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1、5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的表达的影响影响 作者：杜雅冰，邵应举，樊青霞，孙桢，王琳，赵培荣 作者单位：(郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南郑州450002)【摘要】目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞
2、株Eca9706，并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化，FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化，RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达，免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态，经5-Aza-CdR处理后，超甲基化状态解除，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率明显提高(P0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强，同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P0.05)。结论食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达，当
3、其超甲基化解除后，细胞增殖受到抑制，同时细胞凋亡率相应提高。【关键词】食管癌;组织因子途径抑制物-2;5-氮杂-2-脱氧胞苷;甲基化;免疫组化;逆转录聚合酶链反应;凋亡 ABSTRACT：ObjectiveTo explore the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine(5-Aza-CdR)intervention on the growth and proliferation of Eca9706 cell line and protein expression of tissue factor pathway inhibitor-2(TFPI-2).Metho
4、dsEca9706 cell line was treated by 5-azaCdR of different concentrations;MTT，flow cytometry，immunohistochemistry and RT-PCR were used to determine the cell growth，apoptosis，and the expression of TFPI-2 gene and its protein.ResultsEca9706 cell line had hypermethylation of TFPI-2.After demethylation by
5、 5-Aza-CdR treatment，the proliferation of Eca9706 was inhibited，the apoptosis rate was also increased significantly in the concentration-dependent manner.RT-PCR detected that mRNA expression of TFPI-2 gene in Eca9706 cell line recovered significantly(P0.05).Conclusion5-Aza-CdR can slow the growth of
6、 Eca9706 cell，increase the apoptosis rate，reactivate the TFPI-2 gene transcription and protein expression by demethylation.KEY WORDS：esophageal carcinoma;tissue factor pathway inhibitor-2;5-Aza-CdR;methylation;immunohistochemistry;RT-PCR;apoptosis 组织因子途径移植物2(tissue factor pathway inhibitor，TFPI-2)是丝
7、氨酸蛋白酶抑制物，在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。目前，关于TFPI-2在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少。本研究旨在探讨TFPI-2基因的失活机制，并寻找食管癌治疗的新靶点。1材料与方法 1.1材料 RPMI-1640培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司;标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限公司;Trizol试剂购自MBI公司;RT-PCR试剂盒购自MBI公司;5-Aza-CdR购自Sigma公司;人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤生物学研究室惠赠。1.2细胞培养和药物处理 人食管癌细胞Eca9706以含10 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，37、50
8、mL/L CO2培养箱培养，每23 d消化传代1次。1.3MTT法检测干预前后细胞增长率的变化 取对数生长期细胞，调整密度至5104/mL接种于96孔板，按5-Aza-CdR浓度分为6组：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mol/L，每组复设5个孔。待细胞贴壁后，分别于24、48、72 h后加入MTT液，4 h后弃去上清液，每孔加DMSO 150 L，在490 nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A)。细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR)按公式计算：CPIR=(1-实验组A均值/对照组A均值)100
9、%。1.4流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化 取对数生长期细胞，按5105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药，分组如下：对照组(0 mol/L),1.6 mol/L 5-Aza-CdR组，25.6 mol/L 5-Aza-CdR组，102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48 h后消化收集细胞，700 mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。1.5RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达 分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48 h。TFPI-2的上、下游引物分别为5-GTCGATTCTGCTGTTTTCC
10、-3和5-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3，合成产物为440 bp;-actin作为内参照，上下游引物分别为5-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3和5-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3，合成产物为301 bp。按照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游产物进行PCR反应扩增目的基因。反应条件为：94 预变性3 min，然后94 变性30 s,51 退火30
11、s,72 延伸30 s，循环30次，最后72 延伸5 min,4 保温。扩增片段经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.6免疫组化方法检测TFPI-2蛋白的表达 取对数生长期细胞，按5104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后加药(分组同RT-PCR)。培养48 h后加入40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10 min,100 mL/L动物血清封闭，室温下10 min，滴加1100的稀释的TFPI-2抗体4 过夜，二抗室温下1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。另取爬
12、片滴加PBS 液代替一抗作为阴性对照。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。光镜下随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1 000)100%。1.7统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数标准差(x-s)表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准=0.05。2结果 2.1干预前后细胞增长率的变化 经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作用时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1不同浓度的5-aza-CdR对Eca97
13、06细胞增殖的影响 2.2干预前后细胞凋亡率的变化 流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48 h后，Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%，与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组(1.390.27)%比较差异有统计学意义(P0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P0.05，图1)。以上实验重复5次。2.3干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2 mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2 mRNA在未用
14、药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4 mol/L 5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2 mRNA表达，表明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2 mRNA表达逐渐增强(图2)。图1各组流式细胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6 mol/L 5-Aza-CdR组;C：25.6 mol/L 5-Aza-CdR组;D：102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。图25-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2 mRNA的表达M：DNA marker;-actin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：对照组;2：102.4mol/L组;3：2
15、5.6 mol/L组;4：1.6 mol/L组;5：H2O对照组。,2.4干预前后TFPI-2蛋白的表达情况免疫组化结果显示，经5-Aza-CdR作用Eca9706细胞48 h，TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6 mol/L组、25.6 mol/L组、102.4 mol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.101.42)%、(9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P0.05，图3)。图3各组TFPI-2蛋白的表达情况 3讨论 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域
16、，全长由8164个碱基组成，其cDNA全长为1 222 kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过80%1。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降2。有研究证实，在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关1,3-5。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清楚，然而众多证据表明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发
17、生的重要机制之一6-8。目前，有体外实验表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能9。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca9706细胞中无表达，经过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。MIZUNO等10研究表明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高412倍，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据MTT实验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制，且随着药物
18、浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析，DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂量呈正相关，推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关。进而通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加，并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等11在同等条件下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿瘤细胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对Eca9706细
19、胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因为使TFPI-2重新表达的结果。目前，国外以TFPI-2为药物研究靶点，就TFPI-2在肿瘤治疗、肿瘤临床诊断、促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用，也正在进行广泛深入的研究。本研究用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理人食管癌Eca9706细胞株，检测TFPI-2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响，以期寻找治疗肿瘤的新靶点。【参考文献】1HUBE F，REBERDIAU P，IOCHMANN S，et al.Characterization and functional analysis of TFPI-2 gene pro
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