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1、第七章第七章 固定化细胞和酶固定化细胞和酶Immobilizedcellsandenzymes酶催化剂的优点：酶催化剂的优点：专一性强，专一性强，反应条件温和，反应条件温和，反应速度较快。反应速度较快。弱点：弱点：溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；溶液酶稳定性差，易失活。溶液酶稳定性差，易失活。19691969出现了固定化酶技术。出现了固定化酶技术。固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制或固定于某一或固定于某一 局部的空间或者固定于载体上。局部的空间或者固定于载体上。固定化酶生物反应器固定化酶生物反应器
2、实实际际应应用用中中，固固定定化化酶酶可可以以装装在在反反应应器器中中，连连续续生生产产有有利利于于生生产产的的自自动动化化，提提高高生生产产率。率。鉴鉴于于此此，70年年代代以以来来，该该技技术术受受到到各各国国学学者者的的瞩瞩目目，纷纷纷纷开开展固定化酶的研究展固定化酶的研究。固定化方法及固定化后酶和细固定化方法及固定化后酶和细胞的性质胞的性质一、一、固定化的原则和方法固定化的原则和方法由于酶催化作用依靠它的由于酶催化作用依靠它的高级结构高级结构及及活性中心活性中心。固定化时，活性中心的固定化时，活性中心的必需基团避免参加反应必需基团避免参加反应；避避免免高高温温、强强碱碱、有有机机溶溶剂
3、剂以以及及高高浓浓度度盐盐的的处处理理，保保护护靠靠氢氢键键、离离子子键键、疏疏水水键键等等弱弱键键维维系系的的酶酶蛋蛋白白质质的的高高级级结结构构。尽尽可可能能在在温温和和条条件件下下进进行行固固定定化反应。化反应。固定化方法固定化方法：载载体体结结合合法法：将将酶酶（细细胞胞）固固定定在在不不溶溶性性载载体体上上。靠靠共共价价结结合合、离离子子结结合合、和和物理吸附。物理吸附。常常用用的的载载体体：纤纤维维素素、葡葡聚聚糖糖、琼琼脂脂糖糖等多糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。等多糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。载体结合法载体结合法交联法交联法包埋法包埋法8.18.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质
4、固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质交交联联法法：使使酶酶与与具具有有两两个个以以上上官官能能团团的的试试剂剂（戊戊二二醛醛）进进行行反反应应，应应用化学键把酶固定用化学键把酶固定。包埋法包埋法：将酶包在凝胶微小格子内，：将酶包在凝胶微小格子内，或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。固定化方法。常常用用的的凝凝胶胶为为聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺、海海藻藻酸酸钙钙、胶原、卡拉胶等。胶原、卡拉胶等。包埋法简单，可适用于大多数酶包埋法简单，可适用于大多数酶。二、二、固定化酶和细胞的性质固定化酶和细胞的性质1 1、固定化后的活性固定化后的活性 酶经固定化后，活力降低。酶
5、经固定化后，活力降低。原因是原因是：a.a.酶酶和和载载体体结结合合时时，活活性性中中心心的的氨氨基基酸酸也也或或多多或或少少地地参参与与了了结结合合 ，使使得得酶酶的的结结构构发发生生部部分变化，酶活力有一部分丧失。分变化，酶活力有一部分丧失。b.b.由由于于载载体体的的存存在在，有有空空间间位位阻阻，影影响响底底物物和酶接触，酶的活性得不到全部表达。和酶接触，酶的活性得不到全部表达。细细胞胞固固定定化化后后，一一般般酶酶活活力力不不下下降降。细细胞胞内内酶酶受细胞膜、壁的保护。受细胞膜、壁的保护。8.18.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质固定化酶
6、结构的改变固定化酶结构的改变2 2、稳定性、稳定性 酶酶或或细细胞胞被被固固定定化化后后，由由于于载载体体的的存存在在，酶酶分分子子的的结结构构或或细细胞胞被被约约束束，对对外外部部恶恶劣劣环环境境的的敏敏感感性性下下降降，使使其其稳稳定定性性增增加加（对对热热、对对各各种种化化学学试试剂剂等等）。而而且且有有时时稳稳定定性性增增加加的的幅度比较大。幅度比较大。3 3、催化活性、催化活性 （底物专一性，反应的（底物专一性，反应的pHpH值，值，T T，动力学常数）动力学常数）a.a.底底物物专专一一性性：当当底底物物为为大大分分子子时时，酶酶或或细细胞胞对对底底物物专专一一性性下下降降；当当底
7、底物物为为小小分分子子时时，酶酶或细胞对底物专一性变化不大。或细胞对底物专一性变化不大。b b最适最适pHpH：依固定化载体与酶分子、细胞上依固定化载体与酶分子、细胞上所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化，所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化，有的不变化，有的向有的不变化，有的向pHpH小的方向移动，有的小的方向移动，有的向向pHpH大的方向移动。大的方向移动。3 3、催化活性、催化活性 （底物专一性，反应的（底物专一性，反应的pHpH值，值，T T，动力学常数）动力学常数）c.c.反应的反应的最适温度最适温度 固固定定化化酶酶、细细胞胞的的最最适适温温度度往往往往升升高高，升高的幅度不同
8、，升高的幅度不同，215215 o oC C不等。不等。d.d.动力学常数动力学常数 酶：米氏常数酶：米氏常数kmkm反映了酶和底物的亲和力。反映了酶和底物的亲和力。固定化酶的表现固定化酶的表现Km(app)Km(app)与游离酶的与游离酶的KmKm相比相比有些不变，有的变化很大。有些不变，有的变化很大。3 3、催化活性、催化活性 （底物专一性，反应的（底物专一性，反应的pHpH值，值，T T，动力学常数）动力学常数）原原因因可可能能是是：载载体体间间的的静静电电作作用用，以以及及扩扩散散效效应应。如如果果固固定定化化酶酶区区域域的的底底物物浓浓度度比比外外部部液液相相主主体体溶溶液液高高，K
9、m(app)Km(app)下下降降。相相反反，用用包包埋埋法法的的固固定定化化酶酶的的Km(app)Km(app)值值，可可较较游游离离酶酶多多两两个个数数量量级级。这这是是由由于于凝凝胶胶中中的的扩扩散散效效应应使使底底物物浓浓度度减减少少，导导致致内内部部底底物物浓浓度度低低于于外部区域的浓度，外部区域的浓度，Km(app)Km(app)上升。上升。对于固定化细胞，情况类似。对于固定化细胞，情况类似。Vmax Vmax 一般不变化。一般不变化。8.2 8.2 固定化酶和固定化细胞的应用固定化酶和固定化细胞的应用在在7070年年代代初初，首首先先固固定定单单一一的的酶酶，催催化化单单一一反应
10、；反应；随随后后同同时时固固定定两两种种酶酶或或两两种种以以上上的的酶酶，以以及及固定化酶和辅酶，催化复杂一些的反应；固定化酶和辅酶，催化复杂一些的反应；再再后后来来发发展展起起来来的的固固定定化化细细胞胞技技术术，使使得得不不易易提提取取的的不不稳稳定定的的酶酶的的利利用用有有了了方方便便条条件件，还还可可以以利利用用活活细细胞胞的的完完整整代代谢谢体体系系来来完完成成复复杂的反应。杂的反应。如乙醇的生产。如乙醇的生产。8.2 8.2 固定化酶和固定化细胞的应用固定化酶和固定化细胞的应用在固定化酶、固定化细胞的研究中发展在固定化酶、固定化细胞的研究中发展起来的起来的亲和层析技术亲和层析技术，
11、已经远远超出了已经远远超出了 利用酶和微生物进行催化反应的范畴。利用酶和微生物进行催化反应的范畴。例如抗体抗原的提纯是利用了特异的免例如抗体抗原的提纯是利用了特异的免疫吸附反应。疫吸附反应。固定化酶和细胞技术的显著特点固定化酶和细胞技术的显著特点：1 1连续反应；连续反应；2 2获得的产物纯度高；获得的产物纯度高；3 3固固定定化化酶酶或或细细胞胞可可重重复复使使用用，减减少少 了浪费；了浪费；4 4易实现自控易实现自控。应用实例：应用实例：DL-DL-氨基酸的光学拆分氨基酸的光学拆分 人人体体只只能能利利用用L-L-氨氨基基酸酸，所所以以L-L-氨氨基基酸酸在在食食品品医医药药领领域域的的应
12、应用用非非常常广广泛泛，并并且且需要量不断增加。需要量不断增加。化化学学合合成成法法是是生生产产氨氨基基酸酸的的方方法法之之一一，该该法法成成本本低低，但但生生产产出出来来的的氨氨基基酸酸是是DL DL 外外消消旋旋体体。要要想想把把L-L-氨氨基基酸酸分分离离出出来来，需要进行光学拆分。需要进行光学拆分。复习几个概念：复习几个概念：外外消消旋旋体体：对对映映体体的的右右旋旋体体和和左左旋旋体体等等量量混混合合后后，它它们们的的旋旋光光性性相相互互抵抵消消，不不再再有有旋旋光光性性。这这样样的的混混合合物物称称为为外外消消旋旋体体，以以D、L表表示示。外外消旋体可以用适当方法拆开或分开。消旋体
13、可以用适当方法拆开或分开。复习几个概念：复习几个概念：外外消消旋旋化化：在在一一般般情情况况下下，和和不不对对称称碳碳原原子子相相连连的的四四个个原原子子或或原原子子团团，不不能能随随意意调调换换位位置置，因因此此对对映映体体不不能能相相互互转转换换，旋光度维持不变。旋光度维持不变。但但在在热热、光光、或或者者化化学学试试剂剂的的影影响响下下，不不对对称称碳碳原原子子上上的的原原子子或或原原子子团团可可发发生生调调换换现现象象，使使旋旋光光物物质质转转化化为为它它的的对对映映体体，最最后后得得到到外外消消旋旋体体，原原来来100%的的左左旋旋体体，经经变变化化后后，变变成成50%左左旋旋体体和
14、和50%的右旋体，这种现象称为外消旋化。的右旋体，这种现象称为外消旋化。DL-DL-氨基酸光学拆分中，以酶法最佳，它氨基酸光学拆分中，以酶法最佳，它是利用酰化氨基酸水解酶，制备纯度高是利用酰化氨基酸水解酶，制备纯度高的的L-aaL-aa，且收率高且收率高。氨基酰化氨基酰化EDL-R-CHCOOH+H2OL-R-CH-COOH+D-R-CHCOOH不对称水解不对称水解NH2NH2NHCOR溶解度小溶解度小酰化酰化-DL-aaL-aa酰化酰化D-aa外消旋化外消旋化外消旋体外消旋体固定化酶光学拆分固定化酶光学拆分DL-DL-氨基酸生产流程氨基酸生产流程19691969年，日本千钿一郎成功地利用固年
15、，日本千钿一郎成功地利用固定化酰化氨基酸水解酶，由酰化定化酰化氨基酸水解酶，由酰化-DL-DL-氨基酸连续生产氨基酸连续生产L-aaL-aa获得成功。获得成功。这是这是世界上世界上固定化酶在工业生产上应固定化酶在工业生产上应用的用的第一个实例第一个实例。各种光学活性氨基。各种光学活性氨基酸都用这种方法生产。该项技术成功酸都用这种方法生产。该项技术成功的关键是制造出适合于工业化要求的的关键是制造出适合于工业化要求的固定化酶。固定化酶。果葡糖浆的生产果葡糖浆的生产葡葡萄萄糖糖不不能能直直接接代代替替蔗蔗糖糖，因因甜甜度度不不够够，但但葡葡萄萄糖糖和和果果糖糖是是同同分分异异构构体体，葡葡萄萄糖糖可可以异构为果糖以异构为果糖。Glucosefructose+Glucose高果糖浆的甜味是蔗糖的高果糖浆的甜味是蔗糖的2 2倍。倍。这这一一应应用用是是目目前前世世界界上上使使用用固固定定化化酶酶规规模模最大的生产上的实例。最大的生产上的实例。高果糖浆高果糖浆葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶