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1、医学遗传学设计实验医学遗传学设计实验 实验设计方案实验设计方案：6参考文献参考文献一、实验名称一、实验名称：二、总体设计思路：二、总体设计思路：三、具体设计方案三、具体设计方案：1实验目的实验目的2实验原理实验原理 3实验材料、试剂及器材实验材料、试剂及器材 4实验方法及注意事项实验方法及注意事项5实验预期结果及遗传指导实验预期结果及遗传指导 一、实验名称一、实验名称：从孕妇外周血中提取胎儿从孕妇外周血中提取胎儿DNA进行进行a a地贫的产前诊断地贫的产前诊断二、总体设计思路：二、总体设计思路：抽取孕妇外周血抽取孕妇外周血 提取胎儿提取胎儿DNA 利用利用 PCR技术进行胎儿技术进行胎儿DNA
2、扩增扩增 利用利用Sou-thern分分子印迹杂交法检测出限制性片段长子印迹杂交法检测出限制性片段长 度多态性（度多态性（RFLP）进行基因诊断）进行基因诊断【用用DNA限制酶处限制酶处理扩增产物理扩增产物 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 转膜转膜 探针标记探针标记 预杂交预杂交 Southern杂交杂交 洗膜洗膜 放射性自显放射性自显影检测影检测】三、具体设计方案三、具体设计方案：1实验目的实验目的v利用孕妇外周血中游离的胎儿利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进行进行a地贫的产地贫的产前诊断，从而进行遗传指导。前诊断，从而进行遗传指导。2实验原理：实验原理：v地中海贫血的分布遍及全世界，我国南方
3、省区的发地中海贫血的分布遍及全世界，我国南方省区的发病率也较高，如广西壮族自治区可高达病率也较高，如广西壮族自治区可高达14.6%，其，其次为广东、海南、云南等。在遗传咨询的基础上，次为广东、海南、云南等。在遗传咨询的基础上，对高风险的胎儿进行产前诊断和选择性终止妊娠是对高风险的胎儿进行产前诊断和选择性终止妊娠是防止遗传病、先天畸形患儿出生的最有效而可行的防止遗传病、先天畸形患儿出生的最有效而可行的方法，对于减少群体中致病基因频率和提高人口素方法，对于减少群体中致病基因频率和提高人口素质具有十分重要的意义。质具有十分重要的意义。v传统产前诊断方法一般采用羊膜腔穿刺、绒毛膜取传统产前诊断方法一般
4、采用羊膜腔穿刺、绒毛膜取样和脐静脉穿刺等，它们都具有创伤性，可能对孕样和脐静脉穿刺等，它们都具有创伤性，可能对孕妇及胎儿造成一定危害，如宫内感染、出血甚至流妇及胎儿造成一定危害，如宫内感染、出血甚至流产、死胎等。利用孕妇外周血中游离的胎儿产、死胎等。利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进进行产前诊断是一项非创伤性产前诊断技术，易于被行产前诊断是一项非创伤性产前诊断技术，易于被孕妇接受。孕妇接受。v孕妇外周血中游离的胎儿孕妇外周血中游离的胎儿DNA含量相对高，提取及含量相对高，提取及分析过程简单，易于发展为可应用于临床的大样本分析过程简单，易于发展为可应用于临床的大样本高通量的检测方法。另外胎儿高通
5、量的检测方法。另外胎儿DNA在孕早期就可检在孕早期就可检测到，且分娩后很快被清除，不会受前次妊娠的影测到，且分娩后很快被清除，不会受前次妊娠的影响。响。vPCR技术能在体外快速简便地扩增特异的技术能在体外快速简便地扩增特异的DNA片段，片段，为基因诊断分析提供了方便，被广泛运用于遗传病为基因诊断分析提供了方便，被广泛运用于遗传病和肿瘤的基因诊断。若和肿瘤的基因诊断。若PCR产物的片段中包含有产物的片段中包含有RFLP的切点，则可将的切点，则可将PCR扩增产物用相应的限制扩增产物用相应的限制酶处理，经电泳后检测其多态性，结合系谱进行分酶处理，经电泳后检测其多态性，结合系谱进行分析，可进行基因诊断
6、。析，可进行基因诊断。vSouthern分子印迹杂交是将酶解后的分子印迹杂交是将酶解后的DNA片段经琼片段经琼脂糖凝胶电泳分离，然后经碱变性，脂糖凝胶电泳分离，然后经碱变性，Tris缓冲液中缓冲液中和，高盐下通过吸附作用将和，高盐下通过吸附作用将DNA从凝胶中转印至硝从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，附着在滤膜上的酸纤维素滤膜上，附着在滤膜上的DNA与与32p标记标记的探针杂交，利用放射自显影技术确定探针互补的的探针杂交，利用放射自显影技术确定探针互补的每条每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小
7、。此法片段的位置和大小。此法可检测出限制性片段长度多态性（可检测出限制性片段长度多态性（RFLP），从而），从而进行基因诊断。进行基因诊断。3实验材料、试剂及器材实验材料、试剂及器材 v3.1 材料：材料：孕妇的新鲜外周血孕妇的新鲜外周血5 ml、琼脂糖凝、琼脂糖凝 胶（新制备）、胶（新制备）、硝酸纤维素滤膜（硝酸纤维素滤膜（NC膜）、透明胶带、防护眼镜、膜）、透明胶带、防护眼镜、塑料瓶、塑料袋、保鲜膜、滤纸、塑料瓶、塑料袋、保鲜膜、滤纸、X光底片光底片v3.2 试剂：试剂：EDTA（乙二胺四乙酸）盐抗凝剂，（乙二胺四乙酸）盐抗凝剂，012 ml 10%的中性的中性buffer溶液溶液(含含4
8、%的甲醛的甲醛)，QIAamp DNA提提取试剂盒取试剂盒(Qiagen)；Taq酶酶(Takara)，双蒸水，双蒸水，PCR缓冲液，缓冲液，dNTP(Promega)，AmpF1STR扩增试剂盒扩增试剂盒(ABI)；BamHI内切酶，内切酶，DNA上样缓冲上样缓冲液，放射性物质（液，放射性物质（32p），变性液，预杂交液，），变性液，预杂交液，2SSC（50%甲酰胺），甲酰胺），X光片冲洗液。光片冲洗液。v3.3 主要仪器：主要仪器：离心机，冰箱，基因扩增仪、微量移液枪离心机，冰箱，基因扩增仪、微量移液枪(20l)，电泳仪，紫外透射仪，封口器，电泳仪，紫外透射仪，封口器，southern印迹
9、杂交印迹杂交实验仪器，水浴锅（实验仪器，水浴锅（0，42，100），琼脂糖），琼脂糖平板电泳装置，放射性检测仪，暗盒（加双侧增感平板电泳装置，放射性检测仪，暗盒（加双侧增感屏）屏）4实验方法及注意事项实验方法及注意事项4.1 方法步骤：方法步骤：v4.1.1 血浆制备：血浆制备：抽取孕妇外周血抽取孕妇外周血5 ml，加入，加入EDTA抗凝剂，抗凝剂，012 ml 10%的中性的中性buffer溶液溶液(含含4%的甲醛的甲醛)进行预处进行预处理。理。v4.1.2 提取胎儿游离提取胎儿游离DNA：v（1）离心）离心 第一次离心：经预处理后的血浆以第一次离心：经预处理后的血浆以1600g的速度的速度
10、 离心离心10min，离心后取上清液置一，离心后取上清液置一20保存备用；保存备用；第二次离心：将第一次离心后的上清液以第二次离心：将第一次离心后的上清液以1300016000g的速度高速离心的速度高速离心10min，离心后取上清液，离心后取上清液置一置一20保存备用。保存备用。v（2）提取胎儿游离）提取胎儿游离DNA：取出上清液按照血样取出上清液按照血样DNA提取试剂盒提取试剂盒(QIAamp DNAbloodmini,Qia2gen)说明书中血液说明书中血液DNA的提的提取方案提取取方案提取DNA。v 利用利用PCR技术进行胎儿技术进行胎儿DNA扩增扩增:采用采用15 bp的随机引物，反应
11、体系为：的随机引物，反应体系为：l0PCR缓冲缓冲液液5l，Taq酶酶5 U，25 mmolL MgC12 5 l，2.5 mmolL dNTP 4l，200 mmolL 15 bp随随机引物机引物5 l，加双蒸水至，加双蒸水至50 l，置于基因扩增仪，置于基因扩增仪上。反应条件为上。反应条件为94预变性预变性4 min 后，开始循环：后，开始循环：94 1 min，37 2 min，55 4 min，循环，循环30次，次，最后最后72 延伸延伸5 min，4保存。保存。v利用利用Southern分子印迹杂交法检测出限制性片段长分子印迹杂交法检测出限制性片段长度多态性（度多态性（RFLP）进行
12、基因诊断）进行基因诊断v 1用用BamHI内切酶酶处理扩增产物，反应体系如内切酶酶处理扩增产物，反应体系如下：下：待酶切待酶切DNA 1g 双蒸水双蒸水 适量适量 10X Buffer BamHI 2l BamHI 0.5-1l 总体积总体积 20l 37孵育孵育1小时或更长时间小时或更长时间 结果可能获得结果可能获得10kb、14kb两种长度的含两种长度的含a珠蛋白基珠蛋白基因簇的因簇的DNA片段。片段。v2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（1）加样：取）加样：取18l胎儿胎儿DNA酶处理液与酶处理液与2l的的DNA上上样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加
13、入样品槽中。（2）电泳：加完样后，插上导线，打开电源，按）电泳：加完样后，插上导线，打开电源，按 照照 需需 要要 调调 节节 电压至电压至120V，电泳开始，观察电泳槽中，电泳开始，观察电泳槽中负极的铂金丝处是否有气泡出现。负极的铂金丝处是否有气泡出现。（3）当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约）当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约1cm时，将时，将电压回零，关闭电源，停止电泳。电压回零，关闭电源，停止电泳。（4）取出凝胶，在波长为）取出凝胶，在波长为302nm的紫外灯下观察染的紫外灯下观察染色后的电泳胶板。色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。红色荧光条带
14、。v3转膜：转膜：将凝胶中的单链将凝胶中的单链DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜片段转移到硝酸纤维素滤膜 上。上。v4探针标记：探针标记：将纯化的将纯化的DNA片段用放射性物质（片段用放射性物质（32p）标记。）标记。5预杂交（预杂交（prehybridizafion）（1）把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预）把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度（热至杂交温度（42）。）。（2）将表面带有目的）将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，用个稍宽于滤膜的塑料袋，用5-10ml2SSC浸湿滤膜。浸湿滤膜。（3）将胎儿）将胎儿DNA置沸水
15、浴中置沸水浴中10min，迅速置冰上冷，迅速置冰上冷 却却1-2min，使，使DNA变性。变性。（4）从塑料袋中除净）从塑料袋中除净2SSC，加入预杂交液，按每，加入预杂交液，按每平方滤膜加。平方滤膜加。（5）加入变性的胎儿）加入变性的胎儿DNA至终浓度至终浓度200g/ml。（6）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，上下颠倒数次以使其混匀，置于上下颠倒数次以使其混匀，置于42水浴中温育水浴中温育4h.v6Southern杂交杂交（1）将标记的）将标记的DNA探针置沸水浴探针置沸水浴10min，迅速置冰，迅速置冰上冷却上冷却1-2min，使，使
16、DNA变性。变性。（2）从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料）从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料 袋，剪开一角，将变性的袋，剪开一角，将变性的DNA探针加到预杂交液中。探针加到预杂交液中。（3）尽可能除去袋中的空气，封住袋口，滞留在袋）尽可能除去袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可能地少，为避免同位素污染水浴，中的气泡要尽可能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。（4）置）置42水浴温育过夜（至少水浴温育过夜（至少18h）。）。v7洗膜洗膜 取出取出NC膜，在膜，在2XSSC溶液中漂洗溶液中漂洗5min，然
17、后按下，然后按下列条件洗膜：列条件洗膜：2SSC，42，10min；1SCC，42，10min；0.5SCC，42，10min；0.2SSC，56，10min；0.1SSC，56，10min。边洗边用放射性检测仪检测放射强度，当。边洗边用放射性检测仪检测放射强度，当放射强度指示数值较环境背景高放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入膜。洗完的膜浸入2SSC中中2min，取出膜，用滤纸，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。v8放射性自显影检测放射性自显影检测（1）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感）将滤膜正面
18、向上，放入暗盒中（加双侧增感 屏）。屏）。（2）在暗室内，将）在暗室内，将2张张X光底片放入曝光暗盒，并用光底片放入曝光暗盒，并用透明胶带固定，合上暗盒。将暗盒置透明胶带固定，合上暗盒。将暗盒置-70低温冰箱低温冰箱中使滤膜对中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在时间，一般在1-3天）。天）。（3）从冰箱中取出暗盒，置室温）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上，使其温度上升至室温，然后冲洗升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗
19、第二张片子）。片子）。4.2 注意事项：注意事项：v1胎儿游离胎儿游离DNA提取时应尽量减少血样放置时间，提取时应尽量减少血样放置时间，以减少细胞坏死和溶解，提高胎儿游离以减少细胞坏死和溶解，提高胎儿游离DNA的检出的检出率。率。v2PCR扩增时，其最关键的是引物的设计：扩增时，其最关键的是引物的设计：长长度为度为1530核苷酸，核苷酸，GC含量含量50%TM值处于值处于5662之间，之间，3末端必须严格与模板末端必须严格与模板DNA配对，其构成配对，其构成DNA延伸的起始点。延伸的起始点。v3PCR扩增时，反应的退火温度应慎重选择，温扩增时，反应的退火温度应慎重选择，温度高可提高特异性，但敏
20、感性降低，温度低则反之。度高可提高特异性，但敏感性降低，温度低则反之。v4印迹时，两块玻璃板之间灌的胶一定要早并且要印迹时，两块玻璃板之间灌的胶一定要早并且要防止胶漏。防止胶漏。v5应确保每孔上样量一致，不致使带跑得比窄。应确保每孔上样量一致，不致使带跑得比窄。v6倒胶的时候，用倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓缓加，不要打的枪沿一侧缓缓加，不要打到头，以免带入气泡。到头，以免带入气泡。v7转膜过程中注意降温，要防止微量进样器被转膜过程中注意降温，要防止微量进样器被 堵。堵。v8内切酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完内切酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于毕后宜立即放置于-
21、20保存。保存。v9把把Buffer和水等充分混匀后再加入内切酶，加入和水等充分混匀后再加入内切酶，加入内切酶后可以用枪吹打或轻轻内切酶后可以用枪吹打或轻轻Vortex混匀。混匀。v10加样时小心操作加样时小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。部凝胶刺穿。v11紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩罩,以免损伤眼睛。以免损伤眼睛。v12因为能结合因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针片段的膜同样能够结合探针DNA。因此，在进行杂交前，必须将膜上所有能与。因此，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，
22、结合的位点全部封闭，v13转膜必需充分，要保证转膜必需充分，要保证DNA已转到膜上。已转到膜上。v14若用到有毒物质，必需注意环保及安全。若用到有毒物质，必需注意环保及安全。v15在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。洗膜不充分会导致背景测仪探测膜上的放射强度。洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性。太深，洗膜过度又可能导致假阴性。v16保鲜膜与硝酸纤维素滤膜之间不能有气泡。保鲜膜与硝酸纤维素滤膜之间不能有气泡。5实验预期结果及遗传指导实验预期结果及遗传指导v预期结果：预期结果：1 2 3 4 10kb 14kb _
23、 _ _ _ v（1）出现结果）出现结果1（aa/aa），正常，建议生育；），正常，建议生育；v（2）出现结果）出现结果2(aa/a-)，静止型，静止型a地中海贫血，患地中海贫血，患 者无任何临床症状和异常血象，者无任何临床症状和异常血象，仅在出生时的脐血仅在出生时的脐血中检出中检出1%5%的的Hb Barts。视情况建议生育；。视情况建议生育；v（3）出现结果）出现结果3（aa/-），轻型），轻型a地中海贫血，临地中海贫血，临床上无明显的临床症状，个别人表现为轻度低色素床上无明显的临床症状，个别人表现为轻度低色素小细胞性贫血，出生时有小细胞性贫血，出生时有5%15%的的Hb Barts。红细
24、胞有轻度形态和渗透性改变，可查到少量的红细胞有轻度形态和渗透性改变，可查到少量的HbH包涵体。建议不生育；包涵体。建议不生育；v（5）出现结果）出现结果4（a-/-），），HbH病，病，建议不生育；建议不生育；v6参考文献参考文献v1王文博、张王文博、张 毅、孙树汉。孕妇外周血中胎儿游离毅、孙树汉。孕妇外周血中胎儿游离DNA在产前诊断中的应用，第二军医大学学报在产前诊断中的应用，第二军医大学学报 2009年年4月第月第30卷第卷第4期。期。v2王修海、姜晓静、纪向虹。孕妇血浆胎儿王修海、姜晓静、纪向虹。孕妇血浆胎儿DNA检检测及其在产前诊断中的应用，青岛大学医学院学报，测及其在产前诊断中的应用
25、，青岛大学医学院学报，2007年年2月第月第43卷第卷第1期。期。v3 龙兴江、龙桂芳、林伟雄。利用孕妇外周血浆中龙兴江、龙桂芳、林伟雄。利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿小片段游离胎儿DNA进行进行a-地中海贫血无创性产前地中海贫血无创性产前诊断，中国优生与遗传杂志，诊断，中国优生与遗传杂志，2008年第年第16卷第卷第10期。期。v4 罗娟、周国华。利用孕妇血浆中胎儿罗娟、周国华。利用孕妇血浆中胎儿DNA进行进行无创性产前诊断的研究进展，药学与临床研究杂志，无创性产前诊断的研究进展，药学与临床研究杂志，2007年第年第15卷第卷第4期。期。v5 刘敬忠、王立荣、黄莉嘉、肖白、周艳。刘敬忠、王立荣、黄莉嘉、肖白、周艳。a地中地中海贫血的基因诊断及产前诊断研究，中华血液学杂海贫血的基因诊断及产前诊断研究，中华血液学杂志，志，2005年年2月第月第26卷第卷第2期。期。v6 李芳秋、郝秀芳、吴元赭。检测孕妇血循环中胎李芳秋、郝秀芳、吴元赭。检测孕妇血循环中胎儿儿DNA进行无创产前诊断的研究进展，中华妇产科进行无创产前诊断的研究进展，中华妇产科杂志，杂志，2004年年3月第月第39卷第卷第3期。期。v7税青林主编。（案例版）医学遗传学，科学出版税青林主编。（案例版）医学遗传学，科学出版社社2012年年1月第二版。月第二版。谢谢观看！