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1、脂肪酶作用原理与应用领域第1页，本讲稿共65页内容n脂肪酶类型n脂肪酶作用原理n脂肪酶的应用领域第2页，本讲稿共65页n脂肪酶（lipase）又称甘油酯水解酶，是指分解或合成高级脂肪段和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。第3页，本讲稿共65页第4页，本讲稿共65页第5页，本讲稿共65页n脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统，即只在油水界面上作用，而且只有在当底物以微粒，小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。第6页，本讲稿共65页n脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。第7页，本讲稿共65页n脂肪酶的结构特点n
2、同源区段：His-x-y-Gly-Z-Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(X,Y,W,Z是可变的氨基酸残疾）；n活性中心是丝氨酸残疾，正常情况下受1个a-螺旋盖保护。第8页，本讲稿共65页第9页，本讲稿共65页n脂肪酶催化的反应第10页，本讲稿共65页n脂肪酶的来源：n脂肪酶广泛存在于动物植物和微生物中。n植物中含脂肪酸较多的是油料作物的种子，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必须的养料和能量；第11页，本讲稿共65页n动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，在动物体内，各类
3、脂肪酶控制消化，吸收，脂肪重建和蛋白质代谢等过程；第12页，本讲稿共65页n细菌，真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。由于微生物种类多，繁殖快，易发生遗传变化，具有动植物更广的作用，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶。第13页，本讲稿共65页n适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。第14页，本讲稿共65页n微生物脂肪酶：细菌28个属n 放线菌4个属n 酵母菌10个属n 其他真菌23个属n一共65个属的微生物生产脂肪酶第15页，本讲稿共65页n脂肪酶的生产方法第16页，本讲稿共65页n脂肪酶菌株的筛选 n筛选路线：
4、n采样富集培养初筛复筛检测酶活鉴定菌种保藏菌种n初筛方法：可淘汰85%-90%不符合要求的微生物利用平皿的生化反应进行分离第17页，本讲稿共65页nRhodamine B 平板筛选法n筛选原理：只放在脂肪酶的催化作用下水解生成甘油和脂肪酸，脂肪酸能与Rhodamine B 的阳离子发生作用，生成黄色的荧光物质，所以用紫外灯的观察，产脂肪酶的菌株周围会出现荧光圈，依据荧光圈的大小进行菌株的筛选。第18页，本讲稿共65页n 第19页，本讲稿共65页n溴甲酚紫平板筛选法：n筛选原理：溴甲酚紫作为一种显色剂，其PH变色为5.2-6.8，在碱性条件下显紫色，在酸性条件下鲜黄色，只放在脂肪酶的催化作用下生
5、成的脂肪酸会使培养基的PH降低，产脂肪酶菌株的周围会出现先黄色的透明圈，根据透明圈的有无和大小来筛选产脂肪酶的菌株，透明圈越大说明产脂肪酶活力越强。第20页，本讲稿共65页n琼脂块培养法：n将分离培养基用灭菌的打孔器制作成许多单个的直径约0.6cm的小琼脂块，排放在干净的培养皿内，将套选的菌株接种在这些小琼脂块上培养，让其充分生长。第21页，本讲稿共65页n然后依次再将长满菌的小琼脂块放到酶活测定板上，28培养1-3d，观察各菌落周围油脂水解圈的大小，水解菌越大，酶活越强，将水解圈大的菌株纯化后保存在斜面培养基上。第22页，本讲稿共65页n复筛选方法摇瓶培养n种子培养基发酵培养基收集菌体和上清
6、液，分别测酶活。n酶活的测定：n在给定的时间内，脂肪酶酶活大小与其催化水解生成的脂肪酸的量成正比。脂肪酶酶活的测定方法很所，根据原理不同，其中酸碱滴定法和分光光度法最为常用，常用的分光光度法有铜皂显色法和对硝基苯酯法。第23页，本讲稿共65页n测定脂肪酶酶活常用方法的比较第24页，本讲稿共65页第25页，本讲稿共65页脂肪酶的特性，结构和催化作用原理n脂肪酶的Mn脂肪酶的M因其来源不同而差异很大，不同来源的脂肪酶，其氨基酸组成数目从270-641不等，其M从29-100kD变化。第26页，本讲稿共65页n脂肪酶的最适温度和最适PHn脂肪酶的最适温度一般在30-60之间，最适PH一般为6-10，
7、不同来源的脂肪酶的最适合的温度和最适合的PH差异也比较大。列入一株无花果假丝酵母的脂肪酶最适温度为42，最适PH为8.0，一株青霉突变株的最适温度为25，最适PH为10第27页，本讲稿共65页脂肪酶的界面活化机理n脂肪酶和酯酶都能催化酯的水解，但只有脂肪酶可以催化水不溶性酯的水解。脂肪酶和酯酶的最大差别在于他们与底物的作用形式不同。酯酶的活性随着底物浓度的增加而增大，变现为依赖于底物浓度的正常Michaelis-Menten活性，而脂肪酶则表现出C形曲线，第28页，本讲稿共65页n在底物浓度处于溶解状态下，脂肪酶几乎没有活性，只有当底物浓度逐渐增加到超出其溶解度极限时，才表现出明显增加的活性，
8、这种现象称为“界面活性”。第29页，本讲稿共65页第30页，本讲稿共65页n脂肪酶的类型和生理分布情况脂肪酶的类型和生理分布情况 n大多数脂肪酶的行动特定位置上的脂至底物（小肠）甘油骨干。列入，人体胰腺酶。只是主要的酶，能分解人体消化系统中的膳食脂肪。转换成单甘酶和两种脂肪酶的摄入由衷的甘油三脂基板。其他及中国类型那个的脂肪酶的活性存在于自然中 如磷脂和鞘磷脂，然而，这些通常是从 传统的脂肪酶 分别对待。第31页，本讲稿共65页n在干按预案微生物分泌的一些脂肪酶的表达。尤其是白色念珠菌永远的大量不同的脂肪，这可能反映了广泛的脂肪分解活性，这可能有助于人体组织的持久性拜念珠菌的毒理。第32页，本
9、讲稿共65页n生理分布脂肪酶在不同的生物过程，从日常饮食甘油三酯代谢的细胞信号不等和炎症。因此，细胞内某些酶的活动只限于特定的车厢，而在细胞外空间的其他工作。例如在溶酶体酶，这种酶是局限在一个叫做溶酶体细胞器。第33页，本讲稿共65页n其他脂肪酶，胰脂肪酶，如被分泌到细胞外空间，他们为处理成更简单的形式，可以更容易吸收和运输整个身体的饮食血脂。第34页，本讲稿共65页n真菌和细菌分泌的脂肪酶，以促进养分的吸收，从外部介质（或病原微生物的例子，以促进一个新的主机入侵）。一定黄蜂和蜜蜂毒液含有磷脂，加强“生物损伤和炎症刺交付有效载荷”。作为生物膜是活细胞的组成部分，主要是磷脂的组成，脂肪酶在细胞生
10、物学中发挥的重要作用。第35页，本讲稿共65页n球形马拉色菌，木耳，被认为是人类头皮屑的原因，使用脂肪油酸和增加皮肤细胞的生产分解成皮脂，导致头皮屑。第36页，本讲稿共65页n人体消化系统的主要脂肪酶是人类胰脂肪酶的胰脂肪酶相关蛋白，这是由胰腺分泌。人类也有其他一些相关的酶，包括肝脂酶（HL），内皮脂酶，脂蛋白脂酶。第37页，本讲稿共65页脂肪酶的应用领域n脂肪酶在食品加工中的应用n脂肪酶在肉类加工中已得到有效的利用，如鱼肉加工中，脂肪酶参与生物酯解，除去鱼肉的脂类。近年，油脂改良技术成为研究的热点，最有价值的应用是将棕榈油转化为类可可脂。在非水相中用米赫毛霉(Mucor miehe)脂肪酶L
11、ipozyme IM催化，使硬脂酸甲酯与3339熔点棕榈油进行酯交换，制取类可可脂 J。此外，脂肪酶在改变植物油物理性状方面也有很大的潜力。第38页，本讲稿共65页n与化学合成的氢化油相比，脂肪酶具有催化酯交换改性油脂风味好，异构体少，不产生对人体有害的反式脂肪酸等优点，可生产营养价值高的塑性脂肪。第39页，本讲稿共65页n食品加工：n利用脂肪酶分解油脂释放出的短链脂肪酸增加或改进食品的风味、香味与质构，生产代可可脂，这是脂肪酶最早、最广泛的应用。第40页，本讲稿共65页n脂肪酶在饲料中的应用n饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量已很难提高。我
12、国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡、奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低0.30.6个百分点，使得饲料资源不足的问题更加严峻。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足。近年来，酶制剂一直是国内外动物营养研究的热点之一，它们在饲料工业中的有效应用使得饲料工业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。第41页，本讲稿共65页n脂肪在畜禽体内的作用主要是氧化供能，它含有的能量是碳水化合物的2.25倍，可满足动物体对较高能量浓度的要求；脂肪是脂溶性维生素和某些激素的溶剂，促进对这些物质的吸收和利用，同时为畜禽提供必需的不饱和脂肪酸，保证畜禽的健康生长；第42页，本讲稿共65页n添加脂肪还可
13、减少饲料加工过程中的粉尘，改善饲料外观，在高温条件下，还有利于提高能量摄入量，降低畜禽的体热增耗，减缓热应激。此外，添加脂肪可有效地提高饲料的适口性。因此，在猪、鸡和奶牛饲养中，在饲料中添加脂肪是比较普遍的。第43页，本讲稿共65页n脂肪酶在纺织物中的应用n织物表面脂质影响织物的柔软度、光亮度和着色与手感。传统脂处理法是用化学品脱除，效果不理想，且污染环境，成本高。脂肪酶能将织物表面脂质水解成易溶于水的脂肪酸，易于脱除。第44页，本讲稿共65页n研究了酶处理羊毛毯的防缩性能，比未处理的羊毛缩水性有明显改善用脂肪酶和淀粉酶协同处理棉布纤维，棉布白度提高，染色瑕疵少，更柔软、舒适。第45页，本讲稿
14、共65页n脂肪酶的医学应用n脂肪酶是一种重要的药物靶或中间体标记酶。作为诊断工具，脂肪酶可预测疾病。测定脂肪酶催化甘油三酸酯产生的甘油可间接获得血清甘油三酸酯的含量，血清中脂肪酶还可用于检测急性胰腺炎和胰腺损伤。第46页，本讲稿共65页n 制药n作为药物，脂肪酶可以帮助消化、降低血脂、治疗局部炎症，还可以作为临床诊断的工具。第47页，本讲稿共65页n制备化工产品和试剂n利用脂肪酶催化的脂水解反应、酯合成反应或酯转移反应可以制备许多有重要价值的化工产品。另外，脂肪酶催化的酯交换反应还被广泛应用于油脂改良以生产具有特殊结构与性质的油脂。第48页，本讲稿共65页n造纸工业n用脂肪酶辅以纤维素酶和木质
15、素酶处理纸浆可以防止树脂在干燥转鼓上的沉积，保持纸的产量和质量，并减少处理树纸化学品的用量。第49页，本讲稿共65页n工具酶n利用某些微生物脂肪酶对酯键位置专一性及脂肪酸种类专一性，可以分析脂类(脂肪、油、磷脂)的组成和构型。第50页，本讲稿共65页n 研究发现，从蜡蛀虫中提取的脂肪酶或酯酶，对分生杆菌属结核杆菌H37Rv有杀灭作用。提取植物脂肪酶制成的药物，可改善患者的消化吸收功能。美国俄勒冈州健康护理专业研究中心已有脂肪酶类药品上市，用于治疗胃肠紊乱、消化不良等疾病。在手性药物合成中，用脂肪酶制备单异构体手性药物可提高转化率、减少环境污染。第51页，本讲稿共65页n脂肪酶在生物柴油中的应用
16、n生物柴油是碳链长度为16-19的脂肪酸和甲醇或乙醇形成的酯类化合物的总称。近年，用脂肪酶催化合成生物柴油，代替石化能源成为研究热点。第52页，本讲稿共65页n用物理吸附法将假丝酵母脂肪酶(Candida sp99125)固定于大孔树脂，可催化大豆油制造生物柴油。研究表明，粗酶，树脂重量比为192：1，水，油重量比为3：17，4O，pH 74时，脂肪酶活性较高，转化率9 73。用固定化南极假丝酵母(cantarctica)脂肪酶催化泔水油，可制造生物柴油。第53页，本讲稿共65页n脂肪酶在生物传感器中的应用n用脂肪酶的催化特性研制生物传感器逐渐受到关注。固定在pH或氧化电极的脂肪酶联合葡萄糖氧
17、化酶可作为脂质生物传感器，测定甘油三酯、血胆固醇含量。第54页，本讲稿共65页前景与展望 n脂肪酶来源不同，导致结构和性质的多样性、不稳定性，使脂肪酶研究进展较慢。固定化脂肪酶可重复利用，提高酶稳定性、有利于实现工业化生产，降低生产成本。目前，脂肪酶固定化因其经济性和技术可靠性，离产业化还有相当大的差距，需对脂肪酶载体、固定化技术作深入研究。第55页，本讲稿共65页n今后，脂肪酶研究需生物遗传、生物化工、仪器分析、食品工程等领域的研究人员通力合作，筛选新的工业脂肪酶菌株，以解决工业生产和保护环境问题。现在有很多商品化的脂肪酶产品，多数是通过微生物发酵制得，只有少数几种来源于动物的脂肪酶是通过从
18、动物体中提取的方法制备。第56页，本讲稿共65页n根据不同用途开发出不同特性的脂肪酶产品，而这些已实现商品化生产的脂肪酶产品其pH稳定性多在中性偏碱范围内，对酸的耐受性较差(Claudia)，而添加于饲料中的脂肪酶必须要经过胃肠道的酸性条件及内源酶的水解到达作用位点，并能够在作用位点的pH范围内具有较高的活性，因此绝大多数已实现商品化生产的脂肪酶并不适合于饲料用。第57页，本讲稿共65页n基于这种现状，对脂肪酶研究进行一些探索性的工作，从而推动脂肪酶在饲料工业中的应用，也是一件非常有意义的工作。第58页，本讲稿共65页第59页，本讲稿共65页第60页，本讲稿共65页第61页，本讲稿共65页第62页，本讲稿共65页第63页，本讲稿共65页第64页，本讲稿共65页第65页，本讲稿共65页