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1、 细菌形态学检查形态学检查的目的：形态学检查的目的：从形态上识别细菌，为细菌分类与鉴别从形态上识别细菌，为细菌分类与鉴别的基础；的基础；了解被检标本中有无细菌；了解被检标本中有无细菌；直接从标本中观察到某些细菌，可对少直接从标本中观察到某些细菌，可对少数疾病初步诊断（如结核，脑膜炎等）。数疾病初步诊断（如结核，脑膜炎等）。1.普通光学显微镜 原理原理 自然光的波长为；显微镜的最大自然光的波长为；显微镜的最大分辨率为（前者的一半）；肉眼的分辨率为，分辨率为（前者的一半）；肉眼的分辨率为，故放大故放大10001000倍，使放大到。倍，使放大到。第一节 显微镜（microscope）2.暗视野显微镜
2、 常用于活的微生物的动力检测常用于活的微生物的动力检测 3.相差显微镜 利用相差板的光栅作用，使光波穿过标本中密利用相差板的光栅作用，使光波穿过标本中密度不同的部位时，引起位相差，显出光的强度的明度不同的部位时，引起位相差，显出光的强度的明暗对比。暗对比。应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。4.荧光显微镜 以紫外光或蓝紫光作光源，因其波长比自然光以紫外光或蓝紫光作光源，因其波长比自然光短，故分辨率比普通显微镜要高。短，故分辨率比普通显微镜要高。5.电子显微镜：以强大的电子流代替光源，因电子流的波长以强大的电子流代替光源，因电子流的波长仅为，（仅为可见光源
3、的几万分之一），故其放大仅为，（仅为可见光源的几万分之一），故其放大倍数可达倍数可达1010万万-100-100万倍，可看清万倍，可看清1nm1nm的物体。的物体。电镜种类 透射电镜：因电子的透射作用，可观察细菌，因电子的透射作用，可观察细菌，virusvirus内部结构，通过荧屏显示。内部结构，通过荧屏显示。扫描电镜：因电子流对物体的表面进行扫描，因电子流对物体的表面进行扫描，可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构，可可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构，可用于对细菌，用于对细菌，virusvirus的结构观察。的结构观察。仅用于细菌动力的观察。仅用于细菌动力的观察。1.压滴法压滴法 明视
4、野法、暗视野法。明视野法、暗视野法。2.悬滴法悬滴法 3.毛细管法毛细管法：孔径，长约：孔径，长约60-70mm毛细管，以此毛细管，以此管轻取细菌培养物，待液体进入后，两端火焰封管轻取细菌培养物，待液体进入后，两端火焰封融。用于厌氧菌的动力观察。融。用于厌氧菌的动力观察。注意：区别细菌的运动与布朗运动。注意：区别细菌的运动与布朗运动。第二节 不染色细菌标本检查法一：染料一：染料：大多是人工合成的含苯环或苯的有机物。：大多是人工合成的含苯环或苯的有机物。色色 基基：即连接在苯环上带双键的有色化学基团即连接在苯环上带双键的有色化学基团 ，它使染料带颜色，其色基越多，颜色越深它使染料带颜色，其色基越
5、多，颜色越深 如如-NO-NO2 2(硝基）硝基）-N=N-N=N-（偶氮基（偶氮基）助色基助色基：不显色，它决定了染料与被染物之间的亲和不显色，它决定了染料与被染物之间的亲和 性，且有酸、碱之分，决定了染料的酸碱性性，且有酸、碱之分，决定了染料的酸碱性:-NH2 -NH2（碱性）（碱性）-OH -OH（酸性）（酸性）第三节 细菌染色标本的检查 常用染料种类：碱性染料碱性染料：美兰，结晶紫，碱性复红等，色基：美兰，结晶紫，碱性复红等，色基带正电，易与带负电的被染物结合着色带正电，易与带负电的被染物结合着色 酸性染料酸性染料：伊红，酸性复红，刚果红，色基带：伊红，酸性复红，刚果红，色基带负电负电
6、 复合染料复合染料：可与：可与cellcell浆结合浆结合 单纯染料单纯染料：多为偶氮化合物，亲和力低，不溶：多为偶氮化合物，亲和力低，不溶于水，而溶于脂溶剂。于水，而溶于脂溶剂。二 染色程序：基本步骤：涂片（干燥）固定 染色（初染、煤染、脱色、复染）1.涂片制备：液体标本（细菌培养液）直接涂于玻片上；固体培养基上的培养物，取生理盐水涂片，涂成蚕豆大小的菌膜。2.2.固定：固定：目的：目的：杀死细菌，使蛋白质凝固，易于着色杀死细菌，使蛋白质凝固，易于着色 改变其通透性，利于染料进入改变其通透性，利于染料进入 使菌体附着在玻片上使菌体附着在玻片上 保持细菌原有的形态、结构保持细菌原有的形态、结构
7、 方法：常用的火焰加热固定法。方法：常用的火焰加热固定法。3.3.染色：染色：目的：加固初染目的：加固初染 媒染剂：媒染剂：石炭酸，碘液，明矾，酚等，也可加热。石炭酸，碘液，明矾，酚等，也可加热。目的：使不该染上颜色的部分脱下颜色目的：使不该染上颜色的部分脱下颜色 脱色剂：酸（为碱的脱色剂）脱色剂：酸（为碱的脱色剂）碱（为酸的脱色剂），还有甲醇，乙醇等碱（为酸的脱色剂），还有甲醇，乙醇等脱色机制：脱色机制：影响蛋白质的电离程度，改变其电荷的影响蛋白质的电离程度，改变其电荷的 性质或数量，从而影响细菌与染料结合的程度性质或数量，从而影响细菌与染料结合的程度初染初染 媒染媒染脱色脱色（对比染色）对
8、比染色）常用染料：稀释复红、沙黄（与紫色对比）、常用染料：稀释复红、沙黄（与紫色对比）、美兰、苦味液（与红色对比）美兰、苦味液（与红色对比）复复 染染三：常用的染色法三：常用的染色法（一）单染法：（一）单染法：用一种染料染，细菌及周围部分都染成用一种染料染，细菌及周围部分都染成同一种颜色同一种颜色主要用于观察细菌的形态、大小、主要用于观察细菌的形态、大小、排列及简单的结构，如美兰染色，复红染色。排列及简单的结构，如美兰染色，复红染色。（二）复染法：（二）复染法：用两种以上的染料，将不同的细菌或同用两种以上的染料，将不同的细菌或同一细菌的不同结构染成不同的颜色。一细菌的不同结构染成不同的颜色。由
9、丹麦细菌学家由丹麦细菌学家Christain GramChristain Gram首创，已有首创，已有100100多年的历史。多年的历史。染料染料：结晶紫、卢戈氏碘液、结晶紫、卢戈氏碘液、95%95%酒精、稀释石炭酸复红酒精、稀释石炭酸复红 1.革兰染色法（Gram stain):原理：原理：（1）等电点学说）等电点学说：革兰阳性菌：革兰阳性菌ph2-3,低于低于革兰阴性菌革兰阴性菌ph4-5。（2）化学学说：）化学学说：革兰阳性菌含大量核糖核革兰阳性菌含大量核糖核酸镁盐。酸镁盐。（3）通透性学说：）通透性学说：革兰阳性菌革兰阳性菌cell wall因因肽聚糖厚，脂类少，肽聚糖厚，脂类少，通透
10、性低，酒精不易进入通透性低，酒精不易进入脱色，相反革兰阴性菌肽聚糖少，含脂多，易脱色，相反革兰阴性菌肽聚糖少，含脂多，易被酒精溶解，使被酒精溶解，使cell wall通透性升高。通透性升高。结晶紫（初染）结晶紫（初染）卢戈氏碘液（媒染）卢戈氏碘液（媒染）95%95%酒精（脱色）酒精（脱色）稀释石炭酸复红（复染）稀释石炭酸复红（复染）1min 1min 水洗水洗1min 1min 水洗水洗1min 1min 水洗水洗结果：结果：意义：意义：方法：方法：2.抗酸染色（acid-fast stain）原 理：分枝杆菌一般不易着色，若用分枝杆菌一般不易着色，若用5%5%石炭酸复红加温并延长染色时间，可
11、染上红石炭酸复红加温并延长染色时间，可染上红色，又因其菌体中含有分枝菌酸，可抵抗色，又因其菌体中含有分枝菌酸，可抵抗3%3%盐酸酒精的脱色，仍保持红色，故称为抗酸盐酸酒精的脱色，仍保持红色，故称为抗酸菌。菌。方 法：石炭酸复红（初染）石炭酸复红（初染）盐酸酒精脱色盐酸酒精脱色碱性美兰（复染）碱性美兰（复染）1min加热至冒蒸汽加热至冒蒸汽 5min 5min涂片、干燥、固定涂片、干燥、固定结 果：意 义：细胞壁染色：染液：染液：10鞣酸溶液、结晶紫溶液鞣酸溶液、结晶紫溶液 方法：涂片自然干燥方法：涂片自然干燥鞣酸染鞣酸染15min，水洗，水洗 结晶紫染结晶紫染35min，水洗，水洗待干，镜检。
12、待干，镜检。结果：细胞壁（细菌的周边）染成紫色，内部无色；结果：细胞壁（细菌的周边）染成紫色，内部无色；无细胞壁的细菌（无细胞壁的细菌（L型菌）整个菌体染成紫色。型菌）整个菌体染成紫色。3.特殊染色法鞭毛染色法 芽孢染色法荚膜染色法 异染颗粒染色法透射电镜扫 描 电 镜革兰阴性菌（红色）革兰阴性菌（红色）革兰阳性菌（紫色）革兰阳性菌（紫色）123图一图一图二图二鞭毛染色法荚膜染色法第一章 细菌的形态与结构一、细菌的大小和形态一、细菌的大小和形态 细菌的基本形态：细菌的基本形态：球形、杆状、螺形菌球形、杆状、螺形菌二、细菌的结构二、细菌的结构 基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质 特殊结构：鞭毛、菌毛、荚膜、芽胞特殊结构：鞭毛、菌毛、荚膜、芽胞三、细菌三、细菌L L型型 复 习