和(或)一些负离子在质子泵的方向上流动。在缺乏ATP合成的叶绿体制剂中，实际证实了这种抗杨离子运动。特别是与获取质子同时发生的氯离子的同相运动(在相同的方向运动)是显著的，也发现有同时发生的K和Mg的反相运动(在相反的方向上的运动)，但后者在这些细胞器中并非重要的补偿抗衡离子流。在线粒体中，K和Na4酌反相运动看来就是膜电位的补偿过程。光合细菌中的情况稍有不同，细苗膜显然对单价窝子的渗透显示出较大的阻力。K和Nal只有低的渗透值，G也有同样情况。这就是为何在自光合细菌结合成宝泡的膜(裁色体)中，获取质子比叶绿体的类囊体少的线故。PH梯废
13、和膜电位会产生这样的问题：ATP通过ATP朗的逆向作用酌合成，只是由于P2“f的PH梯度项产生的呢，抑或膜电位项也可完成这一任务。离子裁体的解偶联剂对不同生物膜酌影响，可以告诉我们一些关于这个问题的信息。我们已经看到，解偶联剂使离子运动穿过膜。例如，尼日里亚菌素用R离子交换炉离子，将它加到结合成微囊体的进行电子传递酌膜的悬液中，则可消除PH梯度而保留膜电位。这一实验的给果是，在线粒体和RI绿体的类夷体制刑中，ATl2合成被解偶服，而在细菌制剂中，并不被解侣联。另一种离子栽体绕氨雷素使K离子移向一边，因而，这一抗曲素曲作用是在完全保6J Pfi梯度n6同时，消除膜电位(B口使有也很小)。除非破坏
14、离子梯度的试剂(如尼日里亚菌素)也存在，绚氨雷素并不使结合成微囊休的三种膜个的任何一种的ATP合成解悯联。在细菌制剂中，当存在可透负离子(如硫氰酸根负离子cNs，它根容易透过细菌膜)时，尼日里亚菌素也起解悯联剂的作用。这些结果意味老，细菌灼边向ATP酶也利用膜电位工作。但是p对叶绿体或线粒体就不能作这样的结论，离子线体抗菌素的实验结果表明，不是完全没有膜电位，就是逆向ATP酶只用哪梯度起作用。光诱导三个类胡萝r素吸收带的红移(国540 M)，这是由于通过电子传递以及质子梯度的膜电位成份，产生了电位。这一移动的电学起因可通过下述实验提供：将Kc?溶液在黑暗中注入含级氨霖素的色素细胞悬液，这一“脉
15、冲式”附加物引起类胡萝r素吸收诺区小的吸收发生限时变化(见闻540 b)G过一会儿，反向离子的扩效将小和电位，结果使内侧和外侧的K1浓度变得相等。KGl肋另一次“脉冲式”注入将再次引起瞬时吸收变化。图540 c中斯示的瞬时光捞与光诱导的类胡萝F素吸收带移位的差值光谱 M 断光是一样的。由加入kcl引起的瞬时类胡萝F素吸收的变化且是Kl外侧浓度对数的线性函数，这一关系示丁图541今。假设平砌后，外侧K浓度等于内侧R浓度，就可利m这一技术按伏特表示的膜电位，通过式(531)来校淮吸收带位移。在一些光合作用细菌的色素细胞中，已由此测定出光诱导的蜡电位(由于电子传递穿址膜)为420毫伏，光诱导的稳态电
16、位(由于移位的MJ有24D毫伏这样高。这证文，至少在一些光分作用细蓟中，P”f rJ屯学顶是主要的。表54i；出了一些测丛PT”r的咆绍协和1d1组份的实骆结果，并与在同一实验小实际测定的合成适员4?y所需的能量作了比较。我们可以看到，没有附加物时，N“f对合成ATp是富裕的，这时膜电位对P”f的贡献为56。由于尼日里亚菌素的存在，膜电位本身刚够满足ATP合成；濒氨霉素引起膜电位70抑制，而APH刀宿到正好使hTp合成能够进行的水平。显然，至少在这些细菌创剂中，PH和膜电位都能驱动逆向的ATP酶作用。对叶绿体和线粒休仍不能作同样的结论。在叶绿体中，在515530毫微米光谱区有一峰的吸收带位移，
17、显然是由于横贾膜的电位。运用与上述相同的校服技术可以证明，尽管基本的瞬时变化(用短闪光照明)可以检测，但在连续光照情况下测得的“稳态膜电位”最好也只有10毫伏多。达无疑是由于快速的抗衡离子流，大概主要是G?的同相运动所致。因此，在叶绿体中PP”f的电成份实际上是不存在的。所以，我们不能用细菌色素细胞所用舱同类实验来验证叶绿体中的hTP合成可由瞪电位自身诱导。但是，这个方面的间按证据是可以参考的。线粘体酌情况也是如此。正如前面已经提到过的，这一问题与在逆向ATP酶系统中合成ATP助机理直接有关。通过来自ADP和磷酸合成ATP而产生的水的经基离子和质子的反向运动，这样来调控ATP合成的简单理论，已
18、经作了重大修改，以适应膜电位诱导ATP合成的考虑。在受激膜上佣联因子的构象变化，也可能是这一机理的一个基本特征。A丁P酶活性 随着ATP酶可逆性的发现，已经在这方面取得了一些进展。前面已提到，A?p酶位于蘑菇状的偶胀因子中。偶服因子不仅负责ATP的合成，而且也催化ATP的水解；特A?p加到含有偶联因子的结合成微囊体的跟上，在某些情况下会激励摸，从而水解ATP。在引起质子梯度和偶联因子中的构象变化方面，这一刺激作用是明显的。在没有干扰因素的dd茵制剂中，很容易触发这一正向的ATP酶活性；在叶绿体和线粒体小，首先是阻遏正向ATP酶活性的偶联因子的亚单位被去掉或钝化。A?、P合成的化学本身，特别是这一化学过程被质子的电化学势驱动的达径，是富有挑战性的问题，这个问题离解决还很远。目前，这些问题是所有生物能力学研究工作的中心。