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1、产脂肪酶菌株的筛选第1页，本讲稿共12页实验目的 以橄榄油作为唯一碳源筛选出能产生出脂肪酶的菌株。橄榄油乳化法是测定脂肪酶活性的常用方法，其测定的原理是天然油脂被水解产生的游离脂肪酸可以被氢氧化钠中和。橄榄油乳化：聚丙烯醇3:1橄榄油乳化，水包油型，然后装在合适的瓶子里。第2页，本讲稿共12页实验原理：脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，产脂肪酶的微生物广泛的分布，主要以各类真菌为主；在富含油脂的地方进行采样，利用稀释平板分离法筛选产脂肪酶菌株，再以乳化橄榄油为底物。脂肪酶作用于橄榄油乳化液，催化酯键水解，生成脂肪酸，用标准氢氧化钠滴定脂肪酸，利用酚酞滴定终点，记录消耗的氢氧化钠体积，根据氢氧化钠的用
2、量来计算脂肪酶的活力。第3页，本讲稿共12页土壤采集：n在土门菜市场油污重地进行土壤采样。材料：n烧杯、玻璃棒、锥形瓶、试管、平板、接种环、制备乳化状态的针筒等。第4页，本讲稿共12页富集培养基配置：n硫酸铵0.1%磷酸氢二钾0.1%七水硫酸镁 0.05%七水硫酸亚铁0.001%酵母膏0.5%橄榄油乳化液12%氯化钠l%PH自然，115灭菌30min第5页，本讲稿共12页选择培养基平板：n乳化橄榄油 12%蛋白胨 1%硫酸铵0.2%磷酸氢二钾0.1%磷酸二氢钾0.3%七水硫酸亚铁0.1%维多利亚蓝0.004%琼脂1.5%PH=8.0灭菌11530min复筛培养基平板：n乳化橄榄油12%蛋白胨1
3、%硫酸铵0.2%磷酸氢二钾0.1%磷酸二氢钾0.3%七水硫酸亚铁0.1%琼脂1.5%PH=8 115灭菌30min第6页，本讲稿共12页实验方法：n1、取土样2g悬于20ml无菌水中，震荡，在100ml培养基中加入5ml的悬液，30 180r/m 培养3d。n2、取富集液稀释分别涂布于选择培养基平板上，经培养观察菌落周围的蓝色圈，然后挑取该菌落于富集培养基斜面上。30培养箱3dn3、将初筛得到的菌株在复筛培养基平板划线，然后放于30培养箱中3dn4、挑取单菌落，镜检并纯化，得到纯菌株保存n5、活力测定：U=(V-V.)/t50nn6、U=酶活（微摩尔/min）V=样品耗碱量（ml),V.=空白
4、耗碱量（ml),50=1ml0.05mol/l氢氧化钠的微摩尔数，t=反应时间（min),n=稀释倍数第7页，本讲稿共12页脂肪酶的活力的测定：n测定方法很多:酸碱滴定法，电位滴定法，浊度测定法，甘油测定法，色谱分析法等。n常用的检测手段为酸碱滴定，在酸碱滴定的方法中，有直接进行滴定的，也有先用疏水有机溶剂抽提出脂肪酸，再进行滴定的。第8页，本讲稿共12页活性测定选择时注意哦！n由于反应体系中存在缓冲液的缓冲作用，因此直接滴定法的合理性常令人怀疑，更容易给科研人员造成困惑，而且直接滴定法的稳定性一般都不十分理想。n根据脂肪酸和铜离子形成铜皂的原理利用分光光度法(715nm附近)进行脂肪酶活力的
5、检测，但是由于实验中使用大量苯进行铜皂的萃取，容易造成污染和对人体造成伤害，因此使用该方法的人少。n三丁酸甘油醋和三油酸甘油酷作为底物的时候，脂肪酶活力检测的结果比较稳定，但是由于三丁酸甘油醋和三油酸甘油酷价格比较昂贵，因此使用的人很少。第9页，本讲稿共12页n辛酸对硝基苯酚酷自水解的速度比较快，因此检测脂肪酶活力的时候，误差比较大;而乙酸对硝基苯酚醋水解的速度比较缓慢，因此实验误差相对较小，但是辛酸对硝基苯酚醋和乙酸对硝基苯酚醋都不是脂肪酶的天然底物，一般认为不适合作为脂肪酶活力检测的底物，尤其用乙酸对硝基 苯酚酷作为底物，其检测的活力作为醋酶活力似乎更合理一些。n本实验筛选得到的野生菌株产胞外脂肪酶活性较小，采用将传统的直接酸碱滴定法加以改进的方法来检测脂肪酶活性。第10页，本讲稿共12页应用：n中国食品质量报脂肪酶是酶制剂中的一员，在酒类酿造、蔬菜加工、面包生产、乳品生产、油脂加工等中应用广泛，是优良的食品改质剂。n该酶能分解各种天然油脂，分解油脂的容易程度为：C18：3C18：2C18：1C16：0C18：0C22：第11页，本讲稿共12页第12页，本讲稿共12页