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1、关于蛋白质测序分离及提纯第一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质l紫外吸收：最大吸收峰为280nml两性解离：蛋白质的pI值不能直接计算，只能使用等电聚焦等方法进行测定l胶体性质l沉淀反应：盐析、pI 沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀l变性、复性l水解l颜色反应第二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.6.1 蛋白质的性质蛋白质的性质第三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月第四张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.6.2 蛋白质的胶体性质（一）胶体性质（一）胶体性质（colloidal system）胶体溶液的特点：胶
2、体溶液的特点：w分子直径在分子直径在1-100 nm1-100 nm内内w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀第五张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 蛋白质溶液有胶体溶液的性质，蛋白质溶液有胶体溶液的性质，如：扩散慢、如：扩散慢、易沉降、易沉降、粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体。可形成亲水的胶体。蛋白质胶体溶液的稳定因素：蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。中析出而产生沉淀。蛋白质是相对分子质量很大的生物分子蛋白质是相对分子质
3、量很大的生物分子,相对相对分子质量一般在分子质量一般在100001000000之间或更大之间或更大一些一些.+第六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月第七张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.6.3 变性变性、复性、复性（1）变性：）变性：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。变性不涉及一级结构的变化。现象称为变性。变性不涉及一级结构的变化。使蛋白质变性的因素使蛋白质变性的因素（1 1）物理因素：高温、高压、超声波、紫外线射）物理因素：高
4、温、高压、超声波、紫外线射线等线等 （2 2）化学因素：有机溶剂、强酸、强碱、重金属）化学因素：有机溶剂、强酸、强碱、重金属盐等盐等第八张，PPT共五十三页，创作于2022年6月变性的本质：变性的本质：分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有 序序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。蛋白质变性后的表现：蛋白质变性后的表现：（1 1）生物学活性消失）生物学活性消失（2 2）理化性质改变：溶解度下降，粘度增加，紫外吸）理化性质改变：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。
5、收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。第九张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（2）复性：）复性：去除变性因素回复原来结构与功能。变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性。（3）应用）应用利用变性：利用变性：n酒精消毒酒精消毒n高压灭菌高压灭菌防止变性：低温保存生物制品防止变性：低温保存生物制品取代变性：乳品解毒取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒用于急救重金属中毒)第十张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.6.4 蛋白蛋白质质的沉淀的沉淀 蛋白蛋白质质分子凝聚从溶液中析出的分子凝
6、聚从溶液中析出的现现象称象称为为蛋白蛋白质质沉淀沉淀（1）沉淀：）沉淀：不稳定蛋白质从溶液中析出不稳定蛋白质从溶液中析出（2）结絮：）结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱酸、强碱（3）凝固：）凝固：沉淀结块，凝块不溶于强酸、强碱沉淀结块，凝块不溶于强酸、强碱蛋白质在溶液中维持稳定的因素：蛋白质在溶液中维持稳定的因素：表面电荷、水化层（溶剂化层）表面电荷、水化层（溶剂化层）变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性第十一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月蛋白质的蛋白质的沉淀沉淀 Pr从胶体溶液中析出从胶体
7、溶液中析出 可逆沉淀：可逆沉淀：l温和条件，改变溶液温和条件，改变溶液pH或或Pr所所带电荷带电荷lPr结构和性质没有变化结构和性质没有变化l适当条件下可重新溶解适当条件下可重新溶解 非变性沉淀非变性沉淀lpI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 第十二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 不可逆沉淀不可逆沉淀l强烈沉淀条件强烈沉淀条件l破坏破坏Pr胶体溶液稳定性胶体溶液稳定性l也破坏也破坏Pr结构和性质结构和性质l沉淀不能再重新溶解沉淀不能再重新溶解变性沉淀变性沉淀l如加热沉淀、强酸如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等和生物碱沉
8、淀等第十三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月.盐析法盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性一般不引起变性第十四张，PPT共五十三页，创作于2022年6月.有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用带电质点间的相互作用.等电点沉淀等电点沉淀第十五张，PPT共五十三页，创作于2022年6月.重金属盐沉淀重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐与带负电荷蛋白质结成不溶性盐.生物碱试剂和某些酸类沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐与带正电荷蛋白质生成不溶性
9、盐.加热变性沉淀加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露，天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态破坏水化层及带电状态第十六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.6.5 蛋白质主要呈色反应 双缩脲反应双缩脲反应 酚试剂反应酚试剂反应 蛋白质定量、定性蛋白质定量、定性 茚三酮反应茚三酮反应 测定常用方法测定常用方法 第十七张，PPT共五十三页，创作于2022年6月双缩脲反应双缩脲反应(碱性溶液碱性溶液)Cu2+红紫色络合物红紫色络合物 蛋白质在碱性溶液中也能蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物生红紫色络合物第十八张，PPT共五十三页，创
10、作于2022年6月 Folin(福林试剂）福林试剂）-酚试剂反应酚试剂反应 蛋白质分子中含有一定量的酪氨酸残基，其中的蛋白质分子中含有一定量的酪氨酸残基，其中的酚基在碱性条件下与福林试剂的磷钼酸及磷钨酸酚基在碱性条件下与福林试剂的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物。还原成蓝色化合物。第十九张，PPT共五十三页，创作于2022年6月乙醛酸反应乙醛酸反应l在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。第二十张，PPT共五十三页，创作于2022年6月坂口反应坂口反应l精氨酸分子中含有脈基，能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及-萘酚在氢氧化钠溶液中
11、产生红色产物。此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质。第二十一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月米伦反应米伦反应l米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类公化合物有此反应。第二十二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月紫外吸收l蛋白质分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，这些氨基酸的侧链基团具有紫外光吸收能力，最大吸收峰在在280nm 处，故通过对280nm 波长的紫外吸光度的测量可对蛋白质溶液进行定量分析。第二十三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.7 蛋白质分离提纯蛋白质分离提纯及分析技及分析技
12、术术第二十四张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.7.1 蛋白质分子量及其确定方法蛋白质分子量及其确定方法l蛋白质相对分子量在60001 000 000之间。测定分子量的主要方法有化学组成法、渗透压法、超离心法（沉降分析法）、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。第二十五张，PPT共五十三页，创作于2022年6月v化学组成法化学组成法:最低最低M=M=元素元素(分子分子)分子量分子量/元素元素(分子分子)百分含量百分含量 v渗透压法渗透压法:Mr=cRT/:Mr=cRT/v超离心法超离心法:Mr=RTs/(1-)D:Mr=RTs/(1-)D v凝胶过滤凝胶过滤:logMr:logMr =K
13、=K1 1-K-K2 2V Ve evSDSSDSPAGEPAGE法法:logMr=:logMr=-b-bR R v氨基酸序列分析计算氨基酸序列分析计算第二十六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 元素原子量元素原子量(分子分子量分子分子量)l最低相对分子量最低相对分子量=元素元素(分子分子)百分含量百分含量肌红蛋白含铁量为肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可，其最低分子量可按下式算出：按下式算出：Fe原子量原子量(55.8)l最低相对分子量最低相对分子量=Fe元素百分含量元素百分含量(0.335%)=16700化学组成测定最低相对分子量化学组成测定最低相对分子量第二十七张，PP
14、T共五十三页，创作于2022年6月l真真实实分分子子量量是是最最低低相相对对分分子子质质量量的的n n倍倍，这这里里n n是是每每个个蛋蛋白白质质分分子子中中铁铁原原子子的的数数目目。因因为为肌肌红红蛋蛋白白中中，n nl l，所所以以其其真真实实M Mr r就就是是1670016700。又又如如血血红红蛋蛋白白含含铁铁也也是是0.335%0.335%，即即最最低低M Mr r亦亦为为1670016700，但但根根据据其其他他方方法法测测得得的的M Mr r是是6800068000。可可见见每每一一分分子子血血红红蛋蛋白白含含有有四四个个铁铁原原子子，即即n n4 4，因此其真实，因此其真实M
15、 Mr r16700167004=668004=66800。第二十八张，PPT共五十三页，创作于2022年6月l有有时时蛋蛋白白质质分分子子中中某某一一氨氨基基酸酸的的含含量量特特别别少少，应应用用同同样样的的原原理理，由由这这一一氨氨基基酸酸含含量量的的分分析析结结果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质量。果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质量。l例例如如牛牛血血清清清清蛋蛋白白含含色色氨氨酸酸0.58%，计计算算所所得得的的最最低低相相对对分分子子质质量量是是35200。用用其其他他方方法法测测得得的的Mr是是69000，所所以以每每分分子子牛牛血血清清清清蛋蛋白白含含有两个色氨酸残基。有两
16、个色氨酸残基。第二十九张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.7.2 蛋白质纯化总目标：增加制品纯度或比活总目标：增加制品纯度或比活1.1.前处理：因动前处理：因动/植物植物/细菌而异细菌而异2.2.粗分级分离：采用盐析粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀等电点沉淀/有机溶有机溶剂分级分离等方法剂分级分离等方法3.3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等吸附层析以及亲和层析等4.4.结晶结晶第三十张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（一）利用溶解度差别的分离方法（一）利用溶解度差别的分离方法1.等电点沉淀和等电点沉淀和p
17、H控制控制 当蛋白质处于等电点当蛋白质处于等电点pH值，蛋白质的净电值，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有斥力而荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有斥力而趋向于凝聚而沉淀。不同蛋白质具有不同的等趋向于凝聚而沉淀。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的理电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的理可以把蛋白质混合物分离开来。可以把蛋白质混合物分离开来。蛋白质混合物的分离纯化方法蛋白质混合物的分离纯化方法第三十一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.2.蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析 中性盐对蛋白质有明显的溶解度影响。在低中性盐对蛋白质有明显的溶解度影响。
18、在低浓度时，中性盐增加蛋白质的溶解度，这种现象浓度时，中性盐增加蛋白质的溶解度，这种现象称称盐溶盐溶。盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类。盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强。分子与水分子之间的相互作用却加强。盐析盐析：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白质分子
19、表面的水化子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。层。第三十二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月3.3.有机溶剂分级法有机溶剂分级法有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降
20、低而沉淀析出。也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。丙醇、甲醇等。第三十三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（二）根据分子大小不同的分离方法（二）根据分子大小不同的分离方法1.1.过滤与膜分离过滤与膜分离 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈丙烯腈、醋醋酸纤维素酸纤维素、赛璐玢赛璐玢以及尼龙尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物
21、质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。第三十四张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.2.离心分离离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。第三十五张，PPT共五十三页，创作于2022
22、年6月高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min，相对离心力达到 11041105 g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。超速离心机的最大转速达(2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。第三十六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月3.3.凝胶过滤层析凝胶过滤层析（gel-filtration chro
23、matographygel-filtration chromatography）凝胶层析又称为凝胶过滤凝胶过滤，分子排阻层析分子排阻层析，分子筛层析分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶层析柱中装有多孔凝胶多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢
24、，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的达到分离的目的。第三十七张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（三）根据电荷不同进行分离（三）根据电荷不同进行分离1.1.电泳电泳带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为动的过程称为电泳电泳。颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净本身所带的净电荷量电荷量，同时受颗粒形状颗粒形状和颗粒大小颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度电场强度、溶液溶液pH值值、离子强度离子强度及支持体
25、的支持体的特性特性等外界条件的影响。第三十八张，PPT共五十三页，创作于2022年6月 1 1）区带电泳区带电泳 是由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度是由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度不同分布成区带而的名。区带电泳按其支持介不同分布成区带而的名。区带电泳按其支持介质的物理性质不同可以分为四类：质的物理性质不同可以分为四类：（1 1）纸电泳和聚酰胺薄膜电泳；）纸电泳和聚酰胺薄膜电泳；（2 2）粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅）粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉与适当的溶剂调和而成，铺设成平板；胶粉与适当的溶剂调和而成，铺设成平板；（3 3）细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝；）细
26、丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝；（4 4）凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺）凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。和琼脂糖凝胶。第三十九张，PPT共五十三页，创作于2022年6月l聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)(PAGE)是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(acrylamide(acrylamide，Acr)Acr)和交联剂和交联剂N N，N-N-甲叉双丙甲叉双丙烯酰胺烯酰胺(methylene-bisacrylamide(methylene-bisacrylamide，Bis)Bis)在在加速剂四甲基乙二胺加速剂四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)和催化剂过硫和
27、催化剂过硫酸铵酸铵(AP)(AP)的作用下聚合形成的三维网状结构的作用下聚合形成的三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)。凝胶的浓度和孔径。凝胶的浓度和孔径可调节。可调节。第四十张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.2.离子交换层析离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（
28、母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交阳离子交换剂换剂和阴离子交换剂阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。第四十一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（四）蛋白质的选择吸附（四）蛋白质的选择吸附l某些物质对蛋白质有选择吸附，利用对不同的某些物质对蛋白质有选择吸附，利用对不同的蛋白质的吸附能力不同而得到分离。蛋白质的吸附能力不同而得到分离。l常用的吸附剂有结晶磷酸钙。常用的吸附剂有结晶磷酸钙。第四十二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（五）亲和层析（五）亲和层析 亲和层
29、析（亲和层析（affinity chromatography)affinity chromatography)是一种有是一种有效分离蛋白质的层析方法，它经常只需要一步即可使效分离蛋白质的层析方法，它经常只需要一步即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，并且纯度很高。亲和层析是基于某种蛋白质的出来，并且纯度很高。亲和层析是基于某种蛋白质的生物特异性，即它与另外一种称配基的分子能特异而生物特异性，即它与另外一种称配基的分子能特异而非共价结合。非共价结合。第四十三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月2.2.7 7.3.3 蛋白质一
30、级结构的测定蛋白质一级结构的测定蛋白质中氨基酸的排列顺序。第四十四张，PPT共五十三页，创作于2022年6月（一）蛋白质顺序测定基本战略（一）蛋白质顺序测定基本战略将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质第四十五张，PPT共五十三页，创作于2022年6月(2)(2)断开二硫键断开二硫键l在在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，用盐酸胍存在下，用过量的过量的-巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫键还原为处理，使二硫
31、键还原为巯基，然后用巯基，然后用烷基化试剂保护烷基化试剂保护生成的巯基，生成的巯基，防止重新被氧化。防止重新被氧化。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定第四十六张，PPT共五十三页，创作于2022年6月蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定(3)(3)氨基酸组成分析氨基酸组成分析 测定每条多肽链的测定每条多肽链的AAAA组成，并计算组成，并计算出出AAAA成分的分子比成分的分子比 第四十七张，PPT共五十三页，创作于2022年6月(4 4)分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端(5 5)多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段l采用两采用两/多种多种不同的断裂方法不
32、同的断裂方法将多肽将多肽 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。断裂成两套或多套肽段，并将其分离。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定第四十八张，PPT共五十三页，创作于2022年6月1 1、酶解法酶解法:l内切酶：内切酶：胰蛋白酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶l外切酶：羧肽酶和氨肽酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多多肽肽链链的的选选择择性性降降解解（四）多肽链的部分裂解和（四）多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化肽段混合物的分离纯化第四十九张，PPT共五十三页，创作于2022年6月lR1=Lys（K）和）和Arg（R）l专一性较强，水解速度快专一性较强
33、，水解速度快lR2=Pro（抑制）（抑制）肽链肽链水解位点水解位点胰蛋白酶胰蛋白酶trypsin第五十张，PPT共五十三页，创作于2022年6月(6 6)测定每个肽段的氨基酸顺序测定每个肽段的氨基酸顺序蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定(7 7)确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序 利用两利用两/多套肽段的多套肽段的AAAA顺序彼此间的交顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的错重叠，拼凑出整条多肽链的AAAA顺序。顺序。第五十一张，PPT共五十三页，创作于2022年6月(8 8)确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定第五十二张，PPT共五十三页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看第五十三张，PPT共五十三页，创作于2022年6月