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1、小核酸药物研发产业研究：从上游解决疾病一、作用于蛋白质上游的创新机制药物1.1 相比于靶向蛋白质的疗法具有先天优势错误转录翻译的蛋白质是导致疾病的原因之一。中心法则是 Francis Crick 于 1957年提出的，阐明了遗传信息在细胞内生物 大分子间转移的基本法则：DNA 分子中的遗传信息转录到 RNA 分子中，再由 RNA 翻译生成体内各种蛋白质，蛋白质的主 要功能是作为生物体的结构成分和调节新陈代谢活动，从而维持机体正常功能。而 DNA 的突变或转录翻译的错误将产生非 正常功能的蛋白质，从而可能导致疾病。靶向蛋白质的药物存在显著局限性。具有由于非正常功能蛋白会通过错误信号传导或影响细胞
2、代谢等方式导致疾病，因此目 前主流的小分子和大分子药物均是通过靶向结合致病蛋白，调节其蛋白质功能，从而实现治疗疾病的目的，这类靶点蛋白包 括激酶、受体、抗原等。尽管部分小分子和抗体药物已经在临床中获得较好疗效，并且具有易生产、给药方便、稳定、精准 等优势，然而，这种靶向蛋白质的治疗方式存在局限性：可成药的蛋白质靶点选择较少。蛋白只占了基因组信息的极少部分，人类的基因组中，仅 1.5%的序列编码了蛋白质， 其中和疾病相关的蛋白只占 10-15%，而在这些疾病相关的致病蛋白中，超过 80%的蛋白质不能被目前常规的小分子及 大分子药物所靶向，属于不可成药蛋白，因此药物靶点的选择范围较窄；多数靶点仍然
3、处于尚未发现的状态。目前全球已批准的药物仅可以与由 0.05%的基因组所编码的约 700 种蛋白质相互 作用，仍然存在较多难以开发和覆盖的靶点，需要多次试验反复验证，尚未满足临床需求；需要考虑蛋白质三维结构，设计较复杂。小分子药物主要通过靶向蛋白质结合口袋发挥作用，然而蛋白质并非静态结 构，在体内发挥作用时可能会发生变构，进一步加大药物开发难度，因此早期药物开发和筛选过程复杂；应用范围受到结合位点限制。抗体药物的结合位点主要在于细胞膜表面蛋白质或细胞外，其应用受到一定限制；需要反复用药甚至还会复发。这类药物不直接调节蛋白浓度，主要调节蛋白质功能，例如抑制/促进信号传导及催化蛋 白活性等，仅起到
4、“治标”作用，存在需要长期高频用药或复发的风险。基因层面疗法相比蛋白质靶向药物具有更大潜力。如果能直接从上游对蛋白质表达直接进行调控，将有望能够避开以上问题， 因此，实现个性化基因水平治疗的药物潜力将超过当前蛋白质靶向疗法，例如核酸药物。核酸药物是指人工合成的具有疾病治疗功能的 DNA 或 RNA 片段，能够直接作用于致病靶基因或 RNA 片段，旨在改变宿主遗传信息的编辑，具有治愈疾病的 潜力，成为“治标治本”的治疗选择。此外，由于核酸药物理论上可以调节任何基因表达，将药物靶点直接扩大到蛋白质上 游，因此不会受限于蛋白质的成药性问题，有望打破不可成药性难题。小核酸药物是目前发展最为成熟的基因疗
5、法之一。其中，目前已有药品获批上市，并且治疗潜力得到验证的核酸药物类型主 要是小核酸药物。广义的小核酸药物是指长度小于 30nt 的寡核苷酸序列，范围涵盖了小干扰核酸（siRNA）、微小 RNA （miRNA）、反义核酸（ASO）和核酸适配体（Aptamer）等。相比抗体和小分子药物，小核酸药物具有先天优势：研发周期短，药物靶点筛选快：小分子和抗体药物需要识别某些蛋白质复杂的空间构象，因此需要大规模的药物筛选。 而小核酸药物只需要锁定致病基因序列，并针对该基因序列进行设计及相应 RNA 片段的合成，因此其早期研发速度远 远快于其他种类药物；不易产生耐药性：由于抗体和小分子主要通过调节细胞信号通
6、路和代谢等方式发挥治疗作用，因此可能会由于补偿通 路上调或抗原表达下降等因素产生耐药性，而小核酸药物直接调节上游基因表达，因此相对不易产生耐药性；治疗领域更广：不受限于蛋白质的可成药性，理论上可以设计用于靶向任何感兴趣的基因，仅需要目标 mRNA 的序列 信息，有望攻克尚无药物的遗传疾病和其他难治疾病；效果持久：通常来说，小分子药物的体内半衰期以小时计算，抗体药物的体内半衰期以天/周计算，而由于小核酸药物 可以在体内被循环多次使用，因此能降低给药频次，在体内的半衰期可以按照月来计算，对很多疾病尤其是慢病的治 疗具有巨大的临床价值；研发成功率较高：由于小核酸药物作用机制明确，通过与 mRNA 完
7、成 WatsonCrick 碱基配对来实现其功能，无需契合蛋白质复杂结构，因此研发成功率相对较高。参考 Alnylam 公司的研发成功率，I 期到III 期成功率达到 59.2%，相 比靶向药和整体医药的研发成功率高 5 倍。因此，小核酸药物的独特优势使其有望为现代生物医药产业开辟一个全新的开发方向，进一步填补现有疗法的治疗空白， 并且具备治愈疾病的潜力。1.2 小核酸药物的发展历经机遇与挑战小核酸药物作为革新了当代药物开发理念的创新技术，其发展过程并非一帆风顺，中间历经波折，直到近年才逐步被验证认 可，纵观其发展历史，大致可分为三个阶段：前期探索：1978年哈佛大学 Zamecnik 等人首
8、次提出反义核酸概念，经过 20年发展，1998年首款 ASO药物 Vitravene 获批上市。同年，Andrew Fire和 Craig Mello在线虫中首次揭示了 RNAi作用机制，并因此获得诺贝尔奖。2001年Elbashir 等人首次利用体外合成的 siRNA 实现了哺乳动物细胞中的基因表达调控，标志着 RNAi 开始从研究走向临床应用。震荡发展：2004年首款 siRNA 药物 Bevasiranib 进入临床，小核酸药物领域迎来蓬勃发展期，各大药企纷纷进入该领 域。然而，由于小核酸的不稳定性以及递送效率低等缺点，多款药物在临床研究中失败，并宣布终止开发，随后多家 大药企放弃并出售
9、小核酸开发平台，行业发展一度陷入低谷期，小核酸的成药性被质疑。快速发展：在企业和科学家的持续研发下，GalNac 递送系统和化学修饰等技术的出现，初步解决了小核酸的递送及稳 定性问题，行业又重新迎来研发热潮。2016-2021 年多款重磅小核酸产品陆续上市，在罕见病和慢性病等领域取得重 大突破，进一步验证小核酸药物的治疗潜力。各大药企纷纷通过自研或合作引进等方式快速布局小核酸药物领域，同 时，资本市场也进一步助力行业和相关公司发展。核酸药物处境可类比 20年前的抗体行业。从 2016年起, 小核酸药物每年约有 2款产品获批上市，占 FDA 每年批准药物总 数的 5%左右，与 20年前的抗体药物
10、行业处境相似：在 1986年首款抗体药物上市后，到 1994年才有第二款单抗药物上市， 随后又经历了几年空歇，才进入平均每年获批 2 款产品的阶段，直到 2014 年才进入快速发展期。小核酸药物和单抗类似， 均属于技术驱动型行业，存在较高的开发壁垒，未来随着技术难关被逐个攻破，小核酸药物也有望进入全面发展阶段。已有超过 10款小核酸药物获批上市。截至目前，全球已获批上市的小核酸药物共有14款，包括4款siRNA药物和9款 ASO， 1 款核酸适配体，约 80%的产品是 2015年以后上市，其中最早上市的 3款药物目前已经退市。从适应症布局来看，已上市 小核酸药物大部分是针对遗传病，其中 11款
11、药物获得 FDA 或欧盟的孤儿药认证，同时也是该疾病领域的首个药物，一定程 度上满足了尚无治疗手段的罕见患者的需求。各大企业均选择从罕见病入手的可能原因包括：1）遗传罕见病靶标明确，设 计上更快捷安全；2）罕见病患者少，且缺乏治疗药物，临床开发速度短平快；3）相比于需要长期用药的慢性病，罕见病对 于安全性的要求相对较低，适合新技术。从靶向器官来看，均属于局部给药或肝脏递送给药。上市小核酸药物中已出现重磅品种。2020 年全球小核酸药物销售额在 35 亿美元左右，其中销售最高的是 Ionis 和 Biogen 合作开发的 Spinraza，作为全球首款获批用于治疗脊髓性肌萎缩症的药物，其在 20
12、20年实现销售收入 20.52亿美元。脊髓 性肌萎缩症是一种罕见致命性遗传病，患者主要表现为全身肌肉萎缩无力，身体逐渐丧失各种运动功能，甚至是呼吸和吞咽。 脊髓性肌萎缩症在新生儿中的患病率为 1:6000-1:10000，中国大约有患儿 35万人，Spinraza的上市为患者提供了更多治 疗选择。小核酸药物虽然售价昂贵，但由于目前上市的产品主要集中在罕见病领域，针对的患者群体数量较为有限，因此小 核酸药物的销售额还未出现爆发式增长，未来伴随研发的持续推进，有望出现更多重磅品种。二、小核酸行业整体具有较高景气度2.1 小核酸药物的市场潜力较大全球小核酸行业驶入发展快车道。考虑到小核酸药物的设计和
13、开发不会受限于蛋白质的可成药性及靶点的发现，未来随着递 送系统和修饰技术的持续进步，小核酸药物有望涵盖更广的适应症及取代部分现有疗法，潜在市场规模十分广阔。根据灼识 咨询数据，预计到 2025年全球小核酸药物销售额将突破 100亿美元，其中 RNAi疗法凭借其较为显著的效果有望能够实现 快速增长，到 2025 年预计将达到 45 亿美元，复合增速达到 66%。我国小核酸药物市场仍然处于发展初期。与全球相比，我国小核酸药物的开发起步较晚，第一家小核酸药物研发企业的成立 时间相比 Ionis 晚 10年，首款 siRNA 药物的临床获批时间相比全球晚了 11年。因此目前国内的小核酸行业仍然处于发展
14、初期阶段，仅一款产品获批上市，为 Ionis 的 Spinraza。但由于国内患者群体基数较大、需求较多，因此未来伴随小核酸药物 开发的持续推进，以及国内企业的技术逐步成熟，我国小核酸药物市场有望迎来快速发展。2.2 国内外小核酸研发进展差距较大ASO和 siRNA目前是小核酸药物领域的热点赛道。根据药渡数据库的不完全统计，目前全球上市和在研的小核酸药物共有 293 款，其中 ASO 作为最早发展的药物类型，目前上市药物数量最多。siRNA 虽然起步相比 ASO 较晚，但凭借其更高的 效率和长效性吸引了更多的企业，目前共有 185 款在研产品，占全部研发管线比例达到 65%，已成为主流 RNA
15、i 药物，但 多数仍处于临床前阶段。而 miRNA 和 Aptamer 的开发技术仍然有待进一步发展，目前在研药物数量较少。遗传病和肿瘤是在研小核酸药物的主要适应症。小核酸药物的适应症涵盖范围较广，包括肿瘤、罕见病、代谢疾病、自免疫 疾病以及感染等，从管线数量来看，目前遗传病和肿瘤是最为热门的开发领域。其中，遗传病多数仍然没有成熟的治疗方案， 因此整体竞争格局相对较好，有望为患者带来治疗希望。从不同药物类型来看，目前 siRNA 药物多数集中在肿瘤领域，而ASO 药物多数集中在遗传病领域，这可能是由于 siRNA 仅能敲低基因表达因此在遗传病中作用受限所致。我国小核酸药物行业发展和国外相比差距
16、较大。由于我国小核酸药物开发起步较晚，因此目前获批进入临床试验的项目数量 与全球相比差距较大，仅 16 款产品处于临床阶段，其中多数来自于国外企业，而由中国团队自主开发、进入期的产品数 目较少。此外，从产品类型和靶点来看，目前我国小核酸药物开发仍然处于跟随和模仿阶段，多数企业选择的是国外已上市 药物的 me-too类产品。未来伴随我国小核酸药物开发企业的研发能力提升，有望逐步进入差异化创新和突破型创新阶段。我国小核酸药物的适应症布局和国外具有差异性。从适应症布局情况来看，国外在研产品数量最多的适应症为遗传病、肿瘤 和自免，而我国在研小核酸药物主要集中在国内的大疾病赛道，包括感染、肿瘤和代谢疾病
17、等。2.3 行业内领军者多为新兴企业全球领先的少数小核酸厂家均为中小型 Biotech公司。由于 ASO和 siRNA 的开发技术区别较大，因此小核酸药物开发企业 主要分为两类：1）专注于 ASO药物技术的企业，例如 Ionis 和 Sarepta。其中 Ionis 是最早进入小核酸领域的企业，目前研 发管线数量也最多，而 Sarepta主攻杜氏肌营养不良症，已经形成了丰富的产品梯队；2）专注于 siRNA 的企业，例如 Alnylam 和 Arrowhead等。其中 Alnylam 于自 2018年迎来密集收获期，成为首家实现商业化的 siRNA 领军企业，目前已有 4款上 市药物。而根据药
18、渡数据库，目前瑞博生物和圣诺制药是国内拥有小核酸药物管线最多的企业。大药企目前主要通过收购或引进等方式布局小核酸领域。回顾小核酸药物发展历史，由于行业一度陷入过低谷期，彼时多家 大药企纷纷出售或终止小核酸管线，因此小核酸药物技术进步主要是由这些中小型 Biotech公司推动，从而形成了目前的企 业竞争格局。而在技术难关被逐步攻破后，为重新进入小核酸赛道，加快管线布局，很多大型药企在过去 5 年纷纷与这类Biotech公司达成引进和合作开发协议，例如 Roche、AZ、J&J和诺华等，行业整体景气度较高。此外，近日诺和诺德宣布 将以 33 亿美元的收购 Dicerna 公司，未来小核酸行业也将逐
19、步迎来大药企的并购期。因此，目前小核酸药物行业整体具有较高景气度、良好竞争格局、较大潜在市场规模的特性，行业具有较多机会：1）理论 上可以靶向任何基因，伴随技术持续进步，具有涵盖所有疾病领域的潜力；2）相比现有的小分子和抗体药物具有长效、高 效和设计简单等优势，有望能够取代现有疗法，实现治标治本；3）具有较高技术和专利壁垒，因此行业竞争格局较好，玩 家相对较少，且具有先发优势。三、RNAi是小核酸药物发挥作用的重要机制之一3.1 siRNA 药物是当下最热门的研发方向siRNA 可以在体内多次介导靶 mRNA 沉默作用。siRNA 是与靶基因互补的长度为 21-25 nt 的小片段双链 RNA
20、，于 1999 年由英国科学家 Hamilton 在植物中首先发现，到 2001 年，Elbashir 等科学家已成功合成 siRNA，并发现将其转入 HELA 细胞后能够引发特异性沉默。经过研究发现，siRNA 是一种降解 mRNA 的后转录基因沉默（PTGS），通过特异性诱导靶 mRNA 降解从而导致细胞基因靶向性沉默的现象，作用机制主要分为几个阶段：首先，外源性或内源性双链 RNA（dsRNA）被 RNase III（例如 Dicer）切割成约21-25 nt 具有活性的 siRNA 结构。随后，Dicer 将在 RNA 结合蛋白 TRBP 的帮助下将双链 siRNA 加载到 Argon
21、aute（AGO2）蛋白，形成复合体 （RNA-induced silencing complex，RISC）。然后，siRNA 将解开双链，其反义链与靶 mRNA 结合后，AGO2将特异 性降解靶 mRNA，从而抑制其翻译。最后，被切除的靶 mRNA 被释放，RISC被回收，使用相同的加载引导链再进行几轮切片。此外，siRNA 可以在 RNA 聚合酶的作用下再次形成 dsRNA，从而重新参与以上过程。RISC中发挥沉默靶基因作用的主要部分是 Argonaute蛋白（AGO2）。为了实现 siRNA 介导的沉默，AGO2需要连接 siRNA 反义链，切掉随从链，随后在保持与反义链结合的情况下，
22、经历多个靶 mRNA 识别、切割和释放循环。AGO2 具有三个功 能域，PAZ、MID 和 PIWI，其中 PIWI 结构域具有 RNaseH 样的折叠情况，是赋予其切割活性的功能域。PAZ结构域具有 RNA 结合作用，能够识别单链 RNA 的 3端，起到了铆定向导链的 3端的作用，5端则插入 MID 和 PIWI结构域之间，从而 便于 PIWI 结构与实现切割功能。siRNA 具有独特的成药优势。基于 RNAi 的沉默技术可用于为多种疾病设计治疗方式，主要是由一个或几个基因引起的疾病， 例如遗传缺陷、病毒性疾病、自身免疫性疾病和癌症。鉴于其独特的作用机制优势，siRNA 具有较大发展潜力，是
23、目前最为 热门的小核酸开发领域之一：高特异性。siRNA 与其靶标的结合具有高度选择性，通过使用大约 mRNA 全长来识别靶序列并介导其切割。可以区分 仅相差一个核苷酸的序列，这种高度结合特异性使 siRNA 成为适合用于疾病治疗的工具；靶点选择不受限制。siRNA 可以沉默基因组中几乎任何基因的表达，具有广泛的治疗潜力，有望能够靶向现有治疗方 式中“无法成药”的靶点；治疗效率高。由于单个 siRNA 引导链可以在多轮 mRNA 切割中循环使用，因此在正确的触发条件下，可以实现较高治 疗效率。3.2 siRNA 药物有望能够取代现有疗法，甚至实现乙肝治愈应用方面，使用玻璃体内注射治疗年龄相关性
24、黄斑变性 (AMD) 和糖尿病性黄斑水肿 (DME) 的视力丧失是 siRNA 的首批临 床应用之一，因为这些药物可以直接递送至眼组织以靶向良好。从现有的临床数据来看，siRNA 药物已经初步展现其治疗潜 力：1）相比现有疗法具有长效性优势，患者依从性更好；2）具有治愈部分疾病的潜力，达到治标治本。但由于技术仍然处 于发展阶段，因此也存在较多失败案例，部分开发难点有待进一步突破。Onpattro 填补空白适应症由 Alnylam 开发的 Onpattro 于 2018年上市，是首个获得美国 FDA 和欧盟批准的 siRNA 药物，用于治疗遗传性转甲状腺素 蛋白介导淀粉样变性(hATTR)。hA
25、TTR 是由于 TTR 基因突变引起，正常情况下，TTR蛋白主要在肝脏中产生，是维生素 A 的载体。而 TTR 基因突变会导致其蛋白发生错误折叠，并且聚集成淀粉样原纤维，积聚在多个器官中，从而导致器官和组 织损伤，具体症状包括多发性神经病和心肌病，该疾病诊断后的中位生存时间平均为 4.7年。此前较为常用的治疗方式包括肝移植、非甾体抗炎药（Difusinal）和小分子药（Tafamidis）。然而，这些药物只作用于稳定 TTR 蛋白，对于 hATTR 仅有 延长生存时间的效果，因此，科学家试图直接抑制 TTR 的基因表达。Onpattro 是一种脂质纳米颗粒制剂，将 siRNA 包裹在脂质纳米颗
26、粒（LNP）中，并通过静脉注射直接递送至肝脏细胞，从 而沉默 hATTR mRNA 的表达，减少产生 TTR 蛋白，逐渐减少周围神经中淀粉样沉积物（hTTR）的积累，最终达到治疗疾 病的目的。数据显示，Onpattro 显着改善了患者的生活质量和临床结果，56%的患者在治疗 18个月后表现出改善，而安慰 剂治疗后仅有 4% 的患者表现出改善，同时具备较好安全性，为患者带来了更多治疗选择。Leqvio 具有长效降脂效果，有望取代现有疗法并解决耐药问题Leqvio 是一款由 Alnylam 公司开发的用于高脂血症的创新 siRNA 疗法，通过将靶向 PCSK9的双链 siRNA 与 GalNAc
27、偶联， 使其特异性进入肝脏组织，从源头上关闭 PCSK9的表达，从而降低 LDL-C的水平，实现降脂的治疗目的，并有助于改善动 脉粥样硬化患者的预后心血管疾病（ASCVD）。根据 2项关键 III 期临床研究 ORION-10（研究高脂血症）和 ORION-11（研 究 ASCVD）的汇总数据显示，在随访超过 17个月后，超过 2300名患者的 LDL-C 水平较基线降低了 52%，其中包括了他 汀不耐受患者，且安全性良好，有望能够解决耐药问题。此外，Leqvio 相比现有疗法大幅降低了用药频次，初始用药每 3 个月一次，此后每 6 个月一次（而 PSCK9 抗体需要每 2周或每月注射一次），
28、并且仅需皮下注射方式给药。每年注射两次即可有效地降低血液循环中 LDL-C的水平，达到降低血脂 的效果，操作起来更加简单，因此 Leqvio 相比现有疗法在患者依从性方面有着独一无二的治疗优势，有望能够进一步取代 现有疗法。VIR-2218 和 JNJ-3989 有望实现乙肝功能性治愈VIR-2218 是一款由 Vir Biotechnology 开发的 siRNA 药物，其采用了 Alnylam 的 ESC 和 GalNAc 的递送技术。VIR-2218 通过靶向 HBV X 基因的一段保守序列，可以沉默所有 10种 HBV 基因型的所有 HBV 转录本，包括 cccDNA 和整合 DNA，
29、 有望实现乙肝功能性治愈。在 2021 年欧洲肝脏大会上，公司宣布了 VIR-2218 的临床数据，结果显示，患者在间隔 4 周注 射 2次药物后可以在 24周内持续性的降低患者体内的 HbsAg的水平。该产品与 PEG-IFN-或 VIR-3434（一款 HBV 中和 抗体）的联用方案已进入 II 期临床。此外，由 J&J 和 Arrowhead 共同开发的 siRNA-GalNac 疗法 JNJ-3989 也展现类似治疗潜力。结果显示，患者在间隔 4 周 注射 3次药物后，39%的患者在最后一剂给药后的 48周内展现出持久 HbsAg水平下降，并具备较好耐药性。相比现在已有 的乙肝药物只能
30、抑制病毒复制，而不能清除病毒，siRNA 药物能够从源头沉默所有 HBV 基因产物，有望革新乙肝治疗方案。Bevasiranib 和 Sirna-027止步于技术难点Bevasiranib 是全球首个进入临床试验的 siRNA 药物，由 Opko Health开发，是一种 21聚体 siRNA，用于治疗 AMD。AMD 的主要发病机制是 VEGF介导的脉络膜新血管形成（CNV），因此目前 AMD的主要治疗方式是抑制 VEGF的血管生成，包 括靶向 VEGF或其受体，以及抑制 VEGF下游功能。Bevasiranib 则是通过下调 VEGF-A 的 mRNA，直接抑制 VEGF的表 达。而 Al
31、lergan 开发的 siRNA 药物 AGN-745（Sirna-027）则是针对 VEGF 受体。两款药物均是玻璃体内注射。然而，这两款药物的临床均以失败告终。Bevasiranib虽然在 I期和 II 期临床中展现出生物活性，但其 III 期临床试验由于降 低视力丧失的效果不佳而终止。同样，在完成 I/II 期试验后，针对 VEGF 受体的 AGN-745在 II 期试验中由于脱靶效应而停 止使用。因此，siRNA 的首个治疗尝试由于给药障碍以及脱靶造成的毒副作用而终止。伴随递送系统和修饰的持续进步，目 前部分 siRNA 的脱靶问题已经得到初步解决。3.3 miRNA 具有较大潜力也同
32、样面临技术挑战miRNA 是内源性的短单链 RNA 分子，属于非编码 RNA（直接作为 RNA 发挥作用），与 siRNA 类似，miRNA 也是通过 RNAi 机制发挥作用：编码 miRNA 的基因首先在细胞核内转录生成初级 miRNA（pri-miRNA）；随后，pri-miRNA 将被 RNase III 家族酶 Drosha和细胞核蛋白 DGCR8的复合物切割，形成长度大约 70-100nt、具有 发夹结构的前体 miRNA 分子（pre-miRNA）；pre-miRNA 在核输出蛋白 exportin-5的作用下被转运到细胞质，然后被另一个 RNase III 家族酶 Dicer 和
33、 TRBP 的复合 物进一步切割，形成长度约 19-23nt 的成熟 miRNA；miRNA 具有和 siRNA 相同特征的末端，随后其引导链将被加载到 Argonaute 蛋白上以形成 RISC 复合体，并介导靶 mRNA 降解，抑制其翻译。miRNA和 siRNA虽然机制相同但存在差异性。虽然也是形成 RISC复合体，但与 siRNA 需要结合靶 mRNA 的 3和 5端 21 个核苷酸不同，miRNA 仅与靶 mRNA 的 5 端的 2-8 位核苷酸结合就能发挥作用。此外，与 siRNA 通过 AGO2发挥作用不 同，miRNA 通过所有 4种 AGO蛋白调节其靶标。虽然它们有时会像 s
34、iRNA 一样导致 mRNA 裂解和降解，但 miRNA 的 RISC 主要通过抑制靶 mRNA 翻译和去腺苷酸化降解靶 mRNA 来实现基因沉默。使用 miRNA 作为治疗具有一定优势：miRNA是人类细胞中天然存在的分子。与合成的化合物和 ASO不同，miRNA 具有处理和沉默下游靶标的机制，人类 基因组中有超过 70%的部分被转录成非编码 RNA，选择广泛。miRNA 可以同时靶向多个基因。miRNA 不需要以 100%的互补性与其靶标完美结合，因此可以结合并抑制多种靶 mRNA，从而形成一个庞大而复杂的调控网络。与仅影响单个靶基因的 siRNA 或 ASO 相比，miRNA 可能会提高
35、治疗 效果，有利于解决疾病的异质性。然而，这种多基因靶向识别模式也同时增加了 miRNA 的脱靶概率。miRNA 作用机制具有多样性。与 siRNA 只能敲低基因表达不同，miRNA 治疗可以上调或下调靶 miRNA 表达水平， 调节方式更加多样化。四、ASO是目现阶段发展较为成熟的小核酸类型ASO 可以上调或下调靶 mRNA 表达ASO的调节方式较为丰富。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）是合成的、与靶 mRNA 互补的单链寡核苷 酸或寡核苷酸类似物，长度通常为 12-30nt。在结合靶 mRNA 后，ASO 药物可以通过几种不同的方式调节其功能，包
36、括上 调和下调：降解靶 mRNA。ASO 可以设计为内源性核酸酶（例如 RNase H1 或 Ago2）的识别剪切位点，从而引导靶 mRNA 降 解。其中，通过 RNase H1起作用的 ASO通常具有 8-10个连续的 DNA 核苷酸，以支持 RNase H1 的结合和切割； 而通过 Ago2起作用的 ASO通常以双链 RNA 等形式传递到细胞中，进入细胞后，其双链分子会与 RISC相互作用，然 后一条链与 Ago2 选择性结合，对靶 mRNA 进行降解。抑制翻译。ASO 还可以设计靶向上游翻译起始密码子 AUG，阻断 RNA 结合蛋白复合物（如核糖体亚基）的结合，从 而抑制靶 mRNA 的
37、翻译。剪切调控。ASO可以设计成结合内含子-外显子连接点，可破坏剪接位点的稳定性，或置换或募集剪接因子，从而导致 靶标外显子的跳读或内含。增加蛋白翻译。ASO 可以设计为结合上游开放阅读框（uORF），从而增加下游 ORF 翻译的蛋白量。与 siRNA 相比，ASO 具有其独特的优势和短板：可以上调表达。与 siRNA 仅能发挥沉默作用不同，ASO药物还可以上调蛋白翻译，从而治疗因蛋白表达缺少而造成的 疾病，例如脊髓性肌萎缩症（SMA）。在体内的扩散效果更好。ASO 作为单链 RNA，相比双链的 siRNA 其亲水性更弱，因此能够更好的在组织和细胞中扩 散吸收。长效性相对较弱。然而，由于 AS
38、O是通过直接结合 mRNA 发挥作用，而 RNAi 是形成复合体在细胞内循环降解 RNA， 因此相比 RNAi，ASO 的半衰期更短，并且不具备持续性。五、核酸适配体是较为独特的一类小核酸药物5.1 核酸适配体的作用机制与其他小核酸差别较大核酸适配体通过空间结构结合靶标。核酸适配体是合成的单链寡核苷酸，与其他 RNA 药物通过碱基配对发挥作用不同，当 靶标存在时，核酸适配体可经过自身卷曲、折叠形成特定的三维构型，如发夹、凸环、四角环等，并通过范德华力、氢键、 静电作用、碱基堆积力等，利用其空间结构与靶标高亲和性、高特异性地结合，这一过程类似抗体-抗原的结合，因此核酸 适配体又被称为“化学抗体”
39、。核酸适配体的选择通常需要通过多轮体外筛选来确定其功能，这一过程通常被成为指数富集的配体系统进化（SELEX）技 术，通过 SELEX 可以从文库中选择 20-100nt 的适配体，以调节类似于抗体的蛋白质功能。适配体相比其他寡核苷酸和抗 体药物具有独特优势：ASO 或 siRNA 药物的靶标需要存在于细胞内，而适配体可以靶向细胞内、细胞外或细胞表面。虽然核酸适配体对其目标配体的亲和力和特异性可与抗体的特性相媲美，但适配体相比抗体具备成本和渗透性优势。 适配体是使用 SELEX在体外进化和鉴定的，可以被重复且经济地大规模合成用于临床应用。此外，适配体的小尺寸使 其组织渗透性更好。5.2 核酸适
40、配体目前的主要开发方向是药物载体适配体作为药物的开发热度逐步消退Macugen是全球首款核酸适配体药物，由 NeXstar 公司研发，用于治疗老年黄斑病变 （AMD）。Macugen是一个 28聚体 的 RNA适配体，靶向血管内皮生长因子（VEGF）-165，VEGF-165是主要负责病理性眼部新血管形成和血管通透性，Macugen 能够防止 VEGF-165 与 VEGFR 结合，从而阻止血管生成以及防止 VEGF-165 诱导的血管通透性增加。但伴随雷珠单抗上 市，Macugen因为疗效不突出，销售出现下滑。随后阿柏西普等药物的上市，使得市场竞争更激烈，这款 RNA 适配体药物 出局，目前
41、已经退市。而在之后的两款适配体药物 Fovista（抗 PDGF适配体）和 Reg1（抗 FIXa 适配体）相继失败后，核 酸适配体作为药物的开发热度逐渐消退。适配体作为载体是目前的主要研发方向由于适配体具有良好的靶向性能，并且其三维结构有望携带药物，因此其具有成为药物载体的潜力。例如，将阿霉素（Dox） 直接结合到适配体，有望能够进一步提高细胞毒药物的靶向特性，降低其副作用。核酸适配体与药物结合的方式有两种：非 共价结合(嵌入)和共价结合。六、小核酸开发仍然面临有待突破的技术难点6.1 化学修饰能够提高小核酸药物的稳定性和效果6.1.1 骨架修饰骨架修饰是最基本的化学修饰。连接 RNA 磷酸
42、骨架的磷酸二酯键是核酸酶作用的化学键，而磷原子是核酸酶攻击的中心， 对该原子稍加改变即会大大影响酶的降解作用，因此最早被使用的就是针对骨架磷原子的化学修饰。其中使用较多的骨架修 饰为硫代磷酸，即用一个硫原子取代磷酸二酯键的非桥氧原子（P-S 替代 P-O），可以减少寡核苷酸的亲水性、增加了对核 酸酶降解的抵抗力以及增加了其与血浆蛋白结合，进一步增加药物稳定性和半衰期。然而，这类化学修饰在高浓度的情况下 可能会导致寡核苷酸和靶标的亲和力下降，从而导致脱靶毒性和炎症反应。因此，也可以选择硼酸磷酸盐（P-B 替代），可 以将裸核酸药物的酶抗性提高 10 倍以上，同时不会造成细胞毒性。6.1.2 核糖
43、修饰核糖是核酸药物最经常被修饰的部分。在一代药物对于骨架修饰的基础上，90 年代出现了具有糖基修饰的二代寡核苷酸药 物。核糖修饰具有进一步增加靶标结合亲和力、抵抗核酸酶降解、减少促炎症反应的作用，其中最重要的是对核苷酸戊糖 2- 羟基（2-OH）的修饰。2-OH 是 RNA 与 DNA 的主要区别，也是最先被酶催化并导致 RNA 水解的部分。因此，在该位置 引入取代基后，例如甲基、氟、卤素、胺等，能够使 siRNA 具有更强的抵抗核酸酶水解的性能，增加 siRNA 在血清中的稳 定性。但全链修饰将导致 siRNA 失去沉默活性，因此一般仅对双链末端 1-4 个核苷酸进行修饰。此外，对正义链的修
44、饰较 少影响 siRNA 的活性，而反义链的修饰对 siRNA 基因沉默的活性影响较大。LNA 是核糖修饰中最有效的一类。虽然二代寡核苷酸相比一代具有更强的亲和力，但是其诱导 RNase H 切割靶标 mRNA 的效率较低，因此需要进一步提高其沉默效率。其中，目前相对有效的方式是 LNA 修饰。LNAs 核苷酸是一类核酸类似物， 其中核糖环被连接 2-O 原子和 4-C 原子的亚甲基桥“锁定”，显示出增加的热力学稳定性和增强的核酸识别的作用。6.1.3 碱基修饰碱基修饰能够提高小核酸药物的沉默效果。小核酸药物主要通过与 mRNA 碱基互补形成氢键，从而发挥 RNAi 的作用，因 此通过对碱基的
45、修饰，可以进一步加强碱基之间的相互作用。在尿嘧啶的 5位点引入溴或碘是常使用的碱基修饰方法，如 5- 溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶，可加强腺嘌呤-尿嘧啶（A-U）之间的连接，提高碱基的相互作用，从而增强对靶 mRNA 的效应。6.1.4 末端修饰末端修饰能够为小核酸药物带来更多功能。除了修饰寡核苷酸药物的自身结构，在其末端加上修饰可以用于调整药代动力学 特性，以及赋予 siRNA 双链体新功能：定点靶向细胞。通过在 siRNA 末端引入叶酸、肽和适体可以协助其跨细胞屏障转运，并特异性导向部分细胞类型；增加细胞膜穿透能力。由于 siRNA 带负电荷并且具有较强亲水性，因此不易与带同样电荷的靶细胞接
46、触，更不易透过 由脂质双分子层构成的细胞膜进入细胞内发挥作用。通过引入亲脂性基团，如胆固醇，能加强 siRNA 的亲脂性，增加 其透过细胞膜的能力；研究 siRNA体内分布。通过在 siRNA 末端附加荧光分子，可以研究其在体内的生物分布和摄取，为小核酸药物的开发 奠定更坚实的基础。6.2 递送系统能够使小核酸药物被完整运输到靶位点小核酸药物特性使其较难以裸 RNA形式给药。尽管化学修饰可以增强小核酸药物的稳定性和半衰期，同时解决免疫原性的 问题，但如果不能进入细胞实现胞吞，小核酸药物依然不能发挥药物作用。然而，作为外源性药物，这些基于 RNA 的药物 会被核酸酶降解，并且由于其分子量较大以及
47、负电荷的特性，导致其难以穿过细胞膜发挥作用。因此，如何克服生物学障碍， 实现高效跨膜和有效体内运输以达到相应药效一直是核酸药物开发亟待解决的瓶颈问题，目前，递送系统成为提高转送效率 的关键办法之一。载体主要可以分为病毒载体和非病毒载体：1）病毒载体效率较低且进入人体后会引起免疫反应，现在使用较少；2）非病毒 载体中较为常用的主要分为纳米颗粒和缀合物，目前被广泛使用。6.2.1 脂质纳米粒递送系统LNP 是应用最早的递送系统。脂质纳米粒（Lipid Nanoparticle，LNP）是使用脂质形成纳米微粒，结构为由磷脂双层组成 的囊泡。通过将核酸药物装载到 LNP 中，可保护被包裹的核酸药物免于
48、降解和清除，并促进其跨细胞膜运输到目标靶位。 由于成分的生物相容性和复合物的容易组装，LNP 是一种有吸引力的递送方法，只需要混合和孵育成分，因此目前在药物开 发中使用较多。构建 LNP 递送系统需要 3 种物质：1）阳离子脂质，通过静电作用包裹着核酸药物，从而形成 LNPs/siRNA 复合物；2）辅助脂质即促融合磷脂，破坏细胞膜脂质双层结构，增加 LNPs 的转染活性；3）聚乙二醇（PEG），通过增加胶体稳定性和保护 LNPs 免受巨噬细胞的侵袭而降低免疫反应，而过多的 PEG 脂质会阻 碍 LNPs 的细胞内化。目前使用较多的亚型是可离子化 LNP。最早被发现和使用的类型是阳离子 LNP
49、，然而，早期的阳离子 LNP 由于容易被巨噬 细胞清除和产生有害的 ROS 等缺点，其体内应用受到很大限制。而可离子化 LNP 能在体内保持中性，避免被清除并降低副 作用，而当进入强酸性环境如内吞体，即可以质子化形成阳离子从而与内源的阴离子脂质结合，提高跨膜效率。在 Arbutus 和 Alnylam 等公司的开发下，离子化脂质递送系统目前已经经历三次迭代，主要代表类型为 DLin-DMA、DLin-MC3-DMA 和 L319，中位有效剂量（ED50s）为 1、0.005 和0.01mg/kg。第一代是 1,2-二亚油基-3-二甲基氨基丙烷（DLinDMA），用于开发了 TKM-080301、ALN-VSP 和 ALN-TTR0