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1、第三章微生物酶第1页，本讲稿共25页 Takamine利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破。其利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破。其方法甚至在今天仍被采用。方法甚至在今天仍被采用。第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工艺和设备的日臻完第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工艺和设备的日臻完善，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔善，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场。的市场。20世纪世纪90年代以后，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由年代以后，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因
2、重组，可以在微生物上得到表达。动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上得到表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此“基因工程基因工程+发酵工发酵工艺艺+先进发酵设备先进发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。可以算是酶工业的第三次飞跃。第2页，本讲稿共25页3.23.2微生物微生物酶的开的开发3.2.13.2.1应用微生物来开用微生物来开发酶的的优点点 微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速品，生产能力（发酵
3、）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。扩张的市场需求。微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且不同微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且不同环境下生存的微生物都有其迥然不同的代谢方式，能分解利用不环境下生存的微生物都有其迥然不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。同的底物。这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。第3页，本讲稿共25页3.2.23.2.2微生物微生物酶开开发的一般程序的一般程序样品样品采集采集菌种菌种分离分离初筛初筛复筛复筛摇瓶摇瓶实验实验最佳产酶条件组合研究最佳产酶条件组合研究微生物育
4、种微生物育种物理诱变物理诱变化学诱变化学诱变分子改造分子改造酶的制备酶的制备收集发酵液收集发酵液收集菌体收集菌体胞外酶胞外酶胞内酶胞内酶破碎破碎酶学研究酶学研究产品产品扩大扩大指指导导工工业业生生产产实实践践保藏菌种保藏菌种第4页，本讲稿共25页一、样品的采集一、样品的采集 采样的目的决定采样地点的选择、采样方法及采样的数量。存在目采样的目的决定采样地点的选择、采样方法及采样的数量。存在目的酶作用底物或潜在作用底物的场所是首选的采样地。的酶作用底物或潜在作用底物的场所是首选的采样地。实例：实例：生物工程中应用到的生物工程中应用到的Taq酶就是来自于从美国黄石国家公酶就是来自于从美国黄石国家公园
5、园100硫泉中分离获得的水生栖热菌。硫泉中分离获得的水生栖热菌。采样的另一个原则就是到特殊或极端环境中采集样品，从这些采样的另一个原则就是到特殊或极端环境中采集样品，从这些微生物中往往能获得新酶或具有特殊稳定性的酶种。微生物中往往能获得新酶或具有特殊稳定性的酶种。实例：实例：为了获得产纤维素酶的目的菌，就可以到垃圾填埋场或长为了获得产纤维素酶的目的菌，就可以到垃圾填埋场或长期堆放纤维材料的地方，甚至食草动物的消化道中采样。期堆放纤维材料的地方，甚至食草动物的消化道中采样。第5页，本讲稿共25页 菌种的分离是整个工作的第一个关键步骤。分离应注意以下菌种的分离是整个工作的第一个关键步骤。分离应注意
6、以下几个问题：几个问题：分离培养基的确定。分离培养基的确定。分离培养条件的选择，如培养温度、湿度、好氧或厌氧培养等；分离培养条件的选择，如培养温度、湿度、好氧或厌氧培养等；在分离的最初阶段一般不给予严密的培养条件，尽可能分离到在分离的最初阶段一般不给予严密的培养条件，尽可能分离到尽可能多的纯菌种。尽可能多的纯菌种。二、菌种的分离二、菌种的分离第6页，本讲稿共25页三、菌种的初筛三、菌种的初筛 菌种的初筛有两种方法：菌种的初筛有两种方法：用简单的定性反应进行初筛；用简单的定性反应进行初筛；在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的
7、菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。株的一株纯化分离。初筛的目的：初筛的目的：就是要用最简单和最快捷的方法来对大量的待就是要用最简单和最快捷的方法来对大量的待筛菌进行测试。筛菌进行测试。建立有效的初筛模型是最为重要的一个环节。建立有效的初筛模型是最为重要的一个环节。第7页，本讲稿共25页四、菌种的复筛四、菌种的复筛 复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。产要求的菌种。在复筛阶段，酶活力测定方法的建立十分重要。在复筛阶段
8、，酶活力测定方法的建立十分重要。最后，应该指出，除了可以从自然界中分离获得目的酶产生菌外，最后，应该指出，除了可以从自然界中分离获得目的酶产生菌外，也可以从已经保藏的菌种中筛选产酶菌种。这样做不仅可以节约大量也可以从已经保藏的菌种中筛选产酶菌种。这样做不仅可以节约大量的人力和物力，而且可以根据前人的资料和经验，了解产酶微生物的的人力和物力，而且可以根据前人的资料和经验，了解产酶微生物的类别，然后有目的地加以寻找，搜集有关菌种或相类似的微生物，则类别，然后有目的地加以寻找，搜集有关菌种或相类似的微生物，则可达到事半功倍的效果。可达到事半功倍的效果。第8页，本讲稿共25页五、对复筛获得的菌株的要求
9、五、对复筛获得的菌株的要求 对于经过复筛之后获得的高产菌株还应在此阶段进行考察。对于经过复筛之后获得的高产菌株还应在此阶段进行考察。不能是致病菌。不能是致病菌。所获菌株应不易变异和退化，不易感染噬菌体。所获菌株应不易变异和退化，不易感染噬菌体。微生物产酶量高，生长繁殖快。酶的性质符合应用的需要，而且最好是微生物产酶量高，生长繁殖快。酶的性质符合应用的需要，而且最好是产胞外酶的菌株。产胞外酶的菌株。产生的酶便于分离和提纯，得率高。产生的酶便于分离和提纯，得率高。营养要求低。营养要求低。第9页，本讲稿共25页六、最佳产酶条件的初步确定六、最佳产酶条件的初步确定1.1.培养方式的确定培养方式的确定固
10、体法；液体法固体法；液体法2.2.最佳培养条件最佳培养条件组合合3.3.胞内胞内酶和胞外和胞外酶胞外胞外酶具有以下一些具有以下一些优点：点：（1 1）分离提取容易，且不必破碎）分离提取容易，且不必破碎细胞，因而也就省去了胞，因而也就省去了去除核酸的工去除核酸的工艺；（2 2）胞外）胞外酶的生的生产不受可不受可获得生物量的限制，因而容易得到得生物量的限制，因而容易得到较高高的的酶产量；量；（3 3）胞外）胞外酶活性活性显现的最适条件与的最适条件与产酶菌株的最适生菌株的最适生长条件往往条件往往一致。一致。第10页，本讲稿共25页 与之相反，以胞内酶为商品酶生产的酶源，不仅生产工艺与之相反，以胞内酶
11、为商品酶生产的酶源，不仅生产工艺复杂，而且酶合成量的提高往往受复杂，而且酶合成量的提高往往受“饱和饱和”效应的限制，甚至效应的限制，甚至给细胞带来毒性。给细胞带来毒性。注意：注意：并不是所有的并不是所有的酶都可找到其相都可找到其相应的胞外的胞外酶产生菌，少生菌，少数一些数一些酶就只能在微生物就只能在微生物细胞内生成。比如葡萄糖氧化胞内生成。比如葡萄糖氧化酶、过氧氧化物化物酶、蔗糖、蔗糖酶、乳糖、乳糖酶等。等。另外，用于分子生物学研究的多聚另外，用于分子生物学研究的多聚核苷酸磷酸化核苷酸磷酸化酶、核糖核酸、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸、脱氧核糖核酸酶、DNADNA聚合聚合酶等也等也属于胞内属于胞内酶
12、。可采取措施：可采取措施：在在实验室水平上多用室水平上多用冻融、研磨或超声波法来破融、研磨或超声波法来破碎碎细胞壁。在工胞壁。在工业应用上用上还可通可通过控制培养温度的控制培养温度的办法使法使细胞自溶胞自溶来来获取目的取目的酶。如。如酿酒酵母来生酒酵母来生产蔗糖蔗糖酶就是一个很好的例子。就是一个很好的例子。第11页，本讲稿共25页4.4.微生物微生物酶收集的收集的时间顺序序 酶的积累发生在菌体生活周期中的哪一个阶段，随着各菌种和酶酶的积累发生在菌体生活周期中的哪一个阶段，随着各菌种和酶的不同有很大变化。除了延迟期外，在生长周期中的任何一个阶段，的不同有很大变化。除了延迟期外，在生长周期中的任何
13、一个阶段，都可以大量出现所需要的酶。都可以大量出现所需要的酶。在某些情况下，胞外酶在对数生长期的早期就开始出现，并且在在某些情况下，胞外酶在对数生长期的早期就开始出现，并且在以后的几个阶段中继续增加数量。以后的几个阶段中继续增加数量。胞内酶可能主要产生于对数生长期，但是，只有在衰亡期，当胞内酶可能主要产生于对数生长期，但是，只有在衰亡期，当细胞被溶解时才释放到培养基中，因此，通常在对数生长期的末细胞被溶解时才释放到培养基中，因此，通常在对数生长期的末期收集细胞以回收胞内酶最为合适，然后再利用菌体自溶、机械期收集细胞以回收胞内酶最为合适，然后再利用菌体自溶、机械研磨或超声波处理使酶释放到提取液中
14、。研磨或超声波处理使酶释放到提取液中。第12页，本讲稿共25页方法：方法：七、微生物产酶性能的进一步提高七、微生物产酶性能的进一步提高1.1.获得高得高产菌种的突菌种的突变体；体；2.2.利用代利用代谢调节机理来提高微生物的机理来提高微生物的酶产量；量；3.3.运用运用遗传、基因工程的手段将原有菌株中的目的、基因工程的手段将原有菌株中的目的酶基因基因转移到另外一些移到另外一些对生生产环境更具有适境更具有适应性的微生物性的微生物细胞之内使其高效表达。胞之内使其高效表达。第13页，本讲稿共25页微生物微生物酶的提取工作是的提取工作是为进一步了解一步了解酶的特性、完善的特性、完善酶开开发后后续工工艺
15、的前提和基的前提和基础。酶的提取按照不同的提的提取按照不同的提纯要求又可分要求又可分为酶的的粗提及粗提及酶的精提。的精提。1.1.酶的粗提的粗提工工业生生产上用到的微生物上用到的微生物酶一般用量都很大，一般用量都很大，纯度要求也不很高。如度要求也不很高。如果待开果待开发的的酶是工是工业用途的用途的话，则提取方法可以比提取方法可以比较粗放。具体的提取流粗放。具体的提取流程如下：程如下：八、微生物酶的提取方法八、微生物酶的提取方法胞内酶的提取：胞内酶的提取：收集菌体收集菌体破碎细胞破碎细胞收集提取液收集提取液酶的沉淀分离（盐析、有机溶剂沉酶的沉淀分离（盐析、有机溶剂沉淀等）淀等）胞外酶的提取：胞外
16、酶的提取：培养菌体培养菌体收集发酵液液收集发酵液液第14页，本讲稿共25页2.2.酶的精制的精制用于用于结构构鉴定或其他特殊用途的定或其他特殊用途的酶，通常需要精制，其基本流程如下：，通常需要精制，其基本流程如下：（1 1）一般流程）一般流程粗提酶液粗提酶液 脱盐脱盐透析透析凝胶过滤凝胶过滤浓缩浓缩超滤超滤凝胶干燥凝胶干燥离子交换浓缩离子交换浓缩分离分离离子交换层析离子交换层析凝胶色谱层析凝胶色谱层析纯化纯化亲和层析亲和层析等电聚集等电聚集酶的结晶酶的结晶（2 2）一种新型的微生物酶纯化手段）一种新型的微生物酶纯化手段制备型聚丙烯酰胺凝胶电制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳泳第15页，本讲稿共25页对于
17、无于无论用什么方法所用什么方法所获得的得的酶高高产菌株，都必菌株，都必须对其其进行有效行有效的菌种保藏。常的菌种保藏。常见的菌种保藏有以下一些方法：的菌种保藏有以下一些方法：（1 1）斜面菌种）斜面菌种4 4低温保藏低温保藏 该方法只能作为菌种的短期保藏。该方法只能作为菌种的短期保藏。九、菌种保藏九、菌种保藏（2 2）液体石蜡油保藏）液体石蜡油保藏（3 3）沙土管保藏法）沙土管保藏法（4 4）冷）冷冻保藏法保藏法第16页，本讲稿共25页3.33.3微生物微生物酶的的应用用 用微生物生产的商业化酶已有百余种。但产量大、应用广、经济用微生物生产的商业化酶已有百余种。但产量大、应用广、经济效益高的酶
18、品种主要是各种分解酶。另外，基因工程工具酶日新月异效益高的酶品种主要是各种分解酶。另外，基因工程工具酶日新月异的进步也从根本上改变了人们的生活。的进步也从根本上改变了人们的生活。3.3.13.3.1蛋白蛋白酶1.1.去去污剂工工业2.2.乳酪制造乳酪制造业3.3.新兴健康食品新兴健康食品如，甜味的非碳水化合物如，甜味的非碳水化合物第17页，本讲稿共25页3.3.23.3.2芳基乙芳基乙醚酶木木质素素经过该酶降解后能降解后能转换出有用的高档出有用的高档药品、燃料、能品、燃料、能源及生物降解塑料聚源及生物降解塑料聚羟丁丁酯的原料。的原料。3.3.33.3.3纤维素素酶纤维素占地球素占地球动植物植物
19、总量的一半，是数量最大的可再生量的一半，是数量最大的可再生资源。源。目前研究的目前研究的对象集中在：象集中在：（1 1）继续研究研究酶的的结构和功能；构和功能；（2 2）继续从天然从天然环境中境中寻找能找能产生不同生不同酶组分的最佳菌种；分的最佳菌种；（3 3）用基因工程技）用基因工程技术来构建理想的工程菌；（来构建理想的工程菌；（4 4）研究）研究酶解解纤维素的工素的工艺条件。条件。第18页，本讲稿共25页3.3.43.3.4脂肪脂肪酶自然界中有自然界中有许多微生物可以通多微生物可以通过它它们分泌的脂肪分泌的脂肪酶来利用油脂作来利用油脂作为生生长所需的碳源物所需的碳源物质。由于微生物脂肪由于
20、微生物脂肪酶的种的种类很多，具有比很多，具有比动植物更广泛的植物更广泛的pHpH适适应性、性、温度范温度范围及及对底物的底物的专一性，又便于生一性，又便于生产，更容易，更容易获得高得高纯度制度制剂，因此其在研究和因此其在研究和应用上的用上的进展相当迅速。展相当迅速。用途：用途：药物作用，帮助消化，降低血脂及治物作用，帮助消化，降低血脂及治疗局部炎症等；生物能源等。局部炎症等；生物能源等。第19页，本讲稿共25页3.3.53.3.5青霉素青霉素酰化化酶 由于人类对抗生素的无节制的滥用，因细菌产生的抗药性已由于人类对抗生素的无节制的滥用，因细菌产生的抗药性已使天然青霉素的治疗效果明显下降。为了解决
21、细菌的抗药性问题，使天然青霉素的治疗效果明显下降。为了解决细菌的抗药性问题，人们利用青霉素酰化酶的作用来改变天然青霉素的侧链结构，使人们利用青霉素酰化酶的作用来改变天然青霉素的侧链结构，使其具有抵御抗药性微生物其具有抵御抗药性微生物-内酰胺酶攻击的能力。内酰胺酶攻击的能力。该酶广泛存在于细菌、放线菌、霉菌及酵母菌内。该酶广泛存在于细菌、放线菌、霉菌及酵母菌内。用途：用途：用于新青霉素的半合成；用于新青霉素的半合成；催化水解和合成除头孢霉素之外的头孢霉素衍生物。催化水解和合成除头孢霉素之外的头孢霉素衍生物。第20页，本讲稿共25页3.3.63.3.6半乳糖苷半乳糖苷酶3.3.73.3.7特殊的治
22、特殊的治疗用用酶1.1.透明透明质酸酸酶该酶除了可以从除了可以从动物体内物体内获得外，已有得外，已有报道用霉菌来道用霉菌来产生。其生。其应用范用范围包括：治包括：治疗关关节损伤、关、关节周周围炎症及膝外炎症及膝外伤等；治等；治疗传染染性肝炎及肝硬化；用于治性肝炎及肝硬化；用于治疗女性不孕症等。女性不孕症等。2.2.血血纤维蛋白溶蛋白溶酶3.L-3.L-天冬天冬酰胺胺酶4.4.右旋糖苷右旋糖苷酶第21页，本讲稿共25页3.3.83.3.8其他微生物其他微生物酶的的应用用1.1.食品加工食品加工业2.2.环境保境保护3.3.生物化工生物化工4.4.医医疗卫生生5.5.纺织业第22页，本讲稿共25页
23、3.4 3.4 未来展望未来展望极端环境微生物酶的开发极端环境微生物酶的开发3.4.1 3.4.1 简述简述 目前面对两个基本任务：目前面对两个基本任务：1.1.继续从天然的微生物资源中去筛选，开发新的酶产继续从天然的微生物资源中去筛选，开发新的酶产品和产酶菌种；品和产酶菌种；2.2.要积极利用基因工程技术来提高、改造新的或现有的酶产要积极利用基因工程技术来提高、改造新的或现有的酶产生菌的生产性能。生菌的生产性能。“极端环境微生物酶的研究极端环境微生物酶的研究”必将成为酶学研究和新酶资源开必将成为酶学研究和新酶资源开发的一个方向。发的一个方向。第23页，本讲稿共25页3.4.23.4.2极端极端环境微生物境微生物酶（一）极端（一）极端环境微生物境微生物酶的来源的来源1.1.嗜冷微生物嗜冷微生物2.2.嗜嗜盐微生物微生物3.3.嗜嗜热微生物微生物（二）极端（二）极端环境微生物境微生物酶的的获得得1.1.酶的的产生生2.2.酶的的纯化及化及酶性能的改善性能的改善第24页，本讲稿共25页作作业：1.1.简述微生物述微生物酶开开发的一般程序。的一般程序。2.2.简述微生物述微生物酶的的应用用现状。状。第25页，本讲稿共25页