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1、Hela细胞传代培养实验目的：掌握动物细胞培养的基本原理和方法。实验用具：离心管（2支），移液枪（每个台面一把），枪头（每个台面一盒），吸管（4根），培养皿（每组2个）实验药品：胰酶，DHanks，1640培养基培 养 板 常用玻璃器皿清洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（2424小时）、小时）、小时）、小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、5050烘干烘干烘干烘干清洁液的配制HeLa 是Henr
2、ietta Lacks的简称，Henrietta Lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。细胞培养的甚本概念传代传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。培养细胞的特性贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状
3、态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。1010分钟一分钟一4 4小时小时 贴壁期贴壁期细胞附着于底物上，游离期细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在结束。细胞株平均在1010分分钟一钟一4 4小时贴壁。小时贴壁。血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）进口塑料培养瓶涂有生长基
4、质（化学合成的功能基团）潜伏期潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为期一般为6 62424小时。小时。对数生长期：对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。行实验研究。停止期（平台期）停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞生长的条件1 1 细胞的营养需要细胞的营养需要2 2 细胞的生存环境细胞的生存环境 温度温度:37:37 O O2 2 CO
5、CO2 2:5%CO:5%CO2 2+H+H2 2O HO H2 2COCO3 3 H H+HCO3+HCO3-渗透压渗透压 3 3 无污染无污染 4 4 无毒无毒 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。n箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3 3种种 1 1悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（100
6、01000转转/分分）去上清，沉淀物加新培养）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l l2 2一一2 23 3，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.2.悬浮生长细胞传代（悬浮生长细胞传代（HelaHela细胞）细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.3.贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代采用酶消化法
7、传代。常用的消化液有的胰蛋白酶液。采用酶消化法传代。常用的消化液有的胰蛋白酶液。2 细胞培养用液的配制D-Hanks原液试剂配方 氯化钠 80.0g 磷酸氢二钠（Na HPO 2H O）0.6g 氯化钾 4.0g 磷酸二氢钾 0.6g 三蒸水 1000ml D D-H Ha an nk ks s工工作作液液试试剂剂配配方方D D-H Ha an nk ks s原原液液 1 10 00 0mml l 三三蒸蒸水水 8 89 96 6mml l 0 0.5 5%酚酚红红液液 4 4mml lD-Hanks工作液试剂配方D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5%酚红液 4ml 消化
8、液：胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用于于与与赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸相相连连接接的的肽肽健健，除除去去细细胞胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰胰蛋蛋白白酶酶液液浓浓度度越越高高，作作用用越越强强，但但超超过过一一定定限限度度会会损损伤伤细细胞。胞。胰胰蛋蛋白白酶酶是是一一种种黄黄白白色色粉粉末末，用用无无Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS缓缓冲冲液液配配制常用的胰蛋白酶液浓度是制常用的胰蛋白酶液浓度是 。用滤器过滤除菌。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-102-10分钟。分钟。用含血清培养液
9、终止其对细胞的消化作用用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。合成培养基。天然培养基：天然培养基：天然培养基：天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。缺点：来源受限。成分复杂，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染易发生支原体
10、污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199TC199、MEMMEM、RPMI-1640RPMI-1640、DMEM DMEM等。等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低成本低 缺点：缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需
11、缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。要。人人工工合合成成培培养养基基只只能能维维持持细细胞胞生生存存，要要想想使使细细胞胞生生长长和和繁繁殖殖，还还需需补补充充一一定定量量的天然培养基（如血清）。的天然培养基（如血清）。血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子多种金属离子 激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分一般说来含一般说来含5 5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不小牛血清的培养基对大多
12、数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加死但支持细胞生长一般需加 10 10血清血清对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚复杂成分至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要
13、在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞用无血清培养基培养细胞无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如子，如激素、生长因子激素、生长因子 、结合蛋白结合蛋白 、贴壁和扩展因子贴壁和扩展因子 等。等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。19751975年年，SatoSato首首次次成成功功地地用用无无血血清清培培养养基基培培养养了了垂垂体体细细胞胞株株，近近2020多多年年来来已已报报道道了了几几十十种种细细胞胞系系在
14、在无无血血清清培培养养基基中中成成功功地地生生长长和和增殖。增殖。无无血血清清细细胞胞培培养养基基的的使使用用保保证证了了实实验验结结果果的的准准确确性性、可可重重复复性性和和稳稳定定性性，减减少少了了细细胞胞污污染染，简简化化了了提提纯纯和和鉴鉴定定各各种种细细胞胞产产物物的的程序。程序。向向无无清清培培养养液液中中能能促促进进细细胞胞系系生生长长的的补补加加物物都都是是独独特特的的。适适用用于于某某种种细细胞胞株株的的培培养养液液，很很可可能能不不适适合合另另一一种种细细胞胞株株的的生生长长。即即使使同源组织的不同细胞株，所需同源组织的不同细胞株，所需补加物补加物也不同。也不同。无血清培养
15、基尚处于研究阶段，难以推广。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 血清质量好坏是实验成败的关键。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：血清的灭活（消除补体活性）：56 56 ，30 30
16、 分钟分钟血清的消毒：过滤除菌血清的消毒：过滤除菌抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升链霉素最终使用浓度为每毫升100100单位。单位。庆大霉素：每毫升庆大霉素：每毫升100100单位单位方便、广谱、稳定方便、广谱、稳定完全培养基的组成基础培养基基础培养基 80 80一一9595血清血清 5 5一一2020（一般加（一般加1010）碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g/L
17、2.0 g/L青、链霉素青、链霉素 各各100100卑位毫升卑位毫升实验前的准备培养基的配置培养基的配置RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升加三蒸水 至 1000ml,过滤除菌。调节pH值至 加血清（终浓度 10）消化液的配置消化液的配置胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用Dhanks配置。配制常用的胰蛋白酶液浓度是。用滤器过滤除菌实验步骤1.1.打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。2 2从冰箱中取出胰酶、从冰箱中取出胰酶、D DHanksHanks、培养基。、培养基。可以把胰酶和可以把胰酶和D DHanks
18、Hanks的瓶盖打开或者拧松。的瓶盖打开或者拧松。3.3.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，加入加入D DHanksHanks。轻轻摇动后将。轻轻摇动后将HanksHanks弃掉。弃掉。4.4.用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇动。整个细胞培养面为宜，轻轻摇动。2 25 5分钟后迅分钟后迅速将消化液吸出。消化时间长短是实验成败的关速将消化液吸出。消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。否则细胞会变死。键，宁可短消化，不能过消化。否则细胞会变死。在倒置显微镜下观察，
19、当细胞质回缩，胞间间隙在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消化适宜。加大为消化适宜。5 5取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进细胞悬液。吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打到，成片的细胞行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。不要过猛，尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。6 6
20、至所有细胞从培养皿底部脱落下来，然后吸取至离心管至所有细胞从培养皿底部脱落下来，然后吸取至离心管中。中。1000 rpm1000 rpm离心离心5 5分钟。（无需准确计数时离心可略）分钟。（无需准确计数时离心可略）7 7细胞离心毕，尖吸管弃去上清，吸取培养基适量，加入细胞离心毕，尖吸管弃去上清，吸取培养基适量，加入离心管，将细胞重悬、吹匀。（无需准确计数时离心可略）离心管，将细胞重悬、吹匀。（无需准确计数时离心可略）8 8吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。细胞悬液加吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。细胞悬液加入新的培养皿中，培养密度为入新的培养皿中，培养密度为11051105106/ML106/ML。显微镜下。显微镜下观察，摇匀，放入观察，摇匀，放入3737度度C02C02培养箱孵育。培养箱孵育。9 9待培养基（本身为红色），当待培养基（本身为红色），当pHpH值降低，培养基呈偏淡值降低，培养基呈偏淡红色时，一般红色时，一般2 2天以后，将旧的培养基吸掉，更换新鲜培养天以后，将旧的培养基吸掉，更换新鲜培养基继续培养。基继续培养。