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1、病原生物学教研室病原生物学教研室病原生物学实验（二）病原生物学实验（二）细菌接种技术细菌接种技术 实验目的实验目的 1 1 掌握常用的细菌接种方法掌握常用的细菌接种方法 2 2 熟悉细菌生长现象的观察方法熟悉细菌生长现象的观察方法 （一）细菌的分离培养和接种技术接种工具接种工具接种针和接种环接种针和接种环L型涂布棒型涂布棒接种环境接种环境接种罩、超净工作台或无菌室内进行。接种罩、超净工作台或无菌室内进行。接种方法接种方法1.平板划线接种法平板划线接种法：目的：目的：使混合的细菌呈单个分使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。获得纯菌。方法：方法：分区划
2、线法：适用于含菌量分区划线法：适用于含菌量较多的标本。较多的标本。连续划线法：适用于含菌量连续划线法：适用于含菌量较少的标本。较少的标本。分区划线分区划线划线时接种环与平皿约成划线时接种环与平皿约成30-40度角度角,轻轻接触轻轻接触,以腕力以腕力在琼脂表面在琼脂表面轻快滑动轻快滑动,不能划破琼脂不能划破琼脂.第一次划线应占平皿面积的第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线约占面积以后每次划线约占面积的的1/41/5.划线为连续划线划线为连续划线,不能间断不能间断.应占满平皿应占满平皿.划线不能交叉重划线不能交叉重复复.每次划完后应灭菌每次划完后应灭菌.2.斜面接种法：斜面接种法：用于菌
3、种移种，以进一步鉴定用于菌种移种，以进一步鉴定 和保存菌种。和保存菌种。3.3.半固体穿刺接种法：半固体穿刺接种法：保存菌种或观察细菌的动力和生保存菌种或观察细菌的动力和生化反应。化反应。4.4.液体接种法：液体接种法：用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种。培养基的接种。四四种种接接种种方方法法将上述已接种细菌的培养基置将上述已接种细菌的培养基置37恒温恒温培养箱中孵育培养箱中孵育1824h，观察细菌的生，观察细菌的生长现象。长现象。（二）细菌在培养基上的生长现象（二）细菌在培养基上的生长现象1.细菌在细菌在固体固体培养基中的生长现象培养基中的生长现
4、象菌落菌落定义：指定义：指单个细菌单个细菌在平板培养基上生长繁殖，在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的形成单一肉眼可见的细菌集团细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性透明度、湿润度、黏度、溶血性。菌苔菌苔：指指多个菌落多个菌落融合在一起形成的融合在一起形成的细菌堆积物细菌堆积物。菌落与菌苔菌落与菌苔菌落菌落菌苔菌苔2.细菌在细菌在液体液体培养基中的生长现象培养基中的生长现象浑浊浑浊：大多数细菌，如E.c.沉淀沉淀：多见于链状排列的细菌。菌膜菌膜：专性需氧菌（如结核分枝杆菌、枯草杆菌）。细菌在液体培养基中的生长
5、现象细菌在液体培养基中的生长现象菌膜菌膜菌沉淀菌沉淀均匀浑浊均匀浑浊对照对照3.细菌在细菌在半固体半固体培养基中的生长现象培养基中的生长现象有鞭毛细菌：有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线线边缘模糊边缘模糊。无鞭毛细菌：无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。细菌在半固体培养基中的生长现象细菌在半固体培养基中的生长现象有动力有动力 现象现象无动力无动力 现象现象 肠道致病菌的分离培养(1)一.肠道杆菌的生物学性状 二.S-S培养基的特性及用途 三.分离培养方法 主要内容（一）肠道杆菌的生物学性状 埃希菌属：
6、大肠埃希菌沙门菌属：伤寒沙门菌 甲型、乙型、丙型副伤寒志贺菌属：痢疾志贺菌肠杆菌科的重要菌属及代表菌种1.相似的形态染色从形态上无法区别中等大小的中等大小的G G-杆菌杆菌 多多有有鞭鞭毛毛、菌菌毛毛 乳糖发酵试验 肠道致病菌 肠道非致病菌 多数不发酵乳糖 多数发酵乳糖 初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌 +/-+伤寒杆菌 -+痢疾杆菌 -大肠杆菌 硫化氢 乳糖 葡萄糖 菌名 三种细菌的生化反应 成成 分分含量含量（g/Lg/L）作作 用用牛肉膏牛肉膏5 5营养成分营养成分乳糖乳糖1010营养成分，发酵营养成分，发酵蛋白胨蛋白胨5 5营养成分营养成分胆酸钠、胆酸胆酸钠、胆酸-脱氧胆脱氧胆酸钠盐混
7、合物（三号酸钠盐混合物（三号）3.53.5抑制抑制G+G+、大部分大肠菌群和变形、大部分大肠菌群和变形杆菌杆菌柠檬酸钠柠檬酸钠8.58.5抑制抑制G+G+、大部分大肠菌群和变形、大部分大肠菌群和变形0.1%0.1%煌绿溶液煌绿溶液0.33ml0.33ml抑制抑制G G+、大部分大肠菌群和变形、大部分大肠菌群和变形硫代硫酸钠硫代硫酸钠8.58.5检测硫化氢的产生检测硫化氢的产生10%10%柠檬酸铁溶液柠檬酸铁溶液10ml10ml检测硫化氢的产生检测硫化氢的产生1%1%中性红溶液中性红溶液2.5ml2.5ml指示剂指示剂琼脂琼脂1717凝固剂凝固剂（二）SS培养基 （Salmonella Shig
8、ella Agar）胆盐抑制胆盐抑制G G+,枸橼酸钠和煌枸橼酸钠和煌绿能部分抑制大肠杆菌绿能部分抑制大肠杆菌,致致病的沙门菌和志贺菌能大病的沙门菌和志贺菌能大量生长。量生长。中性红指示剂和乳糖中性红指示剂和乳糖,中中中中性性红遇酸变粉红。红遇酸变粉红。常用于肠道致病菌的分离常用于肠道致病菌的分离培养。培养。（二）SS培养基细细 菌菌SS平板平板大肠杆菌大肠杆菌粉红色粉红色大菌落大菌落痢疾杆菌痢疾杆菌无色细小，半透明菌落无色细小，半透明菌落伤寒杆菌伤寒杆菌无色细小无色细小 半透明菌落半透明菌落 (中间有黑色沉淀）中间有黑色沉淀）SS培养基中菌落特点 将粪便标本以平板分区划线法接种到将粪便标本以
9、平板分区划线法接种到SSSS培培 养基。养基。(每个实验室每个实验室8 8个个SSSS平板，每组做好标记，班长用胶布平板，每组做好标记，班长用胶布按班级绑好按班级绑好)放入放入3737温箱中培养温箱中培养24h24h；取出放；取出放44冰箱中保存备用。冰箱中保存备用。（三）粪便标本的分离培养1.1.空气中细菌的检查（空气中细菌的检查（每个班每个班2 2个平皿个平皿）原理：原理：根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体或液根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体或液体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气体是分散介质）粒子在地心引力的作用下
10、，以垂直的自然方体是分散介质）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上。式沉降到琼脂培养基上。方法：方法：在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖扣置于皿底下，暴露扣置于皿底下，暴露放置放置15min，即盖上皿盖，放入，即盖上皿盖，放入37 培培养养24小时，观察结果。小时，观察结果。细菌在自然界的分布细菌在自然界的分布2.2.紫外线对细菌的影响紫外线对细菌的影响（每个实验室（每个实验室2 2个培养皿）个培养皿）取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，打开一半平皿盖，置于紫外灯下照射打开一半平
11、皿盖，置于紫外灯下照射3030分钟，分钟，然后盖好平皿，置然后盖好平皿，置37培养培养24h后取出观察结果。后取出观察结果。密涂接种密涂接种 分三次接种，分三次接种，每次取一环。第每次取一环。第一次密涂接种后一次密涂接种后旋转旋转60度二次密度二次密涂接种，然后同涂接种，然后同方向旋转方向旋转60度后度后再次密涂接种。再次密涂接种。3.咽喉部细菌的检查（咽喉部细菌的检查（每班每班4 4个平皿个平皿）n取血琼脂平板取血琼脂平板1块，打开平皿盖，将培养基面置于块，打开平皿盖，将培养基面置于口腔前口腔前10cm处，受试者用力咳嗽几次；处，受试者用力咳嗽几次；n盖上平皿盖，置盖上平皿盖，置37温箱中倒
12、置培养温箱中倒置培养24h后取出后取出观察结果观察结果。4.化学消毒剂对细菌的影响化学消毒剂对细菌的影响方法方法：取一普通平皿培养基，取一普通平皿培养基，一部分写上一部分写上“前前”，另一部分，另一部分写上写上“后后”，然后将手指在写，然后将手指在写有有“前前”的部分沾一下，再将的部分沾一下，再将手指用酒精进行消毒，在写手指用酒精进行消毒，在写有有“后后”的部分沾一下。放入的部分沾一下。放入3737温箱培养温箱培养2424小时小时后观察。后观察。（每个实验室（每个实验室4 4个平皿）个平皿）5.5.自选细菌进行培养自选细菌进行培养(4(4个个)方法方法：取一普通平皿培养基，用棉签沾取生理盐水后，在取一普通平皿培养基，用棉签沾取生理盐水后，在手机、台面等物品上擦拭，然后涂布在平板上。手机、台面等物品上擦拭，然后涂布在平板上。下次实验细菌的形态学检查细菌的形态学检查药敏试验药敏试验肠道致病菌分离培养肠道致病菌分离培养