《基本原理》PPT课件.ppt

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1、第二章第二章 植物组织培养基本原理植物组织培养基本原理植物组织培养植物组织培养第第 二二 章章第一节第一节 细胞全能性细胞全能性第二节第二节 器官发生器官发生第三节第三节 体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生第一节细胞全能性第一节细胞全能性一、细胞全能性概述一、细胞全能性概述植物体的每一个细胞都含有一个完整个植物体的每一个细胞都含有一个完整个体的全套基因，这些基因在适宜的外界体的全套基因，这些基因在适宜的外界条件下按照某种特定的程序先后表达，条件下按照某种特定的程序先后表达，最终分化形成一个完整的植株，最终分化形成一个完整的植株，称为细称为细胞全能性胞全能性（totipotency)totipoten

2、cy)细胞全能性的相对性细胞全能性的相对性不是所有基因型的所有细胞在任何条件不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的反应；下都具有良好的反应；细胞全能性细胞全能性 Totipotentiality植物细胞全能性植物细胞全能性 一个植物细胞所具一个植物细胞所具有的产生有的产生完整完整植物个体的植物个体的潜在能力潜在能力。克隆羊的诞生过程克隆羊的诞生过程1.从芬兰从芬兰多塞特母绵羊多塞特母绵羊的乳的乳 腺腺中取出中取出乳腺细胞乳腺细胞，将其放入，将其放入低浓度的营养培养液中，细低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为称之为供体细胞供体细胞；2.从一头从

3、一头苏格兰黑面母绵羊苏格兰黑面母绵羊的的卵巢中取出卵巢中取出未受精的卵细胞未受精的卵细胞，并立即将其并立即将其细胞核除去细胞核除去，留，留下一个无核的卵细胞，此细下一个无核的卵细胞，此细胞称之为胞称之为受体细胞受体细胞；3.利用电脉冲的方法，使供体利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞和受体细胞融合细胞融合，最后，最后形成了融合细胞，由于电脉形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；形成胚胎细胞；4.将胚胎细

4、胞转移到将胚胎细胞转移到另一只苏另一只苏格兰黑面母绵羊格兰黑面母绵羊的子宫内，的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成最后形成一只小绵羊一只小绵羊。植物细胞按照分裂能力分三类在细胞周期中运转的细胞，属在细胞周期中运转的细胞，属周期细胞周期细胞暂时脱离细胞周期的细胞，它们可在适当的刺激暂时脱离细胞周期的细胞，它们可在适当的刺激下重新进入细胞周期，进行增殖。属下重新进入细胞周期，进行增殖。属G0G0期细胞期细胞。不可逆地脱离了细胞周期，失去分裂能力，保持不可逆地脱离了细胞周期，失去分裂能力，保持生理机能的细胞，为生理机能的细胞，为终端化细胞终端化细胞.第一节细胞全能性

5、第一节细胞全能性第一节细胞全能性第一节细胞全能性 一个植物细胞向分生状态恢复的程度，取决于它一个植物细胞向分生状态恢复的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。在自然部位上所处的位置和生理状态。第一节细胞全能性第一节细胞全能性 细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的细胞全能性细胞全能性脱分化脱分化细胞分裂细胞分裂再分化再分化个体再生个体再生第一节细胞全能性第一节细胞全能性二、细胞脱分化二、细胞脱分化在一定的培养条件下，一个成熟细胞转变为在一定的培养条件下，一个成熟细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤的现象，分生状态并形成未分化的愈伤

6、的现象，称为称为脱分化（脱分化（dedifferentiation)dedifferentiation)细胞脱分化并非离体培养所特有，而是植物细胞脱分化并非离体培养所特有，而是植物界普遍存在的现象。界普遍存在的现象。离体外植体离体外植体细胞细胞实现全能性，首先经历脱分实现全能性，首先经历脱分化使其恢复分生状态，然后进行再分化。化使其恢复分生状态，然后进行再分化。脱分化是分化的逆过程。脱分化是分化的逆过程。Tissue;organdedifferentiation？实现细胞全能性的方法有：实现细胞全能性的方法有：1 1、以植物体细胞为材料，可以获得二倍体植株、以植物体细胞为材料，可以获得二倍体植

7、株可以开花国、结果。可以开花国、结果。2 2、以植物性细胞如大小孢子体为材料，可以、以植物性细胞如大小孢子体为材料，可以获得单倍体或其它倍性的植株。获得单倍体或其它倍性的植株。3 3、以植物单细胞的原生质体或融合的原生质体、以植物单细胞的原生质体或融合的原生质体为材料，可以获得不同倍性的植株，甚至自然中为材料，可以获得不同倍性的植株，甚至自然中不存在的远缘杂种。不存在的远缘杂种。第一节细胞全能性第一节细胞全能性细胞脱分化与愈伤组织形成细胞脱分化与愈伤组织形成细胞脱分化是细胞生理状态的改变，脱细胞脱分化是细胞生理状态的改变，脱分化细胞经过连续的分化细胞经过连续的有丝分裂有丝分裂，形成愈，形成愈伤

8、组织。伤组织。切取切取形成层形成层无菌无菌接种接种诱导愈伤组织诱导愈伤组织的形成的形成试管苗的形成试管苗的形成培养室培养室移栽移栽脱分化脱分化再分化再分化第一节细胞全能性第一节细胞全能性愈伤组织形成的过程愈伤组织形成的过程从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：为三个时期：启动期启动期 （诱导期）、（诱导期）、分裂分裂期和形成期期和形成期。三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明显的差别。及细胞的平均大小都有明显的差别。为什么要进行愈伤组织培养为什么要进行愈伤组织培养无性繁殖并大大量扩繁被培养的植物无性繁

9、殖并大大量扩繁被培养的植物为细胞悬浮培养盒次生代谢产物生产与利用、原生质为细胞悬浮培养盒次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供易于操作的起始材料体培养和细胞融合提供易于操作的起始材料为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础的体系和基础为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操作对为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操作对象象为种质资源的保存提供新的形式为种质资源的保存提供新的形式为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系的转变创造适宜的材料

10、和体系1.愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导外植体的类型与生理状态：选择细胞分化水平较低或含低外植体的类型与生理状态：选择细胞分化水平较低或含低分化细胞的器官或组织；选择幼嫩、分生能力强、不含发分化细胞的器官或组织；选择幼嫩、分生能力强、不含发育抑制物或其含量较低的器官或组织作为诱导愈伤组织的育抑制物或其含量较低的器官或组织作为诱导愈伤组织的外植体。外植体。外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。适于悬浮培养适于悬浮培养 适于再生植株适于再生植株愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导培养基的选择：培养基的类型；激素含量等培养基的选择：培养基的类型；激素含量等其他培养条件：温度（其他培养条件：温度

11、（25-28或或28-30）、光照（光照）、光照（光照周期周期12-16h；光照强度；光照强度1500-2000 lx）愈伤组织的类型：愈伤组织的类型：颜色：奶黄色；白色有光泽；淡绿色；黄色或褐色颜色：奶黄色；白色有光泽；淡绿色；黄色或褐色质地：质地：是否具有胚性：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织是否具有胚性：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导愈伤组织形成特点愈伤组织形成特点第一节细胞全能性第一节细胞全能性Stage 1.Stage 1.诱导期（诱导期（InductionInduction）:诱诱导导期期是是细细胞胞准准备备分分裂裂的的时时期期，是愈伤组织形成起点。是愈伤组织

12、形成起点。特特点点：在在诱诱导导期期，代代谢谢活活化化了了，细细胞胞内内蛋蛋白白质质和和RNARNA含含量量迅迅速速增增加加，细细胞胞核核体体积积明明显显增增大大。细细胞胞内内的的合合成成代代谢谢迅迅速速进进行行，但但是是细细胞胞的的大大小小仍仍然和外植体时一样，没有多大改变。然和外植体时一样，没有多大改变。受激素作用后，分裂前细胞的主要变化有受激素作用后，分裂前细胞的主要变化有:一、呼吸作用加强，消耗氧气的量明显增加。一、呼吸作用加强，消耗氧气的量明显增加。二、多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前二、多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前 RNA RNA的含量增加的含量增加300300三、蛋白质合

13、成加快，分裂前细胞内蛋白质三、蛋白质合成加快，分裂前细胞内蛋白质 的总量增加的总量增加200200四、各种与分裂有关的酶活性大加强。四、各种与分裂有关的酶活性大加强。Stage 2.Stage 2.分裂期（分裂期（Cell divisionCell division）外植体中已分化的活细胞在外源激素的外植体中已分化的活细胞在外源激素的作用下，外植体作用下，外植体外层细胞外层细胞出现了分裂，由于出现了分裂，由于外层细胞的迅速分裂使得这些细胞的体积缩小，外层细胞的迅速分裂使得这些细胞的体积缩小，逐渐回复到分生组织状态，因此也称为逐渐回复到分生组织状态，因此也称为回复变回复变化化。在回复变化时，细胞

14、通过脱分化的启动期。在回复变化时，细胞通过脱分化的启动期而进入分裂，并开始形成愈伤组织。而进入分裂，并开始形成愈伤组织。特征特征：是：是外层细胞进行分裂外层细胞进行分裂，而，而中间的细胞不中间的细胞不分裂分裂。另外细胞数目增加，体积变小；细胞核。另外细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大，和核仁增到最大，RNARNA含量升高等。含量升高等。第一节细胞全能性第一节细胞全能性第一节细胞全能性第一节细胞全能性Stage 3.Stage 3.形成期形成期（DifferentiationDifferentiation）特点特点：外植体细胞经过诱导期和分裂：外植体细胞经过诱导期和分裂期形成了无序结构

15、的愈伤组织。进入期形成了无序结构的愈伤组织。进入形成期后，表层细胞分裂逐渐停止，形成期后，表层细胞分裂逐渐停止，内部深处细胞开始分裂，组织内部形内部深处细胞开始分裂，组织内部形成瘤状的成瘤状的拟分生组织拟分生组织。形成愈伤组织。形成愈伤组织形成中心或者进一步分化成为维管组形成中心或者进一步分化成为维管组织。织。愈伤组织的特征愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。颜色浅而透明。第一节细胞全能性第一节细胞全能性第一节细胞全能性第一节细胞全能性愈伤组织状态愈伤组织状态优良的愈伤组织：优良的愈伤组织：1.1.具有旺盛的自我增殖能力

16、；具有旺盛的自我增殖能力；2.2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体；生质体；3.3.高度的胚性或再分化能力；高度的胚性或再分化能力；4.4.可以长期继代保存可以长期继代保存。愈伤组织状态第一节细胞全能性第一节细胞全能性愈伤组织状态愈伤组织状态向日葵下胚轴的愈向日葵下胚轴的愈伤及分化芽伤及分化芽 水稻成熟胚的愈伤水稻成熟胚的愈伤玉米幼胚的愈伤玉米幼胚的愈伤第一节细胞全能性第一节细胞全能性类型类型：结构致密，生长较慢，容易分化成苗，：结构致密，生长较慢，容易分化成苗，也称也称保守分裂型保守分裂型，呈乳白色或绿色，结构致密，呈乳白色或绿色，结构致密，复杂多样

17、复杂多样,生长缓慢，不易长时间保持胚性。愈伤生长缓慢，不易长时间保持胚性。愈伤组织经过多次继代才获得胚胎发生组织经过多次继代才获得胚胎发生-间接胚胎发间接胚胎发生生。再生频率低、周期长易分化畸形苗。再生频率低、周期长易分化畸形苗。禾本科的禾本科的愈伤组织类型：愈伤组织类型：愈伤组织状态优良的愈伤组织：1.具有旺盛的自我增殖能力；2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体；3.高度的胚性或再分化能力；4.可以长期继代保存。第一节细胞全能性第一节细胞全能性类型类型：结构松软，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很：结构松软，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快，也称快，也称亢进分裂型亢进分裂型；淡黄色或黄色，结构松

18、散呈；淡黄色或黄色，结构松散呈颗粒状，生长较快，能够长时间保持胚性。在诱导颗粒状，生长较快，能够长时间保持胚性。在诱导培养基直接产生胚性愈伤组织和胚状体培养基直接产生胚性愈伤组织和胚状体-直接胚胎直接胚胎发生发生禾本科的愈伤组织类型：愈伤组织状态优良的愈伤组织：1.具有旺盛的自我增殖能力；2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体；3.高度的胚性或再分化能力；4.可以长期继代保存。第一节细胞全能性第一节细胞全能性禾本科的禾本科的愈伤组织类型：愈伤组织类型：淡黄色或黄色淡黄色或黄色型胚性愈伤组织扫描电镜下型胚性愈伤组织扫描电镜下观察圆球状胚状体。观察圆球状胚状体。愈伤组织状态第一节细胞全能性第

19、一节细胞全能性禾本科的禾本科的愈伤组织类型：愈伤组织类型：II II型愈伤组织转入分化培养基形成绿芽点，扫描电型愈伤组织转入分化培养基形成绿芽点，扫描电镜观察：胚状体一端向上伸出胚芽鞘，一端向下镜观察：胚状体一端向上伸出胚芽鞘，一端向下伸出根，通过体细胞胚胎发生可形成完整植株。伸出根，通过体细胞胚胎发生可形成完整植株。愈伤组织状态第一节细胞全能性第一节细胞全能性类型类型：结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡，：结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡，称为称为衰败型衰败型。白色或灰色透明，软散无结构。白色或灰色透明，软散无结构继代易褐化而死亡。电镜观察，细胞排列无继代易褐化而死亡。电镜观察，细胞排列无序，细胞结构

20、不明显，无细胞团或球形细胞。序，细胞结构不明显，无细胞团或球形细胞。禾本科的禾本科的愈伤组织类型：愈伤组织类型：愈伤组织状态优良的愈伤组织：1.具有旺盛的自我增殖能力；2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体；3.高度的胚性或再分化能力；4.可以长期继代保存。第一节细胞全能性第一节细胞全能性影响细胞脱分化因素1.1.外植体本身损伤外植体本身损伤2.2.生长调节剂生长调节剂3.3.光照光照4.4.细胞位置细胞位置5.5.外植体的生理状态外植体的生理状态6.6.植物种类差异植物种类差异7.7.基因型基因型外植体褐变外植体褐变 多酚氧化酶是植物体内普遍存在的一类末端多酚氧化酶是植物体内普遍存在的

21、一类末端氧化酶，它催化酚类化合物形成醌和水，醌氧化酶，它催化酚类化合物形成醌和水，醌再经非酶促聚合形成深色物质，对植物体材再经非酶促聚合形成深色物质，对植物体材料产生毒害作用。料产生毒害作用。褐变的影响因素：褐变的影响因素：1 1、植物种类及基因型。、植物种类及基因型。2 2、外植体的部位及生理状态。外植体的部位及生理状态。3 3、外植体的受伤、外植体的受伤程度。程度。4 4培养基的成分和培养条件。培养基的成分和培养条件。5 5、培养时间、培养时间过长过长防止褐变的方法：防止褐变的方法：1 1、选择适宜的外植体、选择适宜的外植体2 2、对外植体进行处理，如先进行低温处理，、对外植体进行处理，如

22、先进行低温处理，再放入只含糖的琼脂培养基中，使酚类物质再放入只含糖的琼脂培养基中，使酚类物质渗入到培养基中。渗入到培养基中。3 3、选择适宜的培养基和培养条件、选择适宜的培养基和培养条件4 4、添加褐变抑制剂和吸附剂。如维生素、添加褐变抑制剂和吸附剂。如维生素C C等等5 5、连续转移。减轻酚类化合物的毒害。、连续转移。减轻酚类化合物的毒害。玻璃化现象：玻璃化现象：在进行植物组织培养时，经常会出现在进行植物组织培养时，经常会出现试管苗生长异常，叶等出现透明或半透明的水浸状试管苗生长异常，叶等出现透明或半透明的水浸状植物矮小肿胀，失绿等现象称为植物矮小肿胀，失绿等现象称为玻璃化现象玻璃化现象。原

23、因。原因复杂没有定论。复杂没有定论。防止玻璃化措施：防止玻璃化措施：1 1、增加琼脂浓度。、增加琼脂浓度。2 2、提高糖的含量或加入渗透剂，降低培养基中渗透势，、提高糖的含量或加入渗透剂，降低培养基中渗透势，减少植物材料可获得的水分。减少植物材料可获得的水分。3 3、降低培养基中细胞分裂素的含量、降低培养基中细胞分裂素的含量4 4、增加光照、控制温度、改善通风换气条件。、增加光照、控制温度、改善通风换气条件。愈伤组织状态优良的愈伤组织：1.具有旺盛的自我增殖能力；2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体；3.高度的胚性或再分化能力；4.可以长期继代保存。第一节细胞全能性第一节细胞全能性三、

24、细三、细胞再分化胞再分化 含义含义：离体培养的植物细胞和组织可以由：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株，这个过程称为完整植株，这个过程称为再分化再分化。1.1.细胞水平的再分化细胞水平的再分化2.2.组织水平的再分化组织水平的再分化3.3.器官水平的再分化（又称器官发生）器官水平的再分化（又称器官发生）愈伤组织状态优良的愈伤组织：1.具有旺盛的自我增殖能力；2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体；3.高度的胚性或再分化能力；4.可以长期继代保

25、存。第一节细胞全能性第一节细胞全能性影响细影响细胞再分化因素胞再分化因素关键：维管组织的分化（关键：维管组织的分化（生长素、生长素、蔗糖浓度、细胞分裂素和赤霉素、蔗糖浓度、细胞分裂素和赤霉素、物理因子物理因子）不同种类植物的再生能力差异；不同种类植物的再生能力差异；再生条件没有完全掌握；再生条件没有完全掌握；影响因子与脱分化因子基本一致。影响因子与脱分化因子基本一致。愈伤组织状态优良的愈伤组织：1.具有旺盛的自我增殖能力；2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体；3.高度的胚性或再分化能力；4.可以长期继代保存。第一节细胞全能性第一节细胞全能性再分化的两种方式再分化的两种方式体细胞胚胎体细

26、胞胚胎发生：双极性发生：双极性结构，与母体愈伤组织或结构，与母体愈伤组织或外植体无维管束连接。外植体无维管束连接。器官发生器官发生 （也称（也称茎芽茎芽分分化）：单极性结构，里面化）：单极性结构，里面长出原形成层束，与原先长出原形成层束，与原先存在于愈伤组织或外植体存在于愈伤组织或外植体中的维管组织连接在一起中的维管组织连接在一起愈伤组织状态优良的愈伤组织：1.具有旺盛的自我增殖能力；2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体；3.高度的胚性或再分化能力；4.可以长期继代保存。第二节第二节 器官发生器官发生器官发生器官发生：在离体的培养条件下，植：在离体的培养条件下，植物的组织或细胞团（愈伤

27、组织）分化物的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。形成不定根、不定芽等器官的过程。第二节第二节 器官发生器官发生From rootFrom embryo cultureCallus arising from leaf tissue第二节 器官发生一、器官发生方式（一、器官发生方式（3 3种）种）1.1.先分化芽，再分化根；先分化芽，再分化根；2.2.先分化根，再分化芽；先分化根，再分化芽；3.3.在愈伤组织块的不同部位上分化出根和芽在愈伤组织块的不同部位上分化出根和芽第二节 器官发生（1 1）先分化芽，再分化根）先分化芽，再分化根 先分化芽，待芽伸长后在其幼先分化芽，待

28、芽伸长后在其幼茎基部长根，形成完整的小植株。茎基部长根，形成完整的小植株。这种方式在木本植物培养中比较普这种方式在木本植物培养中比较普遍，芽和根的诱导要分两步完成。遍，芽和根的诱导要分两步完成。第二节 器官发生（2 2）先分化根，再分化芽）先分化根，再分化芽 先分化根，在根上产生不定芽而先分化根，在根上产生不定芽而形成完整植株。形成完整植株。百合根尖愈伤组织诱导百合根尖愈伤组织诱导第二节 器官发生（3 3）同时诱导根、芽）同时诱导根、芽 在愈伤组织在愈伤组织的不同部位分别形的不同部位分别形成芽和根，然后二成芽和根，然后二者的维管组织互相者的维管组织互相连接，成为具有统连接，成为具有统一的轴状结

29、构的小一的轴状结构的小植株。植株。风风信信子子形形成成的的芽芽和和根根第二节 器官发生二、器官发生的解剖学二、器官发生的解剖学器官发生型器官发生型-外植体外植体两种途径两种途径器官型器官型-外植体本身存在器官原基（茎尖外植体本身存在器官原基（茎尖、根尖）、根尖）形成愈伤组织形成愈伤组织器官原基及器官形成器官原基及器官形成第二节 器官发生三、影响器官分化的因素三、影响器官分化的因素 培养基成分培养基成分：矿质元素矿质元素 有机成分有机成分 激素组合激素组合 环境条件：环境条件：光照光照 温度温度 湿度湿度植株材料：植株材料：品种基因型的差异品种基因型的差异 材料的生理状况材料的生理状况 第二节

30、器官发生1.培养基成分培养基成分矿质元素及其他有机成分矿质元素及其他有机成分 矿质元素促进器官发生；矿质元素促进器官发生；糖维持培养基的渗透压，糖维持培养基的渗透压，提供碳源和能源提供碳源和能源第二节 器官发生植物激素的应用规律植物激素的应用规律离体培养时离体培养时,在生长素存在的条件下在生长素存在的条件下,细胞分裂素的作用有加细胞分裂素的作用有加强的趋势强的趋势,不过两者在使用上有一定的顺序关系不过两者在使用上有一定的顺序关系,由于处理顺由于处理顺序不同序不同,则会影响培养物则会影响培养物,器官发生的方向。规律如下：器官发生的方向。规律如下：1 1）先生长素，后细胞分裂素）先生长素，后细胞分

31、裂素，有利于细胞分裂，但细胞不，有利于细胞分裂，但细胞不分化。容易产生多倍体细胞。分化。容易产生多倍体细胞。2 2）先细胞分裂素，后生长素）先细胞分裂素，后生长素，细胞分裂也分化。，细胞分裂也分化。3 3）生长素和细胞分裂素同时处理）生长素和细胞分裂素同时处理，分化频率提高。但两者，分化频率提高。但两者同时存在的用量比值可以改变形态建成方向。同时存在的用量比值可以改变形态建成方向。生长素生长素/细胞分裂素：细胞分裂素：比值高时，有利于根分化；比值高时，有利于根分化；比值低时，有利于芽分化，抑制根形成；比值低时，有利于芽分化，抑制根形成；比值适中时，促进愈伤组织生长。比值适中时，促进愈伤组织生长

32、。第二节 器官发生激素控制器官分化的模式图激素控制器官分化的模式图外植体外植体脱分化脱分化形成愈伤组织形成愈伤组织再分化再分化分化成芽分化成芽分化成根分化成根完整植株完整植株高生长激素（高生长激素（2,4-D）高细胞分裂素高细胞分裂素/生长素生长素低细胞分裂素低细胞分裂素/生长素生长素第二节 器官发生植物激素的应用浓度植物激素的应用浓度离体培养条件下，生长素应用的浓度范围为。离体培养条件下，生长素应用的浓度范围为。在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组织，在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组织，以以2,4-D2,4-D最为有效，使用范围在。一般规律是：细最为有效，使用范围在。一般规律

33、是：细胞脱分化需要高浓度的胞脱分化需要高浓度的2,4-D2,4-D，当胚性细胞形成转，当胚性细胞形成转入再分化时，则需较低的入再分化时，则需较低的2,4-D2,4-D浓度。浓度。细胞分裂素在离体培养条件下，既可诱导细细胞分裂素在离体培养条件下，既可诱导细胞分裂，又可调节细胞分化。使用浓度范围为。胞分裂，又可调节细胞分化。使用浓度范围为。第二节 器官发生培养基的渗透压培养基的渗透压 离体培养中培养基渗透压是影响植物细胞离体培养中培养基渗透压是影响植物细胞脱分化、再分化的重要因素。脱分化、再分化的重要因素。培养基渗透压是由培养基中各种物质的总培养基渗透压是由培养基中各种物质的总浓度决定的。浓度决定

34、的。培养细胞是通过细胞渗透来吸取营养的，培养细胞是通过细胞渗透来吸取营养的，当培养材料和培养基之间处于等渗时，或培养当培养材料和培养基之间处于等渗时，或培养材料的渗透压略低于培养基渗透压时，培养材材料的渗透压略低于培养基渗透压时，培养材料才可能汲取养分和水分。料才可能汲取养分和水分。第二节 器官发生渗透压调节物质及其应用渗透压调节物质及其应用 糖对渗透压起决定作用，其次甘露醇、盐类也可影响渗透压。不同植物类细胞脱分化和再分化所需糖不同植物类细胞脱分化和再分化所需糖浓度不同，多数植物种适宜糖浓度为浓度不同，多数植物种适宜糖浓度为2-6%2-6%；培养目的不同要求糖浓度不同：诱导器培养目的不同要求

35、糖浓度不同：诱导器官脱分化形成愈伤组织为官脱分化形成愈伤组织为3%-6%3%-6%，愈伤组织芽，愈伤组织芽分化为分化为3%-6%3%-6%，根分化为，根分化为2%-3%2%-3%；培养方式不同对糖浓度的要求不同。培养方式不同对糖浓度的要求不同。第二节 器官发生培养基的酸碱度培养基的酸碱度调节培养基酸碱度的意义调节培养基酸碱度的意义 离体条件下，培养基酸碱度与植物细胞脱离体条件下，培养基酸碱度与植物细胞脱分化、再分化和器官发生有着密切的关系。植分化、再分化和器官发生有着密切的关系。植物组织和细胞在离体培养条件下，失去自行调物组织和细胞在离体培养条件下，失去自行调节的能力。节的能力。调节方法如下：

36、调节方法如下：pH pH测定计测定、测定计测定、pHpH值试纸比色测定，用值试纸比色测定，用1mol/LHCl1mol/LHCl或或KOHKOH进行调节。进行调节。第二节 器官发生2.环境条件环境条件光照光照 包括光强、光质和光周期。包括光强、光质和光周期。光强光强-1000-1500lx-1000-1500lx，光周期，光周期12-12-16h16h，近紫外和蓝紫光促进芽的发生，红，近紫外和蓝紫光促进芽的发生，红光促进生根。光促进生根。温度温度 25 25适于器官发生，应考虑原产适于器官发生，应考虑原产地、昼夜温差、低温预处理地、昼夜温差、低温预处理湿度湿度 70-80%70-80%第二节

37、器官发生3.植物材料植物材料品种基因型的差异品种基因型的差异材料生理状况材料生理状况 生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养力大的组织和器官的细胞更有利于培养第第 三三 节节第第三三节节 体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生体细胞胚（体细胞胚（somatic embryosomatic embryo）又叫胚状体，是指离体培）又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。胚胚的的发发育育图图一、体细胞胚的概念一、体细胞胚的概念一、体细胞胚的概念一、体细胞胚的概念(A)伸长期

38、合子；(B)合子经过第一次分裂,产生1 个顶细胞(绿色)和一个基细胞(粉红色)；(C)四分体胚:顶细胞经历2 次纵向分裂，产生含有4 个细胞的胚体和2 个细胞的胚柄；(D)16 细胞球形胚:8 细胞胚的所有细胞经过1 次平周分裂,产生包含8 个细胞的表皮原和8 个细胞的内部组织；(E)早期心形胚；(F)心形胚:子叶和胚根原基已经出现；(G)成熟胚胎。1:顶细胞;2:基细胞;3:胚根原细胞,形成未来的ROC 和根冠中央区;RM:根尖生长点;SM:茎尖生长点 双子叶植物的胚胎发育过程双子叶植物的胚胎发育过程第第三三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生原胚原胚球形胚心形胚鱼雷形胚子叶形胚或马蹄形胚第第三

39、三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生一、概念与特点一、概念与特点 离体产物离体产物起源于非合子胚起源于非合子胚经过胚胎发育过程经过胚胎发育过程1 1 概念概念离体培养下没有经过受离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞是体细胞还是生殖细胞），胞），统称为体细胞胚统称为体细胞胚或或胚状体胚状体。花粉培养单细胞悬浮培养原生质体培养组织器官培养体细胞胚花粉胚非合子胚非合子细胞合子胚无融合生殖胚*大量研究表明，大多数植物组织培养，单细胞悬浮大量研究表明，大多数植物组织培养，单细胞悬浮

40、培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生（胎发生或花粉胚胎发生（pollen embryogenesis）*前者为前者为二倍体的体细胞产生的胚状结构二倍体的体细胞产生的胚状结构*后者是后者是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，通常称花粉胚（体细胞胚，通常称花粉胚（pollen embryos），可发），可发育成单倍体植株。育成单倍体植株。体细胞胚的产生体细胞胚的产生体细胞胚的产生体细胞胚的产生*体细胞胚或花粉胚都是指在植物组织培养中起源体细胞胚或花粉胚都是指在植物组织培养中

41、起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构形成的胚状结构，包括以下几点含义：，包括以下几点含义：1 1、体细胞胚体细胞胚是组织培养的产物，区别于无融合生是组织培养的产物，区别于无融合生殖的胚，只限于在组织培养范围使用；殖的胚，只限于在组织培养范围使用；2 2、体细胞胚体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合子胚；起源于非合子细胞，区别于合子胚；3 3、体体细胞胚细胞胚的形成经历胚胎发育过程，区别于组的形成经历胚胎发育过程，区别于组织培养的器官发生中芽与根的分化。织培养的器官发生中芽与根的分化。植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显

42、植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显的特点：的特点：1 1、具有两极性、具有两极性 2 2、存在生理隔离、存在生理隔离 3 3、遗传性相对稳定、遗传性相对稳定 4 4、重演受精卵形态发生的特性、重演受精卵形态发生的特性 二、二、体细胞胚胎发生的方式体细胞胚胎发生的方式 *植物组织培养过程中植物体细胞胚胎途径可归纳为植物组织培养过程中植物体细胞胚胎途径可归纳为两类：直接途径和间接途径。两类：直接途径和间接途径。*直接途径是直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育直接途径是直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成而成 *间接方式是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从间接方式是体胚从愈伤组织或悬浮细胞

43、、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成，如香雪兰已形成的体胚的一组细胞中发育而成，如香雪兰（Freesia refractaFreesia refracta）花序外植体经直接体细胞胚胎）花序外植体经直接体细胞胚胎发生途径形成再生植株。发生途径形成再生植株。第第三三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生体细胞胚发生的途径及类型体细胞胚发生的途径及类型 1 1 途径途径 直接途径：从外植体某个部位直接诱直接途径：从外植体某个部位直接诱导分化出体细胞胚导分化出体细胞胚 间接途径：首先形成愈伤组织，其后间接途径：首先形成愈伤组织，其后在愈伤组织表面分化形成体细胞胚。在愈伤组织表面分化形成体细胞胚。第第三

44、三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生体细胞胚直接发生体细胞胚直接发生第第三三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生体细胞胚间接发生体细胞胚间接发生第第三三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生体细胞胚发育的细胞学特点体细胞胚发育的细胞学特点1 茎尖培养诱导形成胚性愈伤组织 MS培养基附加2.0mg/L 2,4-D2 胚性愈伤组织悬浮培养增殖 MS培养基附加2.0mg/L 2,4-D3 由细胞集合体形成体细胞胚 MS培养基附加2.0mg/L 2,4-D 4 体细胞胚萌发并形成小植株 MS培养基附加 图 甘薯品种栗子香胚性愈伤组织诱导体细胞胚和再生小植株 胚性愈胚性愈伤组织伤组织非胚性愈非胚性愈伤组织伤组织颜颜

45、色色淡黄淡黄白色白色表面表面光滑光滑粗糙粗糙质质地地坚坚硬但易碎硬但易碎松散，水松散，水渍渍状状胚性胚性细细胞的多少胞的多少大量大量极少或无极少或无细细胞形胞形态态小，小，圆圆球形球形管状或不管状或不规则规则形形细细胞胞质质浓浓厚，染色深厚，染色深稀薄，染色浅稀薄，染色浅内含物内含物多多少少细细胞核及核仁胞核及核仁核明核明显显，大，核仁，大，核仁多多核小，核仁少，或核小，核仁少，或无核无核胚性细胞团特征：成簇、成团，体积小，细胞质致密第第三三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生体细胞胚与器官发生形成个体的途径相比体细胞胚与器官发生形成个体的途径相比：体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点。体细胞胚发

46、育再生植株有两个明显的特点。一是体细胞胚具有一是体细胞胚具有双极性双极性（doublepolaritydoublepolarity），），二是遗传的稳定性：胚状体起源于单细胞或细胞二是遗传的稳定性：胚状体起源于单细胞或细胞团，在产生和发育过程中一旦形成即通过了分化团，在产生和发育过程中一旦形成即通过了分化过程，结构即稳定，细胞变异的频率低，成苗率过程，结构即稳定，细胞变异的频率低，成苗率高，高，遗传稳定性好。遗传稳定性好。*在同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体上可以观察到多个不同发育时期的体细胞胚，从单个原始细胞到多细胞的原胚、球形胚、鱼雷胚直至具子叶的胚状体，这是由体细胞胚发生和分裂的不同步

47、所致。香蕉心形体细胞胚 可可心形胚A和球形胚B A AB B1 1 体细胞胚的单细胞起源体细胞胚的单细胞起源野胡萝卜的胚状体 A.心形期胚状体 B.成熟胚状体 C.早心形期胚状体 D.两个成熟胚状体共一个胚柄 a)胚性细胞第一次分裂；b-d)原胚第一次细胞分裂，鳄梨树形胚柄细胞仍保持单个细胞；e)胚柄细胞开始增殖；f-k)原胚和胚柄发育的不同时期；l)球形体细胞胚。(ep)=原胚；(s)=胚柄图 仙人掌科体细胞胚胎早期发育（由单细胞形成球形胚时期）a 胚性叶片愈伤组织；b 球形细胞；c 伸长细胞；d 两个细胞时期；e 四个细胞时期；f 原胚；g 球形胚；h 心形胚；i 早期鱼雷胚；j 成熟鱼雷

48、胚；k 不同时期的体细胞胚；l 体细胞胚的萌发；m 再生小植株。图 木豆幼苗叶片愈伤组织悬浮培养体细胞胚发育过程 第第三三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生第第三三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生体细胞胚与合子胚的比较体细胞胚与合子胚的比较合子胚在发育初期具有明显的合子胚在发育初期具有明显的胚柄胚柄，而体细胞胚一，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。特别是那般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。特别是那些发育初期类似于动物胚胎发育途径的体细胞胚，些发育初期类似于动物胚胎发育途径的体细胞胚，这一点更为明显。这一点更为明显。合子胚的合子胚的子叶子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，是相当规

49、范的，可以作为分类的依据，而体细胞胚的子叶常不规范，有时具有两片以上的而体细胞胚的子叶常不规范，有时具有两片以上的子叶。子叶。与相同植物比较，体细胞胚的与相同植物比较，体细胞胚的体积体积明显小于合子胚。明显小于合子胚。体细胞胚没有体细胞胚没有休眠休眠而直接形成植株。合子胚在胚胎而直接形成植株。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期以后，经过一系列的物质积累发育完全进入子叶期以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。和脱水就进入休眠。第第三三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生体细胞胚胎结构特点体细胞胚胎结构特点第第三三节节体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生三、影响体细胞胚胎发生的因素三、影响体细胞胚胎发生的因

50、素植物种类和基因型植物种类和基因型 培养材料的生理状态培养材料的生理状态培养基培养基培养条件培养条件:低温低温影响体细胞胚发生的因素 1、基因型与体细胞胚发生 基因型是影响体细胞胚发生的重要因素，体细胞胚的诱导率和每个胚性外植体上体细胞胚的发生率因基因型而异。（a）不同基因型体细胞胚诱导率；（b）不同基因型每个胚性外植体上体细胞胚的数目 图6.7 在相同培养基上Feijoa sellowiana Berg不同基因型体细胞胚诱导（引自Miguel等，2001）2、植物激素与体细胞胚发生*离体植物细胞在开始往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力，但是在大多数情况下，这些细胞的分裂和分化以及形态建成过