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1、分析化学 高效液相色谱第1页，本讲稿共48页3-1 3-1 概概 述述 HPLC是是60年年代代在在GC和和经经典典液液相相色色谱谱基基础础上上发发展展起起来来的。的。GC柱柱效效高高，且且能能分分离离、定定量量，但但有有些些热热稳稳定定性性差差，不不易易挥挥发发的的组组分分不不能能用用GC直直接接分分析析，人人们们想想到到模模仿仿GC，用用细细颗粒固定相，薄壳固定液，以增加柱效。颗粒固定相，薄壳固定液，以增加柱效。模模仿仿LC用用液液体体作作流流动动相相，在在室室温温下下进进行行，但但阻阻力力太太大大，液液体体流流动动相相难难以以通通过过，所所以以又又想想到到加加高高压压泵泵，加加快快流流动
2、动相相流流速速，这这样样即即增增加加了了柱柱效效，又又加加快快了了分分析析速速度度，也也拓拓宽宽了了应应用用范范围围，把把柱柱子子、高高压压泵泵、检检测测器器配配成成仪仪器器，就就形形成成高高效效液液相相色谱仪。色谱仪。第2页，本讲稿共48页 HPLC与与LC的比较的比较 LCHPLC柱径柱径12cm25mm颗粒颗粒150200m510m压力压力常压常压高压高压tR120h1h内内n250105/米米用途用途初步分离初步分离高效分离、高灵敏度定量高效分离、高灵敏度定量装置装置非仪器化非仪器化精密仪器，自动化精密仪器，自动化.智能化智能化HPLC优点：优点：柱效高柱效高分析时间短分析时间短可定量
3、可定量仪器分析仪器分析第3页，本讲稿共48页HPLC与与GC的比较的比较GCHPLC流动相流动相gl温度温度高温高温室温室温组分组分易挥发、热稳定性好易挥发、热稳定性好不受限制不受限制可测有机物可测有机物20%75%80%tR130min160min灵敏度灵敏度10-1210-14g/ml10-910-11g流出物流出物不易收集不易收集易收集易收集HPLC优点：优点：应用范围广，组分易回收应用范围广，组分易回收第4页，本讲稿共48页GC与与HPLC选择：选择：小分子小分子热稳定性好热稳定性好GC大分子大分子热稳定性差热稳定性差HPLCtR短短GC优点：优点：g廉价廉价灵敏度高灵敏度高第5页，本
4、讲稿共48页二二.HPLCHPLC法的特点：法的特点：1.高效分离高效分离n=105/米米2.高速高速使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟3.高灵敏度高灵敏度检测下限：检测下限：10-910-13g（最小检测量）（最小检测量）4.自动化程度高（仪器分析、电脑控制、色谱工作站）自动化程度高（仪器分析、电脑控制、色谱工作站）5.应用范围广应用范围广可测有机物可测有机物75%80%一一.HPLC.HPLC法的分类法的分类吸附色谱吸附色谱ls离子交换色谱法离子交换色谱法尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法ll正向色谱正向色谱反向色谱反向色谱第6页，本讲稿共48页二、二、高效
5、液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点featureofHPLC 特点：高压、高效、高速、高灵敏度特点：高压、高效、高速、高灵敏度高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。第7页，本讲稿共48页分配系数 K=组分在固定相中的浓度组分在固定相中的浓度/组分在流组分在流动相中的浓度动相中的浓度=CS/CM分配系数的差异是所有色谱分离的实质性分配系数的差异是所有色谱分离的实质性原因原因3-2 3-2 影响分离的因素factorsinfluencedseparation第8页，本讲稿共48页1.1.影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提
6、高柱效的途径 在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。第9页，本讲稿共48页 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。第10页，本讲稿共48页 2.2.流速流速 流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时
7、间的重要可选择参数。3.3.固定相及分离柱固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。第11页，本讲稿共48页高效液相色谱仪高效液相色谱仪由五大部分组成：高压输液系统由五大部分组成：高压输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检侧系统检侧系统记录及数据处理系统记录及数据处理系统分析流程：分析流程：流动相流动相1高压泵高压泵进样器进样器流动相贮液槽流动相贮液槽压力表压力表流动相流动相2微机微机梯度洗梯度洗脱装置脱装置色色谱谱柱柱馏分收集器馏分收集器检测器检测器第12页，本讲稿共4
8、8页储液瓶储液瓶分布器分布器过滤过滤2 m高压泵高压泵入口检查入口检查出口检查出口检查脉流消除脉流消除抽气抽气过滤器过滤器反压调节反压调节压力计压力计注样阀注样阀分离柱分离柱到检测器到检测器HPLC仪器详解仪器详解第13页，本讲稿共48页第14页，本讲稿共48页第15页，本讲稿共48页 一一.高压输液系统高压输液系统1.高压输液泵：恒压泵（流量随阻力变化重现性差）高压输液泵：恒压泵（流量随阻力变化重现性差）恒流泵（多用）：往复式恒流泵（多用）：往复式注射式注射式作作用用：将将流流动动相相在在高高压压下下连连续不断地送入液路系统。续不断地送入液路系统。性能：性能：有足够的压力有足够的压力输出流量
9、恒定，可调输出流量恒定，可调输出压力平稳输出压力平稳泵室体积小泵室体积小泵体抗腐蚀、耐酸泵体抗腐蚀、耐酸马达马达往复式拉动往复式拉动密封密封溶剂溶剂球阀球阀脉动阻脉动阻尼器尼器到色谱柱到色谱柱机械往复柱塞泵示意图机械往复柱塞泵示意图第16页，本讲稿共48页2.梯度洗脱装置梯度洗脱装置作作用用：将将两两种种或或两两种种以以上上溶溶剂剂按按一一定定程程序序连连续续改改变变配配比比，以改变流动相极性、离子强度、以改变流动相极性、离子强度、PH值、提高分离效率。值、提高分离效率。低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱，低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱，1个泵。）个泵。）高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，高压
10、梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个泵。）个泵。）贮液槽贮液槽1贮液槽贮液槽2贮液槽贮液槽1贮液槽贮液槽2梯度洗脱装置梯度洗脱装置程序控制程序控制高压泵高压泵1高压泵高压泵2混合室混合室高压泵高压泵梯度洗脱装置梯度洗脱装置进柱进柱进柱进柱低压梯度洗脱低压梯度洗脱高压梯度洗脱高压梯度洗脱不易改变流动向配比不易改变流动向配比,自动化程度低自动化程度低随时改变流动向配比随时改变流动向配比,自动化程度高自动化程度高第17页，本讲稿共48页 二二.进样系统进样系统 注射进样：注射进样：装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。六六通通阀阀进进样样：目目前前最最常常
11、用用，由由于于进进样样量量可可由由样样品品管管控控制制，因此进样准确，重复性好，如图。因此进样准确，重复性好，如图。图图12-5 12-5 六通阀进样示意图六通阀进样示意图a a载样载样(样品进入定量管样品进入定量管)b)b倒阀倒阀(样品导入色谱柱样品导入色谱柱)1 1定量管定量管 2 2样品进入口样品进入口 3 3流动相进口流动相进口 4 4色谱柱色谱柱1.载样管载样管第18页，本讲稿共48页装入样品装入样品出口出口进样进样采样环采样环泵入溶剂泵入溶剂进色谱柱进色谱柱第19页，本讲稿共48页三三.分离系统：分离系统：色谱柱色谱柱不锈钢不锈钢直型直型分析：内径分析：内径26mm长长1030cm
12、制备：内径制备：内径1025mm长长1550cm恒温器：电热恒温装置（室温恒温器：电热恒温装置（室温150）恒温水浴类套（恒温水浴类套（70以下）以下）作用：保证分析时温度恒定，否则对作用：保证分析时温度恒定，否则对tR影响较大影响较大第20页，本讲稿共48页四四.检测系统检测系统1.紫外紫外可见光度检测器：可见光度检测器：固固定定波波长长：254nm，低低压压汞汞灯。灯。可可调调波波长长：190800mm，钨灯，氘灯。钨灯，氘灯。光电二极管矩阵检测器：光电二极管矩阵检测器：190700nm。石英窗石英窗接色谱柱接色谱柱UV光电倍增管光电倍增管废液废液第21页，本讲稿共48页光电二极管矩阵检测
13、器特点：光电二极管矩阵检测器特点：灵灵敏敏度度高高、分分辨辨率率好好、方方便便、快快速速、准准确确，可可扫扫描描得得三三维维流出曲线流出曲线紫外检测器的应用：紫外检测器的应用：对紫外有吸收的组分，且吸光度与浓度成正比。对紫外有吸收的组分，且吸光度与浓度成正比。紫外检测器的特点：紫外检测器的特点：灵敏度高灵敏度高最小检测浓度最小检测浓度10-9g/ml线性范围宽线性范围宽对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱应用范围广应用范围广第22页，本讲稿共48页波长波长可的松可的松氟美松氟美松皮质酮皮质酮快速扫描快速扫描光电二极管阵列（光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维
14、色谱）检测所获得的三维色谱-光谱图光谱图第23页，本讲稿共48页2.荧光检测器：多波长荧光检测器（滤光片）荧光检测器：多波长荧光检测器（滤光片）荧光分光检测器（光栅分光）荧光分光检测器（光栅分光）氘灯作激发光源，波长范围氘灯作激发光源，波长范围250600nm应应用用：组组分分吸吸收收一一定定波波长长紫紫外外光光后后发发射射荧荧光光的的物物质质，且且荧荧光强度与浓度成正比。光强度与浓度成正比。特特点点：灵灵敏敏度度更更高高检检测测限限10-1210-13g/ml（灵灵敏敏度度比比UV检检测器高测器高23个数量级）个数量级）选择性好选择性好对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱对温度和流速不敏感，可
15、进行梯度洗脱所需试样量少，适于痕量分析所需试样量少，适于痕量分析应用范围广应用范围广3、电化学检测器、电化学检测器电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。第24页，本讲稿共48页一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph二、液二、液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph三、离子交换色谱三、离子交换色谱ion-exchangechromatograph四、离子色谱四、离子色谱ionchromatograph五、离子对色谱五、离子对色谱ion-pa
16、irchromatograph六、排阻色谱六、排阻色谱size-exclusionchromatograph七、亲和色谱七、亲和色谱(AC)(AC)Affinity chromatograph3-3 3-3 主要分离类型与原主要分离类型与原理理basicprincipleandmainseparatingtypes第25页，本讲稿共48页一、一、液液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatography 固固定定相相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理基本原理：组分在固定
17、相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；第26页，本讲稿共48页二、二、液液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流流动动相相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正正相相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反反相相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相固定相：早期涂渍固
18、定液，固定液流失，较少采用；化化学学键键合合固固定定相相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。第27页，本讲稿共48页三、三、离子交换色谱离子交换色谱ion-exchangechromatography 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流流动动相相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；基基本本原原理理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3H +M+=RSO3 M +
19、H+阴离子交换：RNR4OH +X-=RNR4 X+OH-应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。第28页，本讲稿共48页四、四、离子色谱离子色谱ionchromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。第29页，本讲稿共48页五、五、离子对色谱离子对色谱ionpairchromatography 原原理理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合
20、物，使其能够在两相之间进行分配；阴阴离离子子分分离离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳阳离离子子分分离离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反反相相离离子子对对色色谱谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。第30页，本讲稿共48页六、六、排阻色谱排阻色谱size-exclusionchromatography 固定相固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原原理理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通
21、过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 第31页，本讲稿共48页七、七、亲和色谱亲和色谱(AC)Affinitychromatograph 原原理理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。第32页，本讲稿共48页一、一、液相色谱固定相液相色谱固定相stationaryp
22、haseofHPLC二、液相色谱流动相二、液相色谱流动相mobilephaseofHPLC3-4 3-4 液相色谱的固定相液相色谱的固定相与流动相与流动相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC第33页，本讲稿共48页一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相stationaryphasesofLC 1.1.液液-液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体）表面多孔型
23、担体 （薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；第34页，本讲稿共48页（3）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSiC稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：硅碳键型：SiCd.硅氮键型：硅氮键型：SiN第35页，本讲稿共48页化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，
24、耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；第36页，本讲稿共48页 2.2.液液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：510m；第37页，本讲稿共48页3.3.离子交换色谱分离固定相离子交换色谱分离固定相结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳
25、型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：（1）阳阳离离子子交交换换树树脂脂（强强酸酸性、弱酸性）性、弱酸性）（2）阴阴离离子子交交换换树树脂脂（强强碱碱性、弱碱性）性、弱碱性）第38页，本讲稿共48页 4.4.空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3
26、）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。第39页，本讲稿共48页二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相mobilephasesofLC 1.1.流动相特性流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出
27、峰顺序相反。第40页，本讲稿共48页2.2.流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常常用用溶溶剂剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第41页，本讲稿共48页3.3.流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可
28、在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)第42页，本讲稿共48页4.4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。
29、（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。第43页，本讲稿共48页第五节第五节 应用实例应用实例（一）环境样品分析（一）环境样品分析 水水中中酚酚类类化化合合物物测测定定C8柱柱；流流动动相相：A(1.0%醋醋酸酸水水溶溶液液)和和B(1.0%醋醋酸酸乙乙腈腈溶溶液液)进进行行梯梯度度洗洗脱脱，B由由30%100%；（；（20min),1.2ml/min;光电二极管矩阵检测器光电二极管矩阵检测器.图图12127 7 十一种酚的色谱图十一种酚的色谱图1 1苯苯酚酚 2 24 4一一硝硝基基苯苯酚酚 3 32 2一一氯氯苯苯酚酚 4 42 2一一硝硝基基苯苯酚
30、酚5 52 2，4 4二二硝硝基基苯苯酚酚 6 62 2，4 4一一二二甲甲酚酚7 74 4一一氯氯一一3 3一一甲甲酚酚 8 82 2，4 4一一二二氯氯苯苯酚酚 9 94 4，6 6一一二二硝硝基基邻邻甲甲酚酚 lOlO2 2，4 4，6 6一三氯苯酚一三氯苯酚1111五氯苯酚五氯苯酚0 5 10 150 5 10 15第44页，本讲稿共48页 （二）食品分析（二）食品分析脂脂溶溶性性维维生生素素的的分分析析的的分分析析测测定定：C18柱柱；紫紫外外检检测测器器=300nm；流动相；流动相甲醇甲醇:水水=98:2,流速：流速：1.7ml/min。脂溶性维生素的分析色谱图脂溶性维生素的分析色
31、谱图1.AAcetate2.ESuocinate3.D24.EAcetate5.K1 第45页，本讲稿共48页（三）生物材料分析（三）生物材料分析 尿尿中中马马尿尿酸酸和和甲甲基基马马尿尿酸酸测测定定：ODS柱柱；紫紫外外检检测测器器=254nm；流流动动相相：甲甲醇醇+含含乙乙酸酸的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液（20：80），流速：流速：1.0ml/min。第46页，本讲稿共48页（四）（四）在生物化学中的应用在生物化学中的应用 例：氨基酸的测定例：氨基酸的测定时间（时间（min)第47页，本讲稿共48页毛细管电泳毛细管电泳高压直流电场为驱动力，毛细管高压直流电场为驱动力，毛细管为分离通道为分离通道第48页，本讲稿共48页