《培养基及制备》课件.ppt

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1、培养基组成培养基组成培养基培养基：指一切可供微生物细胞生长繁殖和生物合成各种代指一切可供微生物细胞生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。谢产物所需的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基的作用：培养基的作用：满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物的形成促进产物的形成一、基本营养源一、基本营养源 1、碳源、碳源 凡可提供微生物菌种的生长繁殖所需的能凡可提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源及合成菌体和产物所必需的碳骨架成分源及合成菌体和产物所必需的碳骨架成分的营养物质。的营养物质。常用的碳源有：常用的碳源有：糖类、油脂、有机酸和低碳醇等糖类、油脂、有机酸和低

2、碳醇等工业上常用的糖类工业上常用的糖类 葡萄糖葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应但是会引起葡萄糖效应 糖蜜糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。是制糖工业的副产物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。糖蜜分甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜糖蜜分甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。淀粉、糊精淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点缺点：难利用、发酵液比较稠、一般：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一时加入一定的定的-淀粉酶，成分比较

3、复杂，有直链淀粉和支链淀淀粉酶，成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。粉等。优点优点：来源广泛、价格低难利用，可以解除葡萄糖效应：来源广泛、价格低难利用，可以解除葡萄糖效应工业上常用的糖类工业上常用的糖类 油脂类：油脂类：能利用这类碳源的能利用这类碳源的M一般都有比较活跃的脂一般都有比较活跃的脂肪酶。肪酶。M利用这类碳源时所消耗的溶解氧会利用这类碳源时所消耗的溶解氧会增加，当供氧不足时，会引起增加，当供氧不足时，会引起pH下降。下降。常用的油脂类有：各种动、植物油，豆油、常用的油脂类有：各种动、植物油，豆油、菜籽油、棉籽油、鱼油、猪油等。菜籽油、棉籽油、鱼油、猪油等。有机酸有机酸有机酸的利用常

4、会引起发酵体系有机酸的利用常会引起发酵体系pH上升，尤上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随有碱性物质的其是有机酸盐氧化时，常伴随有碱性物质的产生，使产生，使pH进一步上升。进一步上升。常用的有机酸有：乳酸、醋酸、柠檬酸等。常用的有机酸有：乳酸、醋酸、柠檬酸等。烃和低碳醇类烃和低碳醇类正烷烃已经用于有机酸、氨基酸、抗生素、正烷烃已经用于有机酸、氨基酸、抗生素、维生素和酶制剂发酵中，甘油也常用作抗生维生素和酶制剂发酵中，甘油也常用作抗生素生产和甾体转化的碳源。素生产和甾体转化的碳源。、氮源：、氮源：凡可构成细胞和代谢产物中氮素凡可构成细胞和代谢产物中氮素来源的物质。来源的物质。常用的氮源分两大类：有

5、机氮源和无机氮源。常用的氮源分两大类：有机氮源和无机氮源。（）无机氮源（）无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓速速效氮源。效氮源。但无机氮源的迅速利用会引起但无机氮源的迅速利用会引起pH的变化的变化(NH4)2SO4 2NH3+2H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH（）有机氮源（）有机氮源 来源：来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母

6、粉、鱼粉、米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟 有机氮源成分复杂，除提供丰富的有机氮源成分复杂，除提供丰富的Pr.、aa.外，还含糖类、脂肪、无机盐及生长因子。外，还含糖类、脂肪、无机盐及生长因子。由于有机氮源营养丰富，由于有机氮源营养丰富，M在含有机氮源的在含有机氮源的培养基中表现出生长旺盛、菌丝浓度迅速增培养基中表现出生长旺盛、菌丝浓度迅速增加等特点。加等特点。3.无机盐无机盐构成菌体的成分，作为酶的组成部分、酶的激活剂或构成菌体的成分，作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节渗透压、抑制剂、调节渗透压、pH值和氧化还原电位等值

7、和氧化还原电位等例例A：铁离子：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理发酵罐必须进行表面处理4.微量元素微量元素5.生长因子生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。称生长因子。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子生物生长不可

8、缺少的生长因子 作用：提供微生物重要化学物质、辅助因子（辅酶提供微生物重要化学物质、辅助因子（辅酶和辅基）的组分和参与代谢和辅基）的组分和参与代谢前前体体指指某某些些化化合合物物加加入入到到发发酵酵培培养养基基中中，能能直直接接被被微微生生物物在在生生物物合合成成过过程程中中合合成成到到产产物物分分子子中中去去，而而其其自自身身的的结结构构并并没没有有多多大大变变化化，但但是是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。产物的产量却因加入前体而有较大的提高。青霉素：分子量青霉素：分子量356苯乙酸苯乙酸:分子量分子量1366.前体和产物促进剂前体和产物促进剂e.g.青霉素发酵中加玉米浆发酵单位青霉素

9、发酵中加玉米浆发酵单位由由20U/mL提高提高到到40U/mL。玉米浆中含有苯乙胺，它被优先结合到青霉素分玉米浆中含有苯乙胺，它被优先结合到青霉素分子中去，从而提高产量。子中去，从而提高产量。有些前体物质，例如苯乙酸、丙酸等浓度过高时，有些前体物质，例如苯乙酸、丙酸等浓度过高时，对菌体会产生毒性。有些菌体还有将前体氧化分解对菌体会产生毒性。有些菌体还有将前体氧化分解的能力。的能力。在生产中常采用少量多次地加入前体。在生产中常采用少量多次地加入前体。总的加入量可按一个产物分子，进入几个前体分总的加入量可按一个产物分子，进入几个前体分子，按等摩尔计算前体加入量，在总的加入量中，子，按等摩尔计算前体

10、加入量，在总的加入量中，还应考虑菌体氧化、分解的那部分前体。还应考虑菌体氧化、分解的那部分前体。用量用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题率的问题例：例：6000单位单位/ml的青霉素的青霉素G,需要多少苯乙酸需要多少苯乙酸 青霉素（微克）青霉素（微克）苯乙酸（苯乙酸（3.6*136）产物产物 前体前体 产物产物 前体前体n青霉素苯乙酸及衍生物 n青霉素苯氧乙酸n金霉素氯化物n链霉素 肌醇、精氨酸n红霉素 丙酸、丙醇nVB12 钴化物n葫萝卜素 -紫罗兰酮nL-异亮氨酸 -氨基酸nL-色氨酸 邻氨基苯甲酸nL-丝氨酸 甘氨酸发

11、酵生产中常用的前体发酵生产中常用的前体 促进剂促进剂(promoter)(promoter)：既不是营养物，又不是前：既不是营养物，又不是前体，却能提高产量的添加剂体，却能提高产量的添加剂。巴比妥盐巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉素生产菌自溶推迟，延长产物的分泌期。酵母甘露聚糖酵母甘露聚糖可诱导-甘露糖酶的产生，促使甘露糖链霉素转化为链霉素(streptomycin)。聚乙烯醇衍生物聚乙烯醇衍生物可防止菌丝结球，提高糖化酶(saccharifying enzyme)的产量。表面活性剂表面活性剂(surface active agent)：在底物和产物均不溶或微溶于水的发酵中，表面活性剂

12、有增加渗透性(perviousness)、促使固体物分散从而强化传质和传氧的作用。抑制剂抑制剂（inhibitor）：在发酵过程中能产生抑制作用的物质在发酵过程中能产生抑制作用的物质 在发酵过程中加入某些抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一个代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一中间物积累起来。抑制剂抑制剂（inhibitor）：1、按状态固体培养基固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 半固体培养基半固体培养基:即在配好的液体培

13、养基中加入少量的琼脂，即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为一般用量为0.5%0.8%,主要用于微生物的鉴定。主要用于微生物的鉴定。液体培养基液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。二、培养基的类型与用途二、培养基的类型与用途2、按来源（纯度）、按来源（纯度）合成培养基合成培养基:原料其化学成分明确、稳定原料其化学成分明确、稳定 q 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律 q 培养基营养单一，价格较高，不适合用于

14、大规模工业生产培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产天然培养基天然培养基:采用天然原料采用天然原料 q 原料来源丰富原料来源丰富(大多为农副产品大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产、价格低廉、适于工业化生产 q 原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性 二、培养基的类型与用途二、培养基的类型与用途半合成培养基半合成培养基：天然成分：天然成分+纯化学试剂纯化学试剂3、按培养基的用途划分、按培养基的用途划分二、培养基的类型与用途二、培养基的类型与用途基础培养基：一般微生物生长的基本营养物质增殖培养基：适合某种微生物生长而抑制其他达到分离鉴别培养

15、基：能否利用某种成分并借助指示剂以鉴别选择培养基：加入某种化学物质粗筛目的菌而抑制他菌TEXTTEXTTEXTTEXT图2菌落形态图3 营养细胞 图4 出芽细胞图 5 子囊孢子形态 1.形态鉴定形态鉴定4、按目的（从发酵生产应用考虑）、按目的（从发酵生产应用考虑）孢子（斜面）孢子（斜面）培养基培养基 种子种子培养基培养基 发酵发酵培养基培养基二、培养基的类型与用途二、培养基的类型与用途孢子培养基孢子培养基要求：促进菌体迅速生长，产生较多优质孢子要求：促进菌体迅速生长，产生较多优质孢子且不会引起菌种变异。且不会引起菌种变异。特点特点C、N源不宜多，否则只长菌丝，少长或不源不宜多，否则只长菌丝，少

16、长或不长孢子；长孢子；无机盐浓度要适当控制，否则会影响孢子的无机盐浓度要适当控制，否则会影响孢子的颜色和孢子量。颜色和孢子量。种子培养基种子培养基n目的目的 扩大培养增加细胞数量；培养高活力细胞；加速细胞分裂扩大培养增加细胞数量；培养高活力细胞；加速细胞分裂或菌丝生长或菌丝生长n要求要求n营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些；营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些；n培养基中加入一些易于吸收利用的快培养基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子发芽生长，保证球形；源，便于孢子发芽生长，保证球形；npH要稳定；要稳定；n最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入

17、少量发酵合成期才大量需要的物质。量发酵合成期才大量需要的物质。发酵培养基发酵培养基n目的：使接种菌丝生长并能高效表达，获得高的发酵产量，同时组分尽可能单一，以保证高的得率。n要求n营养丰富完全，有利于产物合成；n不能大量加入快C、快N源，应和慢C、N源相结合；n在产物分泌期间，pH 稳定；n加入适量合成所需的物质，如前体等，进行定向发酵；n采用中间补料，以提高发酵单位；n原料的考虑成本问题n能够满足生产菌生长、代谢需要n目的代谢产物的产量最高n利于提高培养基和产物的浓度以提高生产能力n利于提高产物合成的速度，缩短发酵周期n减少副产物的形成便于分离纯化n原料低廉，质量稳定，取材容易n原料减少对通

18、气搅拌的影响，提高氧利用率，降能耗n来源广泛且供应充足n利于产品分离纯化，减少产生三废物质n废物的综合利用能力强且容易处理三、工业培养基选择三、工业培养基选择n提供必要的营养成分n配制合适的浓度n主成分和其他成分的配比n控制合适的pHn添加有关前体物质和诱导物n阻遏物或抑制剂的影响n金属离子的影响四、培养基的配制原则四、培养基的配制原则、培养基成分的选择原则n1.菌种的同化能力n2.代谢的阻遏和诱导作用n3.合适的碳氮比n的要求 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。、培养基设计的步骤 根据前人的经验和培养基成分

19、确定时一些必须考虑 的问题，初步确定可能的培养基成分；通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；、实验设计、实验设计q 培养基成分的含量最终都是通过实验获得的q 合理的实验方法均匀设计、正交实验设计、响应面分析多因子实验原培养基:初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)碳源碳源Y-11碳源碳源Y-11葡萄糖+柠柠檬酸檬酸钠钠+果糖+苹果酸钠+蔗糖蔗糖+酒石酸+木糖+丁二酸丁二酸钠钠+乙醇+淀粉淀粉+丙三醇+琥珀酸钠+乙酸乙酸钠钠+Y11菌株对碳源的利用能力菌株对碳源的利用能力 通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：通过单因素试验确定乙酸钠的

20、浓度0.2%比较好结果：碳源：乙酸钠 0.2%氮源：氯化铵 0.2%酵母膏0.03%无机盐:复合无机盐0.05%正交设计确定优化的配方水平水平因因 素素A（乙酸（乙酸钠钠）/%B（NH4Cl）/%C（酵母膏）（酵母膏）/%D（无机（无机盐盐）/%10.20.10.010.0520.30.20.030.130.40.30.050.15正交分析表正交分析表改进后培养基原培养基改进后培养基的发酵结果改进后培养基的发酵结果表3-1 PlackettBurman设计筛选影响Y-21生长的关键培养基组分 表3-2 PlackettBurman设计12次试验确定9种变量的影响用SAS软件分析试验结果 用SA

21、S软件分析试验结果n当P值小于时，为影响显著因素，通过表可以看出X1蔗糖，X2蛋白胨，X3酵母膏，X8磷酸二氢钾，X9硫酸镁 的值均小于，其数据的R2检验为99.65%，表明可信度为99.65%。第五节 淀粉的制备葡萄糖工艺 一、淀粉的组成及特性1、淀粉的组成n(C6H10O5)nn聚合度 n直链淀粉和支链淀粉n淀粉颗粒的构成如下图：氢键 聚集 淀粉分子链 针状晶体 淀粉颗粒2、淀粉的特性淀粉的膨胀和溶解n膨胀膨胀：淀粉是一种亲水胶体，遇水加热后，水分子渗入淀粉颗粒的内部，使淀粉分子的体积和重量增加，这种现象称为膨胀膨胀。n糊化糊化：在温水中，当淀粉颗粒无限膨胀形成均一的粘稠液体的现象，称为淀

22、粉的糊化糊化。此时的温度称为糊化温度糊化温度。溶解或液化溶解或液化：淀粉糊化后，如果提高温度至 130，由于支链淀粉的全部（几乎）溶解，网状结构彻底破坏，淀粉溶液的粘度迅速下降，变为流动性较好的醪液，这种现象称为淀粉的淀粉的溶解溶解或液化或液化。淀粉糊化、液化过程中醪液粘度的变化温度粘度at1t212bc二、淀粉制备葡萄糖的方法和原理v工业上，将淀粉水解成葡萄糖的过程称为工业上，将淀粉水解成葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。淀粉的糖化。二糖二糖低聚糖低聚糖葡萄糖淀粉淀粉水解糖水解糖、淀粉的糖化 1，糖化理论n糖化糖化：以无机酸或酶为催化剂，在一定温度下使淀粉水解，将淀粉全部或部分转化为葡萄糖等可发酵

23、性糖的过程。n糖化剂糖化剂：糖化过程中所用的催化剂。包括无机酸和酶。n糖化的目的糖化的目的：将淀粉转化为可发酵性糖。、淀粉的糖化2，淀粉糖化的方法n酸解法n酶解法n酸酶结合法（1）酸解法（酸糖化法）n定义：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。淀粉水解过程的反应淀粉水解过程的反应n主反应：糖化（水解作用）n副反应：n复合反应（在酸和热作用下，部分葡萄糖经-1，6键结合成龙胆二糖，-1，6键结合成异麦芽糖和其他低聚糖。）n分解反应（葡萄糖分解为羟甲基糠醛，有机酸和有色物质等非糖产物）淀粉的水解反应过程淀粉的水解反应过程n淀粉分子内-1，4和-1，6葡萄糖苷键的断裂

24、，相对分子质量逐渐变小，依次变为糊精，低聚糖，麦芽糖和葡萄糖。n糊精是若干种分子大于低聚糖的碳水化合物，一般含210葡萄糖单位的为低聚糖。糊精具有旋光性，还原性，能溶于水，不溶于酒精。n与碘作用，聚合度不同颜色不同。葡萄糖聚合度与碘液的呈色表葡萄糖聚合度与碘液的呈色表葡萄糖聚合度葡萄糖聚合度与碘液呈色与碘液呈色最高吸收波长（最高吸收波长（nm)78无色无色16淡红色淡红色48021红色红色51028红紫色红紫色54034紫色紫色56041兰紫色兰紫色58061兰色兰色600120兰色兰色620330兰色兰色630糖化的过程检测糖化的过程检测n检验液化：是否有淀粉，用碘液，是否呈兰色；n检验糖化

25、：是否水解完全n测定还原糖；n用无水酒精。nDE值：糖化液中还原糖含量（以葡萄糖计）占干物质的百分率，用以表示淀粉糖的糖组成。还原糖用斐林法或碘量法测定，干物质用阿贝折光仪测定。理论收率（111.11%)（C6H10O5)n+nH2O nC6H12O6 162 18 180实际收率（105%108%）淀粉转化率 n 葡萄糖葡萄糖二糖，糖，三糖和三糖和其他低其他低聚糖聚糖酸和热酸和热 复合反应复合反应异麦芽异麦芽糖和龙糖和龙胆二糖胆二糖降低葡萄糖的收率，降低葡萄糖的收率，发酵的残糖增加，发酵的残糖增加，抑制菌体生长和产物形成，抑制菌体生长和产物形成，增加提取和精制的难度增加提取和精制的难度n淀粉

26、 羟甲基糠醛 乙酰丙酸+蚁酸+有色物质等。其它副反应其它副反应缩短反应时间，缩短反应时间，控制反应，控制反应，降低葡萄糖的浓度降低葡萄糖的浓度减减少少（1）酸解法（酸糖化法）酸解法（酸糖化法）n优点：n工艺简单，设备较单一n水解时间短，设备周转快n缺点：n需耐高温、高压和耐腐蚀的设备n副产物多，淀粉的转化率低n对原料要求高n淀粉乳浓度不宜太高，太高转化率下降n废水难处理（2）酶解法）酶解法n定义：以酶为催化剂，在常温常压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。包括液化和糖化两个过程，故又称双酶水解法。淀粉a-淀粉酶淀粉酶葡萄糖，葡萄糖，麦芽糖和麦芽糖和麦芽三糖。麦芽三糖。异麦芽糖异麦芽糖和低聚糖。和低聚糖

27、。（一）液化（一）液化（1）淀粉水解涉及的酶n-淀粉酶：其作用是将淀粉迅速水解为糊精及少量麦芽糖，对淀粉的作用，可将长链从内部分裂成若干短链的糊精，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到-淀粉酶的作用后，遇碘呈色很快反应，如下表现：蓝紫红浅红不显色(即碘原色)n糖化酶：作用于淀粉的-1，4键结合，能从葡萄糖键的非还原性末端起将葡萄糖单位一个一个的切断，因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。n-淀粉酶：n-淀粉酶是内切型淀粉酶，能水解-1，4糖苷键，使直链淀粉水解成麦芽糖、麦芽三糖和较大分子的寡糖，然后缓慢水解成麦芽糖和葡萄糖n不能水解-1，6糖苷键，但能越过-1，6糖苷键继续水

28、解-1，4糖苷键。n所以液化液除了麦芽糖和葡萄糖外还有一系列带-1，6糖苷键的寡糖n糖化酶的水解作用n糖化是利用糖化酶将淀粉液化产物糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程。n糖化过程葡萄糖含量不断增加。糖化酶对底物的作用是从非还原性末端开始的。产生a-葡萄糖。糖化酶对a-1,4和a-1,6 糖苷键都能水解。v（二）糖化（二）糖化2）酶解法）酶解法n优点：n反应条件温和n副反应少，淀粉质量高n可在较高淀粉浓度下水解，对预料要求不高n糖液的质量高、营养物质较丰富n缺点：n水解时间长，夏天糖液容易变质n设备较多3，糖化方法的比较n水解时间：酸法短，酶法长n水解程度：酶法高n糖液杂质：酶法低，酸法高n综合（3）酸酶结合解法）酸酶结合解法n定义：集中酸解法及酶解法制糖的优点而采用的生产方法。包括酸酶法和酶酸法两种。n酸酶法：酸水解淀粉至DE值10%-15%，降温、中和加糖化酶进行糖化n酸液化速度快n糖化酶可在较高淀粉浓度下水解，提高生产效率n用酸量少，糖液质量高、产品色泽浅n酶酸法：主要是先用a-淀粉酶将淀粉液化到一定程度，过滤除杂，然后用酸水解成葡萄糖n淀粉颗粒不均的淀粉，酸水解常导致水解不均匀n第二步酸水解时，pH值可稍高，减少副反应，糖色泽较浅