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1、 Rh血型系统及检测技术血型系统及检测技术湖南省人民医院湖南省人民医院 欧阳显楚欧阳显楚 概 述Rh血型在红细胞血型系统中序列为4，符号为RH。数字表示为004。ISBT现已确定的Rh血型抗原有46个，其中D、C、E、c、e抗原分别表示为或004001，004002，004003，004004，004005.人类Rh血型基因位于染色体上，现已明确Rh血型的双结构基因（two structure RH genes）摈弃传统假说，即Fisher-Race的紧密连接的3个基因位点C、D、E基因假说和wienerr Rh-Hr多等位基因位点的单基因假说。由于Fisher-Race CDE命名能够简单明
2、了表述Rh血型系统，且在文献中及日常血型工作中也更为人们所熟悉，故Rh血型CDE表述和ISBT规范的数字、字母及6位数字表同时应用，而不再使用Rh-Hr的表达方式。Rh血型基因 编码Rh血型抗原为两个高度同源的基因RHD基因和RHCE基因，RHD编码D抗原，RHCE编码Cc/Ee抗原。RHD抗原阳性者的人有RHD和RHCE基因，而RHD阴性的人绝大部分只有RHCE基因无RHD基因，或少部分为RHD阴性者有无功能的RHD基因，因此不存在d抗原，也无抗-d抗体。RHD和RHCE基因均含有10个内含子和10个外含子，其两基因碱基数量及排列基本是一致的。Rh血型抗原 Rh血型基因编码两条多肽，即RHD
3、编码D抗原多肽，RHCE基因编码CcEe多肽，两条多肽均为416个氨基酸组成，贯穿红细胞膜12次，成6个环，NH2端和COOH端均在细胞浆中。应用分子生物学技术和单克隆抗D试剂研究结果，摈弃了传统的DuD variant和Dmosaic等几种表示弱D抗原的方式。现将RHD抗原分为5种，分别是：（1）D-正常D抗原（2）弱D(WeakD）-抗原质正常而量少的RhD抗原（3）不完全D-抗原(partial D)数目基本正常，缺少部分D抗原表位，（4）不完全弱D(partial weak D)型抗原数量少同时缺少抗原决定簇的D抗原（5）增强性D-(elevated D)D抗原在数量上增加很多，抗原性
4、增强。Rh血型抗原只存在于红细胞膜中，不存在于其他组织细胞膜、体液和分泌液中。Rh血型抗体 Rh血型抗体是妊娠、输血或其他明确原因产生的同种异型免疫抗体。极少见RH血型自然发生的抗体。自身免疫性溶血性疾病体内可发现Rh自身抗体。人源淋巴细胞杂交瘤技术制备的RH血型单克隆抗体已被用于临床常规血型试剂，也被应用于Rh血型抗原表位的研究。Rh血型功能 Rh血型抗原多肽在红细胞膜上发挥结构和功能蛋白的作用，即维持红细胞膜结构完整性，同时发挥着阳离子膜转运通道的作用，以及可能发挥着磷脂酰丝氨酸在细胞膜双层间运动的催化作用。历史和命名Rh血型发现和历史：1939年Levine 和Stetson发现一例流产
5、死胎妇女的血清凝集其丈夫红细胞，也凝集ABO血型相容80%献血者的红细胞，实验表明该红细胞抗原不同于当时已发现的人类ABO、MN、和P血型抗原。他们认为是该妇女被胎儿携带的源自父亲的抗原所免疫，产生的抗体与父亲红细胞反应，也是该抗体导致胎儿溶血死亡。1940年Landsteiner和Wiener用恒河猴红细胞免疫兔（后来用豚鼠），产生的抗体与恒河猴红细胞反应，也凝集85%的白人的红细胞。同年，Wiener和Peter通过实验认为Levine和Stetson发现的血清抗体和其他一些输用ABO血型相容血液之后，发生输血反应的病人血清中抗体与抗-Rh是一致的。但两年后的1942年，Fisk和Foor
6、d确证动物和人抗-Rh是不同的特异性：所有新生儿红细胞，用人抗-Rh确定的不论是Rh阳性或者Rh阴性，与动物抗-Rh反应均为阳性。然而，又经过20年时间，证明动物和人抗-Rh识别的是不同抗原。1963年Levine提议将动物抗-Rh识别的抗原命名为LW,以纪念Levine和Wiener的工作。考虑已发表的成千上万篇文章，人们已形成习惯，故将Levine和Stetson发现的人抗体所识别的抗原仍称之为Rh抗原。目前已明确Rh和LW是不同的血型系统，Rh系统序列为4，LW序列为16，各具有不同的的抗原，各自编码基因分别位于染色体第1和19条上，基因已被克隆出来。在60年代中期，人们发现孕妇D抗原阴
7、性，胎儿RhD阳性。在胎儿出生后很短时间内母亲被注射抗D免疫球蛋白，能够防止由于RhD血型不相容妊娠所导致的母亲被D抗原免疫，有效地预防胎儿新生儿溶血病（HDN）。这样，在Levine和他的同事发现了HDN的病因并能够成功地采取预防措施，这经过了1/4世纪左右的时间。Rh血型命名 Fisher-Race假说和命名：1943年Fisher使用Race提供的4种Rh血型抗体，发现其中两种是对应的，识别的是等位基因编码的抗原称之为C和c,而另外两种抗体识别的抗原显示不是等位基因编码的称之为D和E。Fisher设想它们是紧密连锁的3个基因编码；D或d、C或c、E或e抗原，并由此可组成8个不同的基因复合
8、物或单倍体。之后又出现了抗-e,支持Fisher假说，但始终未发现-d。目前CDE表达和ISBC规范的字母/数字和数字量表达方式同时使用。Winer假说字母数字表述：Rosenfield等人1962年提出一种更适合电子计算机语言的字母/数字方式来表达Rh血型方式。抗D和抗Rh表述为抗Rh1,D+红细胞为Rh:1,D-为Rh:-1,等位基因表示为R1和R-1。传统的CDE、Rh-Hr和ISBT规范的以字母、数字方式对Rh基因复合物的表述以及其频率，见表1表1 Rh 基因复合物三种表述及频率 基因 复合物 频率-CDE Rh-Hr 字母/数字 英国 中国(广东人)-双结构基因模型 Tippert在
9、1986年提出Rh血型的双结构模型:一个基因编码D抗原,另一个编码CcEe抗原;一些少见的Rh复合物即Rh抗原不正常表达的原因被认为是基因的突变或两等位位点不交换等,之后分子生物学研究大量结果证实了Tippert提出的Rh血型双结构基因模型(two structural Rh gene models),见图.D阳性（RH：1）D阳性（RH：-1）图 RH双结构基因Two Structural Rh GenegD基因 CE基因D抗原多肽 Cc和Ee抗原多肽X无D基因 CE基因 Cc和Ee抗原多肽无效D基因 CE基因 Cc和Ee抗原多肽X不编码D抗原多肽(1986年Tippett提出，cDNA，P
10、CR技术证实)1、RH血型抗原由两个基因编码，RHD编码D抗原，RHCE编码Cc/Ee抗原。2、RHD阳性人有RHD和RHCE基因，RHD阴性人大部份只有RHCE基因无RHD基因，但少部分人有无功能的RHD基因。3、RHD和RHCE基因均为10个外含子和10个内含子。4、RHD无等位基因，既无d基因，也必然无d抗原和-d抗体。5、现在已经摈弃了RH血型基因两个假说：（1）Fisher-Races:C,D,E三个紧密连接的基因位点学说。（2）wieners:Rh-Hr单一基因的多等位基因假说。D抗原D血型抗原 ISBT表述为RH1或004001。发生频率在高加索人约为85%，黑人为92%，亚洲人
11、和土著美国人99%以上。D抗原只存在于红细胞膜（包括脐带血红细胞）不存在于其它组织细胞中，体液和分泌液中也无D抗原。D抗原的表述有量的变化和质的变化。D抗原量的变化表现其抗原性的强弱。表型D/D抗原量最多，抗原性最强，而弱D抗原量少，最弱的抗原是Del，要通过试验确定Del抗原性。每个红细胞D抗原数为普通D表型1.01043.3104，弱D表型2.01021.0104，增强型D表型7.51044.5104。在C抗原存在时，D抗原性减弱DcE/DcE红细胞的D抗原性强于DCe/DCe红细胞。对一些常见的红细胞的D抗原强度序列大致是：DcE/DcEDCe/DCeDcE/dce（见正文），D抗原的质
12、变主要是指D抗原表位数目减少。RH基因变异导致D抗原表位部分缺失，大多数表现为抗原性减弱，但部分抗原性正常增强。该类红细胞称之D抗原性表位不完全型红细胞（Partial D red Cells）。D抗原性表位不完全红细胞也为D阳性，但是有D表位不完全型红细胞的人可能由输血后妊娠产生针对其红细胞缺失的抗原表位的抗体。D抗原分类：根据D抗原的数量和质量不同以及抗原性不同，将D抗原分类为5种。（1）D：常见的D抗原。（2）弱D：只是D抗原量少，质无变化，现称之为DU，不同于传统的DU，传统的DU包括D抗原量减少和质量变化的红细胞。（3）表位不完全型D（Partial D）D抗原数数目基本正常，但缺失
13、正常D抗原上部分抗原表位。（4）表位不完全型弱D：缺失部分D抗原决定簇同时D抗原数目也减少。（5）增强D：D抗原数数量增多，抗原性大大加强。D抗原与临床 D抗原、抗体与输血的关系仅次于ABO血型，RhD阴性人接受阳性血后，至少20%要对D抗原发生致敏，在第二次体内接触（再次输注Rh阳性血）该抗原则会发生溶血反应。RhD阴性妊娠妇女的胎儿是阳性时，可能胎儿红细胞通过胎盘进入母体，RhD抗原致敏母体，该妇女再妊娠时，就可能发生新生生溶血病。ABO-HDN将近半发生于第一胎。Rh-HDN的第一胎往往不发病，除非母亲曾接受过Rh阳性血或第一胎是Rh阳性而且母亲已产生了对抗以后婴儿红细胞的抗体。西方国家
14、妊妇Rh-HDN约占全部新生儿1/180。ABO-HDN发病率约为1/40，但症状比Rh-HDN较轻。卫生部制定的临床输血技术规范规定，从2000年10月1日起，每个病人均要检查Rh(D)血型，这是确保临床输血安全有效的又一项重要举措。各单位要认真落实规范精神。采供血机构也要适应这一新形势，开展Rh血型检测及HDN的有关实验室检查，确保病人的安全。RH血型检测 一、血清克隆抗D检测D抗原原理：由细胞培养而得的lgM人类免疫球蛋白单克隆抗体，适合于玻片法和试管法，用来鉴定人Rh血型系统中的D抗原。操作步骤（试管法）：1、用等渗盐水配制3%5%待检红细胞悬液。2、在相应标记的试管中加一滴血清克隆抗
15、D试剂和一滴红细胞悬液。3、1000rpm(150g)离心2分钟或3000rpm（1000g）离心20秒。4、轻轻振荡，悬浮沉积细胞，观察凝集结果。5、若反应为阴性、弱阳性或可疑，20摄氏度孵育15分钟。6、1000rpm（150g）离心2分钟或3000rpm（1000g）离心20秒。7、轻轻振荡，悬浮沉积细胞，观察凝集结果。二、用五种抗血清检查Rh血型1、初筛实验结果为Rh(D)阴性，可进一步用抗C、抗c、抗D、抗E、抗e检测受检查Rh血型18种表现型。2、如初筛结果Rh(D)阴性，最好送血型参比实验室做进一步确证试验。3、用五种抗血清检查Rh血型结果判定。用五种抗Rh血清检查结果判定与各种抗血清的反应 受检者 字母/数字表示 抗C c D E e Rh表型