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1、五章节核酸分离纯化 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础；内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸分离纯化的原则一、保持核酸一级结构的完整性
2、二、尽可能提高核酸制品的纯度第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化提取提取DNADNA总的原则总的原则1 1 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；2 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子分子的污染应降低到最低程度；的污染应降低到最低程度；3 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，也应尽量去除。，也应尽量去除。第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第二节第二节 基因
3、组基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化第四节第四节 RNA RNA的分离纯化的分离纯化第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择（一）材料与方法的选择（二）选择原则（一）（一）材料与方法的选择材料与方法的选择不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有
4、不同的要求需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择 1、保持核酸碱基序列的完整性 2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3、保持核酸的完整性 应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（二）选择原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（一）核酸的释放DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。二、技术路线的设计二、技术路线的设计表-各种组织细胞破碎方法细胞破
5、碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母核酸分子抽提的技术设计核酸分子抽提的技术设计核酸的释放：破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应 用最广泛的方法）核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需
6、要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子 时，其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化二、技术路线的设计二、技术路线的设计（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸的最常用的方法常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除二、技术路线的设计二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定1、浓度鉴定2、纯度鉴定3、完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 紫外分光
7、光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。1、浓度鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌 入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存EB与DNA的结合 紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与 降低均提示不纯。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8
8、 纯RNA的A260/A280比值为2.02、纯度鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存1.DNA1.DNA或或RNARNA的定量的定量ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于5050g/mlg/ml双链双链DNADNA4040g/mlg/ml单链单链DNADNA（或（或RNARNA）20g/ml20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNADNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=1.8=1.8RNARNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=2.0=2.0三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存浓度鉴定
9、浓度鉴定紫外分光光度法：测定紫外分光光度法：测定DNADNA在在A A260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。如计算如计算DNADNA浓度浓度A A260260稀释倍数稀释倍数5050 g/ml g/ml紫紫外外分分光光光光度度法法只只用用于于测测定定浓浓度度大大于于0.25ug/ml的的核核酸酸溶液。溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20 g/ml单链寡核苷酸）荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多，电泳迁移率低。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 荧光光度法 荧光染料溴化乙
10、锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。3、完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存DNADNA片段的降解片段的降解三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存一般而言
11、，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 总总RNARNA电泳图谱电泳图谱三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否则提示倍，否则提示RNA的降解的降解（二）核酸的保存1、DNA的储存2、RNA的储存三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存1 1、短期贮存：、短期贮存：4 4或或-20-20存放于存放于TETE（tristris和和EDTAEDTA）缓冲液中。）缓冲液中
12、。TETE缓缓冲冲液液的的PHPH与与DNA DNA 贮贮存存有有关关，PHPH为为8 8时时，可可减减少少DNADNA脱脱氨氨反应，反应，PHPH低于低于7.07.0时时DNADNA容易变性。容易变性。2 2、长期贮存：、长期贮存：TE TE缓冲液中缓冲液中-70-70保存数年；在保存数年；在DNADNA溶液中加一滴氯仿可有溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。效防止细菌和核酸的污染。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存（二）核酸的保存 _DNA的储存2、RNA的储存 RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液中
13、加入RNasin或VRC，保存时间可延长。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组 DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离 粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法四、其它方
14、法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收DNA酚抽提法示意图 一、酚抽提法一、酚抽提法一、酚抽提法一、酚抽提法该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法以含EDTA、SDS及RNase裂解缓冲液裂解细胞经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，获得DNA粗制品DNADNA样品准备样品准备 常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70或液氮主要试剂的作用：主要试剂的作用：EDTAEDTA：1 1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2 2 降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性
15、SDSSDS的作用：的作用：1 1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；2 2溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来；释放出来；3 3 对对RNARNA、DNADNA酶有抑制作用；酶有抑制作用；4 4 与蛋白质形成与蛋白质形成R-O-SO3.RR-O-SO3.R蛋白质复合物，蛋白质复合物，使蛋白质变性。使蛋白质变性。蛋白酶蛋白酶K K：水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化DNADNA酶和细胞中的蛋白质。酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶蛋白酶K K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能
16、力，而且在力，而且在SDSSDS、EDTAEDTA存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可同时使用。同时使用。酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNADNA酶活性。酶活性。PH8.0PH8.0的的TrisTris溶液可以似的抽提出的溶液可以似的抽提出的DNADNA进入水进入水相，减少在蛋白质层滞留。相，减少在蛋白质层滞留。在酚或酚在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。持分相的稳定性。为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于为什么苯酚要重蒸饱和后才能
17、用于DNADNA的分离？的分离？苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。DNADNA的沉淀的沉淀1.无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水沉淀析出，无水乙醇使用
18、前冰冻，可以减少乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。的损伤。2.异丙醇沉淀异丙醇沉淀除了使除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子。分子。DNADNA的浓缩的浓缩1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量。2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。DNADNA的检测的检测溴乙锭染色：在254nm紫外光下检测，如需回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。银染法：Ag+与DNA形成复
19、合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高200倍，但不能回收。二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法19871987年年KupiecKupiec等等报报道道了了甲甲酰酰胺胺解解聚聚法法，其其中中细细胞胞裂裂解解和和蛋蛋白白质质水水解解步步骤骤同同酚酚抽抽提提法法，但但不不进进行行酚酚的抽提。的抽提。破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右三三、玻棒缠绕法玻棒缠绕法现今使用的缠绕法是以1987年Bowtel
20、l的方法经改进而来。DNA玻棒缠绕法示意图 三、玻棒缠绕法三、玻棒缠绕法四、其它方法四、其它方法常用的一些分子诊断技术，并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法运用而生并广泛使用 1.异丙醇沉淀法:仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）2.玻璃珠吸附法五五、DNA DNA片段的纯化片段的纯化常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法（column chromatography）DNA柱层析法示意图柱层析法示意图五、五、DNADNA片段的纯化片段的纯化六、六、DNA DNA片段的回收片段的回收原则与要求:1.提高片段的回收率；2
21、.清除回收的DNA样品中的杂质。六六、DNA DNA片段的回收片段的回收（二）从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法2.电泳洗脱法3.冷冻挤压法4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段六六、DNA DNA片段的回收片段的回收电泳到电泳到DEAE-DEAE-纤维素膜纤维素膜 ：DEAE DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的负电荷的DNADNA分子。分子。在所需条带前插入在所需条带前插入DEAT-DEAT-纤维素膜，继续电泳纤维素膜，继续电泳至条带至条带DNA
22、DNA都到膜上，取出洗下。都到膜上，取出洗下。500 500bp-5kbbp-5kb的的DNADNA片段回收率较好，纯度高。但片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过不适用于分子量超过10kb10kb和单链和单链DNADNA。透析袋电洗脱透析袋电洗脱 ：切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，继续电泳，DNADNA出胶后进行抽提出胶后进行抽提DNADNA回收。回收。低熔点琼脂糖凝胶：低熔点琼脂糖凝胶：切下胶，加热到切下胶，加热到6565熔化胶，然后抽提回收熔化胶，然后抽提回收DNADNA。方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂方法
23、：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。水解酶等。玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNADNA，经分离、，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将洗涤后，在低盐缓冲液中将DNADNA洗脱下。洗脱下。琼脂水解酶：将含琼脂水解酶：将含DNADNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放成二糖，释放DNADNA，后使用酚抽提方法回收，后使用酚抽提方法回收DNA DNA（二）从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。虽费时但操作简单，是
24、小片段DNA回收的较好方法。六六、DNA DNA片段的回收片段的回收至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。六六、DNA DNA片段的回收片段的回收第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化质粒简介质粒简介质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状状DNADNA分子分子 其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200kb200kb以上不等以上不等 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复这些
25、质粒都是独立于细菌染色体之外进行复 制和遗传的辅助性遗传单位制和遗传的辅助性遗传单位 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术 质粒特性质粒特性1.1.分子相对小分子相对小 2.2.含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分 3.3.不相容性不相容性4.4.转移性转移性5.5.选择的标记选择的标记6.6.限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口常用质粒载体常用质粒载体pBR322pBR322 pBR322pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长为是一种使用最广泛的质粒，全长为4363b
26、p4363bp，由，由3 3种野生型质粒成分组成，种野生型质粒成分组成，ampampr r基因来自基因来自pRSF2124pRSF2124，tettetr r来自来自pSCl01pSCl01，复制起始点来自，复制起始点来自pM9pM9。核苷酸的序次号，。核苷酸的序次号，以以EcoRIEcoRI序列序列GAATTCGAATTC的第一个的第一个T T为第一个核苷酸。为第一个核苷酸。pUCpUC系统系统 如如pUCl8pUCl8和和pUCI9pUCI9，由，由pBR322pBR322的的ampampr r基因和复制基因和复制子，以及大肠杆菌部分子，以及大肠杆菌部分1acZ1acZ基因和一个多种限基因
27、和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长制性内切酶单一位点的接头构成，全长2 2 666bp666bp，pUCl8pUCl8和和pUCl9pUCl9所含多位点接头的方向所含多位点接头的方向正好相反。正好相反。质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 1 1细菌的培养细菌的培养 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒质粒DNADNA也在自主复制。也在自主复制。对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后不受
28、到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体体DNADNA的复制。质粒的复制。质粒DNADNA的复制不受影响而大量的复制不受影响而大量扩增扩增。使使用用氯氯霉霉素素的的主主要要目目的的，是是在在不不减减低低质质粒粒产产量量的的前前提提下下，减减少少细细菌菌的的培培养养体体积积和和细细菌菌的的数数量量 有有时时质质粒粒在在细细菌菌中中的的扩扩增增状状况况很很差差，常常是是由由于于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。2 2细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解细胞生长过程中，排出大量代谢产物
29、，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净 细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。质粒质粒DNADNA的小量制备的小量制备 2-5ml 2-5ml 质粒质粒DNADNA的大量制备的大量制备 500ml 500ml 碱裂解法碱裂解法 方法方法 煮沸法煮沸法 SDS SDS裂解法裂解法 Triton-Triton-溶菌酶法溶菌酶法 质粒质粒DNADNA提取方法的选择提取方法的选择 常常用
30、用的的煮煮沸沸法法，碱碱法法,SDS,SDS法法均均可可获获得得较较满满意意效效果果至至于于有有人人采采用用碱碱法法提提取取小小量量细细菌菌培培养养物物的的质质粒粒，用用煮煮沸沸法法或或SDSSDS法法进进行行质质粒粒DNADNA的的大大量量分离，分离，只是各个实验室的习惯问题只是各个实验室的习惯问题.选择哪种方法制备质粒选择哪种方法制备质粒DNADNA，应考虑以下因素：，应考虑以下因素：1 1菌株类型菌株类型 2 2质粒的大小质粒的大小 3 3细菌染色体细菌染色体DNADNA变性条件强弱的控制变性条件强弱的控制 4 4细菌的培养与收集细菌的培养与收集第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与
31、纯化的提取与纯化二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其它方法一、碱裂解法五、质粒DNA的纯化一、碱裂解法一、碱裂解法在NaOH存在的强碱性（pH12.012.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。一、碱裂解法一、碱裂解法细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中一、碱裂解法一、碱裂解法碱裂解法示意图二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能
32、破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清液中的质粒DNA。煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如HB101及衍生菌三、三、SDSSDS裂解法裂解法将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细胞，从而温和地释放质粒到等渗液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA。三、三、SDSSDS裂解法裂解法由 于 条 件 温 和，该 法 特 别 适
33、用 于 大 质 粒DNA（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。四、其它方法四、其它方法（二）牙签少量制备法(一)小量一步提取法四、其它方法四、其它方法(一)小量一步提取法 直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA。本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。四、其它方法四、其它方法（二）牙签少量制备法 用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA。由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯
34、化.CsCl-EB法.聚乙二醇沉淀法.柱层析法 质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验的要求还应进一步纯化。CsCl溴乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒DNA。转基因动物，真核细胞转染及DNA外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链DNA的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。对于DNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的DNA样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。EBCsC
35、l密度梯度离心法EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化 超速离心将介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中间，由于不同结构的DNA与EB结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的DNA区分开简述溴化乙锭简述溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心纯化质粒氯化铯密度梯度离心纯化质粒DNADNA的原理？的原理？1 1 氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成
36、一定的浓度梯度氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成一定的浓度梯度2 2 溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密度形成不同的致密带，蛋白质密度低位于上层，度形成不同的致密带，蛋白质密度低位于上层，RNARNA位于最位于最下层。下层。3 EB3 EB存在时，由于存在时，由于EBEB可以插入到可以插入到DNADNA双螺旋分子中，使得双螺旋分子中，使得DNADNA部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒DNADNA，EBEB不能插不能插入少，故可将不同结构的入少，故可将不同结构的DNADNA分子分离。分子
37、分离。EBCsCl密度梯度离心法示意图五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化第四节第四节 真核细胞真核细胞RNARNA的分离纯化的分离纯化每个细胞的每个细胞的RNA量约为量约为10-5g80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA一、关于一、关于RNaseRNase酶酶RNA易被RNase水解，RNase除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中。RNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复
38、。Rnase不需要二价阳离子激活去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。内源性内源性RNA酶酶外源性外源性RNA酶酶主要来源：被污染的缓冲液细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶，必须丢弃。自动移液装置实验室采取避免实验室采取避免RNARNA酶污染的措施酶污染的措施设置专门设置专门RNARNA移液装置移液装置小份保存缓冲液小份保存缓冲液设置专门的设置专门的RNARNA电泳装置电泳装置准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无RNARNA酶的器皿、酶的器皿、DEPC DEPC处理水等处理水等
39、分离分离RNARNA过程中使用过程中使用RNARNA酶抑制剂酶抑制剂 变性剂变性剂选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）使用蛋白酶K 使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠二、二、RNARNA酶抑制剂和变性剂酶抑制剂和变性剂胍类变性剂：胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂。蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，使蛋白质转换成随机卷曲状态。盐酸胍抑制RNA酶作用强，变性作用较异硫氰酸胍弱。异硫氰酸胍自身可形成氢键，在还原剂存在下断裂氢键。联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。RNARNA
40、酶抑制剂酶抑制剂（1）DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用DEPC。（2 2 2 2）RNARNARNARNA酶的蛋白抑制剂酶的蛋白抑制剂酶的蛋白抑制剂酶的蛋白抑制剂许多RNA酶可以与该类蛋白质结合形成非共价复合物从而是RNA酶失活。RNA酶蛋白
41、抑制剂与靶蛋白的亲和力大。商品化的RNA酶蛋白抑制剂的名称各异（如RNAsin等）。3.3.还原剂还原剂加入-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。第四节第四节 真核细胞真核细胞RNARNA的分离纯化的分离纯化二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法三、商品化的单相裂解试剂法分RNA四、mRNA的分离纯化一、RNA制备的条件与环境一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境RNA易被RNase水解，RNase除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中。RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，
42、RNase的活性又可恢复。一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）使用蛋白酶K 使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。加入-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水
43、解与灭活。一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法首先以含异硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞。然后在pH4.0的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液。最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA质量高等优点，能在3小时内迅速处理多个标本。总RNA产量取决于标本的起始量，每mg组织大约能制备47g总RNA，每106个细胞大约为410g。三、商品化的单相裂解试剂法分三、商品化的单相裂解试剂
44、法分RNARNA本法是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案。以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。三、商品化的单相裂解试剂法分三、商品化的单相裂解试剂法分RNARNA变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。三、商品化的单相裂解试剂法分三、商品化的单相裂解试剂法分RNARNA目前，该法已成为实验室最常用的总RNA提取法，其产量及质量与前法相当。四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长短不同的poly（A）尾巴。利用碱
45、基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。1.oligo（dT）-纤维素柱层析法2.oligo（dT）-纤维素柱离心法3.oligo（dT）-纤维素液相结合离心法4.磁性球珠分离法四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的poly(A)+RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5链亲和素标记的磁珠+Streptavidin-磁5m7G AAAAAAAA
46、AAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁洗涤与洗脱水相(含纯化的mRNA)固相生物素标记的oligo(dT)磁铁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁磁珠分离法纯化poly(A)+RNA的原理四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化问题问题从细胞或组织中分离从细胞或组织中分离DNADNA时，常用蔗糖，目的时，常用蔗糖，目的是（是（）
47、A A 抑制核酸酶抑制核酸酶 B B 保护保护DNADNA，防止断裂，防止断裂 C C 加速蛋白质变性加速蛋白质变性 D D 有利于细胞破碎有利于细胞破碎异戊醇的作用是（异戊醇的作用是（）A A 使蛋白质脱水使蛋白质脱水B B 使使DNADNA进入水相进入水相C C 帮助帮助DNADNA进入水相进入水相D D 减少气泡，促进分相减少气泡，促进分相变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNADNA分离，原因主要是（分离，原因主要是（）A A 氧化物可使氧化物可使DNADNA磷酸二酯键断裂磷酸二酯键断裂B B 氧化物会改变氧化物会改变PHPH值值C C 氧化物同氧
48、化物同DNADNA形成复合物形成复合物D D氧化物在氧化物在DNADNA分离后不易除去分离后不易除去在细胞核内，核酸常与哪一种物质结合形成复合物 A、糖 B、蛋白质 C、脂类 D、水 E、无机盐在RNA纯化时，为了既利于DNA变性又利于RNA的分离，常使用的水饱和酚的PH值 A 3.0-4.0 B 4.5-5.5 C 6.0-7.0 D 7.0-8.0 E 8.0-9.0在利用在利用CsCl-EBCsCl-EB法纯化质粒法纯化质粒DNADNA的过程中，的过程中，离心后位于试管中部的物质是离心后位于试管中部的物质是 A A 蛋白质蛋白质 B B 油或铯油或铯 C DNA C DNA D RNA
49、D RNA E E 复合糖类复合糖类通过紫外分光光度法可对核酸纯度进行鉴定，下列说法不正确的是通过紫外分光光度法可对核酸纯度进行鉴定，下列说法不正确的是A A 主要通过主要通过A260A260与与A280A280的比值来判断有无蛋白质的的比值来判断有无蛋白质的污染污染B B 在在TETE缓冲液中，纯缓冲液中，纯DNADNA的的A260/A280A260/A280比值为比值为1.81.8C TEC TE缓冲液中，纯缓冲液中，纯RNARNA的的A260/A280A260/A280的比值是的比值是2.02.0D A260/A280D A260/A280的比值为的比值为1.81.8的的DNADNA溶液
50、是纯的溶液是纯的DNADNA溶液溶液E E 蛋白质在蛋白质在280nm280nm的吸收峰和酚在的吸收峰和酚在270nm270nm的吸收峰可的吸收峰可以鉴定是蛋白质还是酚污染以鉴定是蛋白质还是酚污染目前使用最广泛的质粒目前使用最广泛的质粒DNADNA小量提取的方法是小量提取的方法是A A 煮沸裂解法煮沸裂解法B SDSB SDS裂解法裂解法C C 小量一步提取法小量一步提取法D D 碱裂解法碱裂解法E E 牙签少量制备法牙签少量制备法酚抽提法可用于高分子量酚抽提法可用于高分子量DNADNA的分离纯化，所用试剂分别有不同的功能，的分离纯化，所用试剂分别有不同的功能，下列不正确的是下列不正确的是A