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1、项项 荣荣 中南大学生物科学与技术学院细胞生物学系中南大学生物科学与技术学院细胞生物学系Preparatory observe put forward theories Design control testsCollect data Explain results Devise conclusion Refer to knowledge第一节第一节 显微成像技术显微成像技术第二节第二节 细胞工程技术细胞工程技术第三节第三节 细胞组分的分离技术细胞组分的分离技术第四节第四节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法内容提要内容提要第一节第一节 显微成像技术显微成像技术一、光学显微镜一、光学显微镜分
2、辨率分辨率/力力(resolution)是指能够区别开的两个质点的最小是指能够区别开的两个质点的最小距离。分辨力的最终限度是决定于光的距离。分辨力的最终限度是决定于光的波长。对任何显微镜而言，最重要的是波长。对任何显微镜而言，最重要的是分辨力，而不是放大倍数。分辨力，而不是放大倍数。分辨率分辨率(resolution，R)：/(nsin/2)mn-介质折射率空气：1油：m(micrometer)=10-6mnm(nanometer)=10-9m(ngstrmunit)=10-10ma.普通光学显微镜普通光学显微镜b.荧光显微镜荧光显微镜Fluorescent dyesFruit fly emb
3、ryo Cell nucleusc.激激光共聚焦光共聚焦扫描显微镜扫描显微镜Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.d.相差显微镜相差显微镜Two ways to obtain contrast in light microscopyFour types of l
4、ight microscopy.(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbycommonlightmicroscopy(B)phase-contrastmicroscopy,(C)differential-interference-contrastmicroscopy,and(D)dark-fieldmicroscopy.E.Electronic image processingLimit of resolution of the electron microscope.Electronmicrographofathinlayerofgoldshowi
5、ngtheindividualfilesofatomsinthecrystalasbrightspots.Thedistancebetweenadjacentfilesofgoldatomsisabout0.2nm(2).二、电子显微镜光镜与电镜的基本区别光镜与电镜的基本区别类型类型分辨力分辨力光源光源透镜透镜真空真空光镜光镜200200 n n m m可见光可见光波长波长300-700300-700 n n m m玻璃透镜玻璃透镜不要求不要求100100 n n m m紫外光紫外光波长波长200200 n n m m玻璃透镜玻璃透镜电镜电镜0.1n0.1n m m电子束电子束波长波长0.01
6、-0.90.01-0.9 n n m m电磁透镜电磁透镜要求要求电镜技术的基本特点电镜技术的基本特点1 1）电子束照明系统，包括电子枪、聚光镜。电子）电子束照明系统，包括电子枪、聚光镜。电子 束比可见光的波长短得多，提高了分辨力。束比可见光的波长短得多，提高了分辨力。2 2）电磁透镜成像系统聚焦成像。）电磁透镜成像系统聚焦成像。3 3）真空系统：电子运行中如遇到气体分子将会被）真空系统：电子运行中如遇到气体分子将会被 散射，所以电镜镜筒中要求高真空。散射，所以电镜镜筒中要求高真空。4 4）记录系统：电子像是人眼看不到的，因此要用）记录系统：电子像是人眼看不到的，因此要用 荧光屏来显示或感光胶片
7、作记录。荧光屏来显示或感光胶片作记录。电镜种类v1.透射电子显微镜v2.扫描电子显微镜Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions.Immunogold electron microscopy.1.超薄切片（超薄切片（4050nm）。）。2.固定固定包埋包埋 切片切片 染色染色等过程要求高。等过程要求高。3.重金属盐染色或喷镀重金属盐染色或喷镀，以形成不同程度的，以形成不同程度的 反差，提高分辨力。反差，提高分辨力。4.负染技术负染技术5.冰冻断裂和冰冻蚀刻技术冰冻断裂
8、和冰冻蚀刻技术电镜技术的基本要求：电镜技术的基本要求：Specimen Preparation for Electron MicroscopyChemical fixationDiagram of the copper grid used to support the thin sections of a specimen in the transmission electron microscope.Electron micrographs of individual myosin protein moleculesMetal Shadowing Allows Surface Feature
9、s to Be ExaminedElectron micrograph of negatively stained actin filaments.Freeze-fracture electron micrograph of the thylakoid membranes from the chloroplast of a plant cell.Freeze-Fracture and Freeze-Etch Electron Microscopy Regular array of protein filaments in an insect muscle.Scanning electron m
10、icroscope(SEM)Images of surfaces can be obtained by SEM;Critical-point drying;Range:15150,000 X.Resolution:5nm Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionel
11、ectronmicroscopy(C).细胞工程技术v一、细胞培养v二、细胞融合v三、显微操作细胞培养细胞培养（cell culture）概念概念 是指从活体中取出的细胞或其他建系是指从活体中取出的细胞或其他建系细胞，在体外给予一定的条件进行培养，细胞，在体外给予一定的条件进行培养，使其能继续生存、生长和繁殖的一种方法。使其能继续生存、生长和繁殖的一种方法。细胞培养的用途1）直接观察活细胞的形态、结构和生命活动的）直接观察活细胞的形态、结构和生命活动的过程。过程。2）直接施加物理、化学和生物因子，观察对细）直接施加物理、化学和生物因子，观察对细胞影响。胞影响。3）可将不同种类的细胞混合培养，研
12、究细胞间）可将不同种类的细胞混合培养，研究细胞间的相互作用。的相互作用。4）配合其他的实验技术可作大量的研究工作，）配合其他的实验技术可作大量的研究工作，如细胞周期与调控、细胞衰老等。如细胞周期与调控、细胞衰老等。5）为植物育种开辟新途径，为疫苗生产、药物）为植物育种开辟新途径，为疫苗生产、药物研制提供新手段。研制提供新手段。细胞培养的条件1）温度）温度2）pH值值3）营养物质）营养物质4）无菌条件）无菌条件A.A.动物细胞培养动物细胞培养B.B.植物细胞培养植物细胞培养C.C.非细胞体系非细胞体系D.D.细菌的培养细菌的培养E.E.病毒的培养病毒的培养细胞培养的种类细胞培养的种类动物细胞培养
13、的特点动物细胞培养的特点1）能显示来源组织的分化特征。）能显示来源组织的分化特征。例如：成纤维细胞仍能分泌胶原例如：成纤维细胞仍能分泌胶原;神经细胞伸展出具有电兴奋作用的轴突。神经细胞伸展出具有电兴奋作用的轴突。2）可从组织的不同类型的细胞混合群体中）可从组织的不同类型的细胞混合群体中纯化某种类型的细胞，便于单因素的分析。纯化某种类型的细胞，便于单因素的分析。3）取材容易，使用方便。）取材容易，使用方便。细胞培养的方法细胞培养的方法1）贴附型：能在玻璃或塑料瓶壁）贴附型：能在玻璃或塑料瓶壁 上平展生长，形成单层细胞层。上平展生长，形成单层细胞层。如上皮型细胞、成纤维型细胞等。如上皮型细胞、成纤
14、维型细胞等。2）悬浮型：不贴附于支持物上，）悬浮型：不贴附于支持物上，呈悬浮生长，胞体呈球形。呈悬浮生长，胞体呈球形。如淋巴细胞等。如淋巴细胞等。原代培养和传代培养原代培养（原代培养（primary culture）1）概念）概念 直接取材于有机体组织的细胞培养。直接取材于有机体组织的细胞培养。2）步骤）步骤 取材取材剪碎剪碎 胰酶消化将细胞分散胰酶消化将细胞分散置置合适的培养基培养，一般数小时即可贴壁生合适的培养基培养，一般数小时即可贴壁生长、增殖，直到相互接触铺满瓶壁，形成单长、增殖，直到相互接触铺满瓶壁，形成单层细胞。第一代细胞称为原代细胞。层细胞。第一代细胞称为原代细胞。传代培养（传代
15、培养（secondary culture）：将原代）：将原代培养的细胞取出，转移到另一盛有新鲜培养培养的细胞取出，转移到另一盛有新鲜培养液的器皿中进行培养的过程称传代培养。用液的器皿中进行培养的过程称传代培养。用这种方法可重复传代。这种方法可重复传代。细胞系细胞系(cell line)概念概念培养的细胞中产生了具有无限繁殖能力培养的细胞中产生了具有无限繁殖能力的变异细胞，这种细胞可被无限地传代，的变异细胞，这种细胞可被无限地传代，称为细胞系称为细胞系常常 用用 细细 胞胞 系：系：细胞系细胞系 细胞类型细胞类型 来源来源 3T3 成纤维细胞成纤维细胞 小鼠小鼠 BHK-21 成纤维细胞成纤维细
16、胞 仓鼠仓鼠 Hela 上皮细胞上皮细胞 人宫颈癌人宫颈癌 PTK1 上皮细胞上皮细胞 袋鼠袋鼠 L6 成肌细胞成肌细胞 大鼠大鼠 SP2 浆细胞浆细胞 小鼠小鼠植物细胞培养A 单倍体培养单倍体培养B 原生质培养原生质培养Preparation of hybridomas that secrete monoclonal antibodies against a particular antigen(X).Monoclonal AntibodiesThe technique for the take apart and gather up of cell,and microscope manip
17、ulationTransgenic Transgenic micemice10 weeks10 weeks44g and 29g44g and 29gMethods to introduce a membrane-impermeant substance into a cell.Gene Knockout miceMario Capecchi(Late1980s)(UniversityofUtah)embryonic stem cellsininnercellmassastarget cells1/104 cells undergo a process of homologous recomb
18、ination.Step-by-step procedure for the purification of organelles by differential centrifugation.1.差速离心（differential centrifugation）差速离心差速离心 在密度均一的介质中，不同大小的颗粒在密度均一的介质中，不同大小的颗粒 沉降速度不同，大颗粒沉降快，先到管底，沉降速度不同，大颗粒沉降快，先到管底，逐步加大离心力，延长离心时间，可分离细逐步加大离心力，延长离心时间，可分离细 胞的不同组分。胞的不同组分。组织匀浆组织匀浆沉淀小块含整个沉淀小块含整个细胞核和细胞骨架细胞核
19、和细胞骨架低速离心低速离心1000g 10min1000g 10min将上清中速离心将上清中速离心20000g 20min沉淀小块含线粒体、溶沉淀小块含线粒体、溶酶体、过氧化物酶体酶体、过氧化物酶体沉淀小块含微粒体小泡沉淀小块含微粒体小泡将上清高速离心将上清高速离心80000g 1小时小时沉淀小块含核糖体、沉淀小块含核糖体、病毒、大分子病毒、大分子将上清超高速离心将上清超高速离心150000g 3小时小时2.密度梯度离心密度梯度离心(density gradient centrifugation)在离心管中制备由上到下逐渐增加密在离心管中制备由上到下逐渐增加密度的蔗糖溶液（度的蔗糖溶液（5%2
20、0%），形成密度），形成密度梯度，细胞匀浆放最上面，这样不同组梯度，细胞匀浆放最上面，这样不同组分以不同速率沉降，形成不同的沉降带，分以不同速率沉降，形成不同的沉降带，分别收集，进行分析。分别收集，进行分析。密度梯度离心密度梯度离心The separation of small molecules by paper chromatography.3.Paper chromatographyThe separation of molecules by column chromatography.4.Column chromatography5.chromatography细胞组分的分析方法v一、
21、组织化学和细胞化学法v二、免疫化学法v三、分子细胞生物学技术1.金属沉淀法2.福尔根(Feulgen)反应3.联苯胺反应4.脂溶染色法5.茚三酮反应一、组织化学和细胞化学法二、免疫化学法蛋白印迹法(western blot)SDS polyacrylamide-gel electrophoresisSDS polyacrylamide-gel electrophoresis(SDS-PAGE).（一）（一）DNA序列分析序列分析（二）（二）核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 Northern blot，Southern blot（三）（三）聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术（PCR)（四）（四
22、）放射自显影术放射自显影术三、分子细胞生物学技术双脱氧链末端终止法测序原理示意图 PCR反应过程示意图In situ hybridization for RNA localization in tissues.Tracing and Assaying Molecules Inside CellsTheresultsofapulse-chaseexperimentinwhichpancreaticbetacellswerefed3H-leucinefor5minutesfollowedbyexcessunlabeledleucine(thechase).Visualizing intracell
23、ular Ca2+concentrations using a fluorescent indicator.Fluorescent analogue cytochemistry.Fluorescence micrograph of the leading edge of a living fibroblast that has been injected with rhodamine-labeled tubulin.其他的细胞生物学技术A fluorescence-activated cell sorter.Freeze-etch electron microscopyFigure 3-33.
24、The production of hybrid cells.Humancellsandmousecellsarefusedtoproduceheterocaryons,whicheventuallyformhybridcells.Theseparticularhybridcellsareusefulformappinghumangenesonspecifichumanchromosomesbecausemostofthehumanchromosomesarequicklylostinarandommanner,leavingclonesthatretainonlyoneorafew.Thehybridcellsproducedbyfusingothertypesofcellsoftenretainmostoftheirchromosomes.