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1、专题41 细胞工程 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望(2015福建卷，福建卷，33，10分分)33.【生物生物-现代生物科技专题现代生物科技专题】（10分）分）GDNF是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因基因的表达载体（如图的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：所示），并导入到大鼠神经
2、干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是 。（2）构建含）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图基因的表达载体时，需选择图1中的中的 限制酶进行酶切。限制酶进行酶切。（3）经酶切后的载体和）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、连、GDNF基因与载体正向连接、基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图基因与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这所示）。为
3、鉴定这3种连接方式，种连接方式，选择选择HpaI酶和酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第所示。图中第 泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用基因是否成功表达，可用相应的相应的 与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行 培养以得到更
4、多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。使细胞分散开使细胞分散开 Xho抗体抗体传代传代细胞工程细胞工程 1 1、概念、概念:应用的原理和方法应用的原理和方法研究的水平研究的水平研究的目的研究的目的细胞生物学和分子生物学细胞生物学和分子生物学细胞整体水平或细胞器水平细胞整体水平或细胞器水平按照人们的意愿来按照人们的意愿来改变细胞内改变细胞内的遗传物质的遗传物质或或获得细胞产品获得细胞产品2 2、分类、分类植物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程微生物工程微生物工程所采用技术所采用技术的理论基础的理论基础 植植物物细细胞胞工工程程通
5、通常常采采用用的的技技 术术 手手 段段 植物植物组织培养组织培养 植物植物体细胞杂交体细胞杂交植物细胞的植物细胞的全能性全能性一、植物细胞工程一、植物细胞工程 (离体的植物离体的植物器官、组织或细胞器官、组织或细胞)脱分化脱分化再分化再分化愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽（胚状体）（胚状体）植物体植物体 培养条件：培养条件：离体离体、含有、含有全部营养成分全部营养成分的培养基、的培养基、一定的温度、空气、一定的温度、空气、无菌环境无菌环境、适合、适合的的PHPH、适合的光照等、适合的光照等外植体外植体举例：举例：花药离体培养；基因工程培育的抗棉铃虫花药离体培养；基因工程培育的抗棉铃虫的棉花植株；
6、细胞工程中培育的的棉花植株；细胞工程中培育的“番茄番茄-马马铃薯铃薯”杂种植株等。杂种植株等。1 1、植物组织培养、植物组织培养 扩大扩大培养培养几个概念：几个概念：愈伤组织愈伤组织：离体的植物器官、：离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、无定形成一种高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成的排列疏状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织。松无规则的组织。植物组织培养植物组织培养外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官组织或器官1 1）外植体灭菌消毒（根尖、茎、
7、芽、嫩叶、）外植体灭菌消毒（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、花粉等）种子、花粉等）2 2）用消毒过的器械将外植体置于培养皿上）用消毒过的器械将外植体置于培养皿上3 3）切取所需的外植体）切取所需的外植体4 4）将外植体接种于培养容器的培养基上）将外植体接种于培养容器的培养基上整个试验在超净工作台上进行，保持无菌！整个试验在超净工作台上进行，保持无菌！外植体经过一段时间在培养基上生长后，会形外植体经过一段时间在培养基上生长后，会形成愈伤组织成愈伤组织植物组织培养的培养基植物组织培养的培养基定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质基质无机营养成分：无机
8、营养成分：C C，H H，O O大量元素及部分微量元素大量元素及部分微量元素有机营养成分有机营养成分 含含N N物质：包括维生素和氨基酸物质：包括维生素和氨基酸 碳源：碳源：2%2%5%5%的蔗糖的蔗糖 琼脂：起支持作用琼脂：起支持作用 生长激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素生长激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素PHPH值：值：5.05.06.06.0试管苗大规模培养植物植物A A细胞细胞植物植物B B细胞细胞加酶去加酶去壁壁原生质体原生质体A A原生质体原生质体B B原生质原生质体融合体融合融合细胞融合细胞再再生生壁壁杂种细胞杂种细胞脱分化脱分化去壁的常用方法：去壁的常用方法：酶解法酶解法（纤维
9、素酶、果胶酶等）（纤维素酶、果胶酶等）诱导原生质诱导原生质体融合方法：体融合方法：物理方法：物理方法：离心、振动、电刺激等离心、振动、电刺激等 化学方法：化学方法：聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）融合成功的标志融合成功的标志人工诱导人工诱导筛选筛选愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株再分化再分化2 2、植物体细胞杂交的过程、植物体细胞杂交的过程意义：克服远缘杂交不亲和的障碍意义：克服远缘杂交不亲和的障碍（1 1）植物繁殖的新途径）植物繁殖的新途径1 1）微型繁殖（快速繁殖）微型繁殖（快速繁殖）2 2）作物脱毒）作物脱毒3 3）神奇的人工种子）神奇的人工种子（2 2）作物新品种的培育）作物新品种的
10、培育1 1）单倍体育种）单倍体育种2 2）突变体的利用）突变体的利用3 3）转基因植物的培育）转基因植物的培育 （3 3）细胞产物的工厂化生产）细胞产物的工厂化生产3 3、植物细胞工程的实际应用、植物细胞工程的实际应用1.1.微型繁殖微型繁殖2.2.作物脱毒作物脱毒3.3.神奇的人工种子神奇的人工种子一、植物繁殖的新途径技术：技术：原理：原理：结构：结构：优点：优点：胚状体（不定芽、顶芽、腋芽胚状体（不定芽、顶芽、腋芽）人工薄膜：人工薄膜：加入适量无机盐、有机碳源等养分，加入适量无机盐、有机碳源等养分，农药、抗生素、有益菌及生长调节剂等农药、抗生素、有益菌及生长调节剂等组织培养组织培养细胞全能
11、性细胞全能性与天然种子比：与天然种子比：解决某些作物繁殖力低、结子困难、发芽率低问题解决某些作物繁殖力低、结子困难、发芽率低问题 保持优良品种遗传特性保持优良品种遗传特性 不受气候、季节、地域的限制，时间短，占地少不受气候、季节、地域的限制，时间短，占地少与试管苗比：与试管苗比：有人工薄膜保护，方便地贮藏和运输有人工薄膜保护，方便地贮藏和运输？胚胚(胚胚)二、作物新品种的培育1.单倍体育种单倍体育种2.突变体的利用突变体的利用 对植物组织培养过程中得对植物组织培养过程中得愈伤组织愈伤组织进行进行诱变诱变处理，处理，促其发生突变，诱导分化成植株，促其发生突变，诱导分化成植株，筛选筛选对人们对人们
12、有利突变有利突变体体,进而培育新品种进而培育新品种新新品种品种外植体外植体愈伤组织愈伤组织 多种多种突变体突变体筛选筛选脱分化脱分化再分化再分化诱变处理诱变处理3 3、转基因植物的培育、转基因植物的培育转基因细胞转基因细胞转基因植物转基因植物植物组织培养植物组织培养4 4、植物体细胞杂交、植物体细胞杂交植物细胞融合植物细胞融合杂种细胞杂种细胞杂种植物杂种植物植物组织培养植物组织培养转基因技术转基因技术转基因细胞转基因细胞杂种细胞杂种细胞茎尖、根尖等分生区茎尖、根尖等分生区花药（花粉）花药（花粉）外植体外植体脱分化脱分化 愈伤愈伤组织组织再分化再分化丛芽或丛芽或胚状体胚状体 工厂化工厂化生产药物
13、生产药物人工种子人工种子转基因植物转基因植物杂种植物杂种植物作物脱毒作物脱毒单倍体育种单倍体育种微型繁殖微型繁殖、根、根植物体植物体诱变处理诱变处理突变细胞突变细胞2 21 12 2植物细胞工程的实际应用植物细胞工程的实际应用突变体的利用突变体的利用+人工薄膜人工薄膜培养培养二、二、动物细胞工程动物细胞工程植物细胞工程常用的技术手段：植物细胞工程常用的技术手段：植物组织培养、植物组织培养、植物体细胞杂交植物体细胞杂交等等强调：强调：是其他动物是其他动物细胞工程技术的细胞工程技术的基础基础。动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞核移植动物细胞核移植 动物细胞融合动物细胞融合 单克隆抗体制备单克隆抗体
14、制备等等 动物细胞培养技术动物细胞培养技术 常用的技术手段：常用的技术手段：动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞悬细胞悬浮液浮液去掉组织去掉组织间蛋白间蛋白1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限无限传代传代原代培养原代培养传代培养传代培养部分细胞遗部分细胞遗传物质改变传物质改变动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成动物体最终培养成动物体随细胞增多，细胞随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖就会停止分裂增殖1.1.动物细胞培养动物细胞培养:细胞细胞悬浮悬浮液液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无
15、限传无限传代代原代培养原代培养传代培养传代培养细胞株细胞株细胞系细胞系如何界定原代培养和传代培养；如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？细胞株和细胞系？多数组织细胞必须在固定多数组织细胞必须在固定的表面上生长和分裂。的表面上生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变遗传物质改变贴壁生长细胞分裂生长到贴壁生长细胞分裂生长到相互接触时就停止分裂增相互接触时就停止分裂增殖的现象叫接触抑制殖的现象叫接触抑制植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较项目项目培养基培养基结果结果应用应用植物组植物组织培养织培养动物细动物细胞培养胞培
16、养均需适宜的外界条件：均需适宜的外界条件：PH,PH,温度温度,营养及营养及“无菌、无菌、无毒环境无毒环境”等。等。固体固体、营养物、营养物质、质、蔗糖、植蔗糖、植物激素物激素培养成培养成植株植株液体液体、营养物、营养物质、质、葡萄糖、葡萄糖、动物血清动物血清培育成细培育成细胞系或细胞系或细胞株胞株1.生产蛋白质制品生产蛋白质制品（如病毒疫苗、干扰素、（如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体单克隆抗体、动物激素）、动物激素）2.用于某些器官移植用于某些器官移植1.1.试管苗的快速繁殖试管苗的快速繁殖2.2.无病毒植物的培育无病毒植物的培育3.3.生产药物等生产药物等4.4.人工种子人工种子5.5.转基
17、因植物的培育转基因植物的培育思考：思考：2 2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？组织做动物细胞培养材料？1 1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？物组培培养基有何独特之处？、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？样最终培养成新个体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：动物血清等。独特之处有：液体培养基液体培养基 成分中有动物血清等成分中有
18、动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强强不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体能发育成新的动物个体细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞物理法、物理法、化学法化学法灭活灭活的仙台病毒的仙台病毒 2 2、动物细胞融合、动物细胞融合过程过程诱导动物细胞融合与植物原生质体融合诱导动物细胞融合与植物原生质体融合的的原理原理和和方法方法是否基本相同？是否基本相同？制备单制备单克隆抗克隆抗体：体：不具有繁殖性不具有繁殖性但具有抗原性但具有抗原性获得获得杂种植株杂种植株用途用途物理、
19、化学方物理、化学方法法（同左）（同左）生物：灭活的病毒生物：灭活的病毒物理（离心、物理（离心、振荡、电刺激）振荡、电刺激）化学（化学（PEGPEG）诱导方法诱导方法使细胞使细胞分散后分散后诱诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导导原生质体融合原生质体融合细胞融合细胞融合的方法的方法细胞膜的细胞膜的流动性流动性细胞膜的细胞膜的流动性流动性、植物细胞植物细胞全能性全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊
20、母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩 妊娠妊娠 多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程融合后的卵细胞融合后的卵细胞3.核移核移植与克植与克隆动物：隆动物：动物细胞核有动物细胞核有全能性全能性 抗原抗原 动物体内动物体内刺激刺激 效应效应B 抗体抗体 特点：产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏特点：产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏4 4、单克隆抗体、单克隆抗体1 1、常规抗体制备、常规抗体制备：一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞：只分泌一种：只分泌一种特异性抗体特异性抗体2、单克隆抗体制
21、备：、单克隆抗体制备：杂交瘤细胞杂交瘤细胞 小鼠小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞：能：能无限增殖无限增殖融合融合 单克隆抗体单克隆抗体 培养培养 抗原注入小鼠体内抗原注入小鼠体内已免疫的已免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞筛选筛选出出杂交瘤细胞杂交瘤细胞筛选筛选出能产生特异性抗体的细胞群出能产生特异性抗体的细胞群体外培养体外培养体内培养体内培养从培养液中提取从培养液中提取从小鼠腹水中提取从小鼠腹水中提取单克隆抗体单克隆抗体细胞融合细胞融合动物细胞培养动物细胞培养单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备(特定的特定的选择培养基选择培养基)主要用于疾病的诊断、治疗和预防。主要用于疾病的诊断、治疗和预
22、防。若在单抗上带上抗癌药物制成若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹生物导弹”，将药物将药物定向定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。细胞又不会伤害健康细胞。特点：与常规抗体相比，具有特点：与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏特异性强、灵敏度高、化学性质单一度高、化学性质单一的优点。的优点。单克隆抗体的应用：单克隆抗体的应用：单克隆抗体是指：单克隆抗体是指：杂交瘤细胞产生的单一抗体杂交瘤细胞产生的单一抗体结合同位素的单抗结合同位素的单抗-生物导弹生物导弹单抗单抗放射放射性同性同位素位素例例(06(06江苏江苏)下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。下
23、图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。（1 1）_技术是单克隆抗体技术的基础。技术是单克隆抗体技术的基础。（2 2）根据培养基的用途分类，图中）根据培养基的用途分类，图中HATHAT培养基属于培养基属于_培养基。培养基。（3 3）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是_。（4 4）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用用_。（5 5）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的_特点，又具备淋巴特点，又具备淋巴细胞的细胞的_
24、特点。特点。（6 6）淋巴细胞是由动物体）淋巴细胞是由动物体_中的中的_细胞分化、发育而来。细胞分化、发育而来。（7 7）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是_。动物细胞培养动物细胞培养选择选择特异性强特异性强,灵敏度高灵敏度高灭活的病毒灭活的病毒在体外大量增殖在体外大量增殖分泌特异性抗体分泌特异性抗体骨髓骨髓造血干细胞造血干细胞主动运输主动运输6、基基因因型型为为AaBb的的水水稻稻(具具有有24条条染染色色体体)的的花花粉粉通通过过无无菌菌操操作作，接入试管后，在一定条件下形成试管苗的育种过程。接入试管后，在一定条件下形成试
25、管苗的育种过程。(1)愈愈伤伤组组织织是是花花粉粉细细胞胞不不断断分分裂裂后后的的形形成成的的不不规规则则细细胞胞团团，愈愈伤伤组组织形成中，必须从培养基中获得织形成中，必须从培养基中获得_。(2)要要促促进进花花粉粉细细胞胞分分裂裂生生长长，培培养养基基中中应应有有_和和_ _两两类激素。类激素。(3)愈愈伤伤组组织织分分化化是是指指愈愈伤伤组组织织形形成成芽芽和和根根，再再由由芽芽发发育育成成叶叶和和茎茎。这这一一过过程程必必须须给给予予光光照照，其其原原因因是是_利利用用光光照照制制造造有有机物，供试管苗生长。机物，供试管苗生长。(4)试管苗的细胞核中含有试管苗的细胞核中含有_条脱氧核苷酸链。条脱氧核苷酸链。(5)培养出的试管基因型有培养出的试管基因型有 。如果要获得育种需。如果要获得育种需要的植株，并能繁殖新品种，后面的育种步骤是要的植株，并能繁殖新品种，后面的育种步骤是_。各种营养各种营养(水、无机盐、蔗糖等能水、无机盐、蔗糖等能量物质量物质)和小分子有机物和小分子有机物生长素生长素 细胞分裂素细胞分裂素叶绿体叶绿体 24AB、Ab、ab、a用一定浓度的秋水仙素处理组织培养获得的幼苗用一定浓度的秋水仙素处理组织培养获得的幼苗