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1、生化技术知识整理第1页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23当当试试样样由由载载气气携携带带进进入入色色谱谱柱柱与与固固定定相相接接触触时时，被被固固定相溶解或吸附定相溶解或吸附随随着着载载气气的的不不断断通通入入，被被溶溶解解或或吸吸附附的的组组分分又又从从固固定定相中挥发或脱附相中挥发或脱附挥挥发发或或脱脱附附下下的的组组分分随随着着载载气气向向前前移移动动时时又又再再次次被固定相溶解或吸附被固定相溶解或吸附随随着着载载气气的的流流动动，溶溶解解、挥挥发发，或或吸吸附附、脱脱附附的的过过程程反复地进行。反复地进行。第2页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/
2、23分配系数分配系数 K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用比，称为分配系数，用K 表示，表示，即：即：第3页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23分配系数分配系数 K的讨论的讨论 一定温度下，组分的分配系数一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；试样一定时，试样一定时，K主要取决于固定相性质；主要取决于固定相性
3、质；每个组份在各种固定相上的分配系数每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；值是分离的基础；某组分的某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。时，即不被固定相保留，最先流出。第4页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/232.2.色谱法分类色谱法分类 气相色谱气相色谱：流动相为气体（称为载气）。流动相为气体（称为载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气按固定相
4、的不同又分为：气-固色谱和气固色谱和气-液色谱液色谱第5页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23 3 气相色谱基本概念气相色谱基本概念（1）有关色谱图的定义）有关色谱图的定义色色谱谱图图：检检测测器器响响应应信信号号随随时时间间变变化化的的曲曲线线。也也叫叫流流出出曲线。曲线。基基线线：没没有有进进样样时时，只只有有载载气气通通过过检检测测器器，记记录录仪仪记记下下的的曲线。曲线。色谱峰色谱峰：色谱柱流出物通过检测器时所产生的信号曲线。：色谱柱流出物通过检测器时所产生的信号曲线。峰底峰底：连接峰起点到终点间的距离。：连接峰起点到终点间的距离。第6页，本讲稿共30页2022/1
5、0/232022/10/23峰高峰高：流出曲线：流出曲线最大值到峰底的距离。最大值到峰底的距离。峰宽峰宽（W）：峰两侧）：峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离。拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离。半峰宽半峰宽（W1/2）：峰高一半处峰的宽度。）：峰高一半处峰的宽度。峰面积峰面积（A）：峰与峰底围成的面积。）：峰与峰底围成的面积。保保留留时时间间（tr）：组组分分从从进进样样到到出出现现峰峰最最大大值值时时所所需需时间。时间。第7页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23气相色谱流出曲线气相色谱流出曲线1 1).).基线基线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2
6、2).).保留值保留值 （1 1）时间表示的保留值）时间表示的保留值保留时间（保留时间（t tr r）：）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的 时间 死时间（死时间（t tr r0 0）：）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时 间。调整保留时间（调整保留时间（t tr r ）：）：tr=trtr0 第8页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23续续色谱曲线的用途色谱曲线的用途：（1）根据色谱峰的位置（保留值）可以进行定性的分析）根据色谱峰的位置（保留值）可以进行定性的分析.（2）根据色谱峰的面积可以进行定量分析）根据色谱峰的面积可以进行定量分析.（3）根据色谱峰的位置及
7、其宽度，可以对色谱柱分离情）根据色谱峰的位置及其宽度，可以对色谱柱分离情况进行评价。况进行评价。第9页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23两相邻组分在不同色谱条件下的分离情况：两相邻组分在不同色谱条件下的分离情况：(a)(a)两峰间仅有一定的距离，而每个峰却很宽，致使彼此重两峰间仅有一定的距离，而每个峰却很宽，致使彼此重叠，两组分不能完全分离叠，两组分不能完全分离。（b)两峰间有既有一定的距离，且每个峰却很窄，致使彼两峰间有既有一定的距离，且每个峰却很窄，致使彼此峰不重叠，两组分能完全分离。此峰不重叠，两组分能完全分离。续第10页，本讲稿共30页2022/10/232022
8、/10/234、气相色谱流程、气相色谱流程1-1-载气钢瓶；载气钢瓶；2-2-减压阀；减压阀；3-3-净化干燥管；净化干燥管；4-4-针形阀；针形阀；5-5-流量计流量计;6-;6-压力表；压力表；7-7-进样器进样器;8-;8-色谱柱色谱柱;9-;9-热导检测器；热导检测器；10-10-放大器；放大器；11-11-温度控制器；温度控制器；12-12-记记录仪；录仪；1.载气系统：包括气源、净化干燥管和载气流速控制载气系统：包括气源、净化干燥管和载气流速控制;2.进样系统：进样器及气化室；进样系统：进样器及气化室；3.色谱柱：填充柱（填充固定相）或毛细管柱（内壁涂有固定液）；色谱柱：填充柱（填
9、充固定相）或毛细管柱（内壁涂有固定液）；4.检测器：可连接各种检测器，以检测器：可连接各种检测器，以热导检测器或氢火焰检测器热导检测器或氢火焰检测器最为常见；最为常见；5.记录系统：放大器、记录仪或数据处理仪；记录系统：放大器、记录仪或数据处理仪；6.温度控制系统：柱室、气化室的温度控制。温度控制系统：柱室、气化室的温度控制。气相色谱的组成气相色谱的组成气相色谱的组成气相色谱的组成:第11页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23 1 1)气固色谱固定相气固色谱固定相种类：种类：活性炭：活性炭：有较大的比表面积，吸附性较强。有较大的比表面积，吸附性较强。活活性性氧氧化化铝铝：有
10、有较较大大的的极极性性。适适用用于于常常温温下下O2 2、N2 2、CO、CH4 4、C2 2H6 6、C2 2H4 4等等气气体体的的相相互互分分离离。CO2 2能能被被活活性性氧氧化化铝铝强强烈烈吸附而不能用这种固定相进行分析。吸附而不能用这种固定相进行分析。硅硅胶胶：与与活活性性氧氧化化铝铝大大致致相相同同的的分分离离性性能能，除除能能分分析析上上述述物物质质外，还能分析外，还能分析CO2 2、N2 2O、NO、NO2 2等，且能够分离臭氧。等，且能够分离臭氧。固定相及其选择固定相及其选择5、色谱柱及使用条件的选择、色谱柱及使用条件的选择第12页，本讲稿共30页2022/10/23202
11、2/10/23 分子筛分子筛：碱碱及及碱碱土土金金属属的的硅硅铝铝酸酸盐盐（沸沸石石），多多孔孔性性。如如3A、4A、5A、10X及及13X分子筛等（孔径：埃）。分子筛等（孔径：埃）。高分子多孔微球（高分子多孔微球（GDX系列）：系列）：新型的有机合成固定相（苯乙烯与二乙烯苯共聚）。新型的有机合成固定相（苯乙烯与二乙烯苯共聚）。型型号号：GDX-01、-02、-03等等。适适用用于于水水、气气体体及及低低级醇的分析。级醇的分析。第13页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/232)气气-液色谱固定相液色谱固定相 气液色谱固定相气液色谱固定相 固定液固定液+担体（支持体）担体（支持
12、体）：固固定定液液在在常常温温下下不不一一定定为为液液体体，但但在在使使用用温温度度下下一定呈液体状态。一定呈液体状态。固固定定液液的的种种类类繁繁多多，选选择择余余地地大大，应应用用范范围围不不断断扩大。扩大。担担体体：化化学学惰惰性性的的多多孔孔性性固固体体颗颗粒粒，具具有有较较大大的的比比表表面积。面积。第14页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23担体（硅藻土）担体（硅藻土）红色担体红色担体：孔径较小，表孔密集，比表面积较大，机械强度好。适宜分孔径较小，表孔密集，比表面积较大，机械强度好。适宜分离非极性或弱极性组分的试样。离非极性或弱极性组分的试样。缺点缺点:是表面存
13、有活性吸附中心点是表面存有活性吸附中心点白色担体白色担体：煅烧前原料中加入了少量助溶剂煅烧前原料中加入了少量助溶剂(碳酸钠碳酸钠)。颗。颗 粒疏松，孔径较大。粒疏松，孔径较大。表面积较小，机械强度表面积较小，机械强度 较差。但吸附性显著减小，适宜分离极性组较差。但吸附性显著减小，适宜分离极性组分的试样。分的试样。第15页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23C 固定液分类方法固定液分类方法 如按化学结构、极性、应用等的分类方法。如按化学结构、极性、应用等的分类方法。在各种色谱手册中，一般将固定液按有机化合物在各种色谱手册中，一般将固定液按有机化合物的分类方法分为：的分类方法分
14、为：脂肪烃、芳烃、醇、酯、聚酯、脂肪烃、芳烃、醇、酯、聚酯、胺、聚硅氧烷胺、聚硅氧烷等等.第16页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23D、固定液的选择、固定液的选择按极性相似原则选择：固定液与被测组分极性按极性相似原则选择：固定液与被测组分极性“相似相溶相似相溶”，K大，大，选择性好选择性好（1）分离非极性组分）分离非极性组分选非极性固定液，选非极性固定液，按沸点顺序出柱，按沸点顺序出柱，低沸点的先出柱，沸点高后出柱。低沸点的先出柱，沸点高后出柱。（2）分离极性组分）分离极性组分选极性固定液，按极性顺序出柱，极选极性固定液，按极性顺序出柱，极性小的先流出色谱柱，极性强的后出
15、柱。性小的先流出色谱柱，极性强的后出柱。（3）分离非极性和极性的混合组分）分离非极性和极性的混合组分选极性固定液，按选极性固定液，按极性顺序出柱，非极性组分的先流出色谱柱，极性组分的极性顺序出柱，非极性组分的先流出色谱柱，极性组分的后出柱。后出柱。（4）对于能形成氢键的试样，应选用极性或氢键型固定液对于能形成氢键的试样，应选用极性或氢键型固定液，此时此时各组分按形成氢键的能力大小顺序分离。不易形成氢键的各组分按形成氢键的能力大小顺序分离。不易形成氢键的先流出，最易形成氢键的最后流出。先流出，最易形成氢键的最后流出。第17页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23E.E.固定液配
16、比（涂渍量）的选择固定液配比（涂渍量）的选择 配配比比：固固定定液液在在担担体体上上的的涂涂渍渍量量，一一般般指指的的是是固固定定液液与与担担体体的的百百分分比，配比通常在比，配比通常在5%5%25%25%之间。之间。配配比比越越低低，担担体体上上形形成成的的液液膜膜越越薄薄，传传质质阻阻力力越越小小，柱柱效效越高，分析速度也越快。越高，分析速度也越快。配配比比较较低低时时，固固定定相相的的负负载载量量低低，允允许许的的进进样样量量较较小小。分分析析工工作作中通常倾向于使用较低的配比。中通常倾向于使用较低的配比。第18页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23 柱长和柱内径的选
17、择柱长和柱内径的选择 增增加加柱柱长长对对提提高高分分离离度度有有利利（分分离离度度R正正比比于于柱柱长长L2），但但组组分分的保留时间的保留时间tr ，且柱阻力，且柱阻力，不便操作。，不便操作。柱柱长长的的选选用用原原则则是是在在能能满满足足分分离离目目的的的的前前提提下下，尽尽可可能能选选用用较较短短的的柱，有利于缩短分析时间。柱，有利于缩短分析时间。填充色谱柱的柱长通常为填充色谱柱的柱长通常为13米，内径米，内径34厘米。厘米。第19页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23柱温的确定柱温的确定 (1)(1)首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度（超过该温首先应使柱温控制
18、在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）范围之内。式存在）范围之内。(2)(2)柱温升高，分离度下降，色谱峰变窄变高。柱温升高，分离度下降，色谱峰变窄变高。柱温柱温，分离，分离度度，分析时间，分析时间.(3)柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。(4)组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。第20页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23载气种类和流速的选择载气种类和流速的选
19、择1 1)载气种类的选择载气种类的选择 (1)(1)载气摩尔质量大，可抑制试样的纵向扩散，提高柱效。载气摩尔质量大，可抑制试样的纵向扩散，提高柱效。(2)(2)载载气气流流速速较较大大时时，传传质质阻阻力力项项起起主主要要作作用用，采采用用较较小小摩摩尔尔质质量量的的载气载气（如（如H2，He），可减小传质阻力，提高柱效。可减小传质阻力，提高柱效。(3)(3)热热导导检检测测器器需需要要使使用用热热导导系系数数较较大大的的氢氢气气有有利利于于提提高高检检测测灵灵敏敏度度。在氢焰检测器中，在氢焰检测器中，氮气氮气仍是首选目标。仍是首选目标。(4)(4)在在载载气气选选择择时时，还还应应综综合合考
20、考虑虑载载气气的的安安全全性性、经经济济性性及及来来源源是是否否广广泛泛等因素。等因素。2)2)载气流量以载气流量以3080ml/min3080ml/min较为合适较为合适.第21页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23其它操作条件的选择其它操作条件的选择1 1）进样方式和进样量的选择）进样方式和进样量的选择 液体试样采用色谱微量进样器进样，规格有液体试样采用色谱微量进样器进样，规格有1L，5L，10L等。等。进样量应控制在柱容量允许范围及检测器线性检测范围之内。进进样量应控制在柱容量允许范围及检测器线性检测范围之内。进样要求动作快、时间短。样要求动作快、时间短。气体试样应采
21、气体进样阀进样。气体试样应采气体进样阀进样。第22页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/232 2）气化温度的选择）气化温度的选择 色谱仪进样口下端有一气化器，液体试样进样后，在此瞬间气化色谱仪进样口下端有一气化器，液体试样进样后，在此瞬间气化;气化温度一般较柱温高气化温度一般较柱温高3070 防止气化温度太高造成试样分解。防止气化温度太高造成试样分解。第23页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/236、气相色谱检测装置、气相色谱检测装置浓度型检测器：浓度型检测器：测测量量的的是是载载气气中中通通过过检检测测器器组组分分浓浓度度瞬瞬间间的的变变化化，检检测测 信
22、信号号值值与与组组分的浓度成正比。分的浓度成正比。如如热导池检测器热导池检测器、电子捕获检测器等、电子捕获检测器等。质量型检测器：质量型检测器：测测量量的的是是载载气气中中某某组组分分进进入入检检测测器器的的速速度度变变化化，即即检检测测信信号号值值与与单单位位时时间间内内进进入入检检测测器器组组分分的的质质量量成成正正比比。如如氢氢火火焰焰离离子子化化检检测测器器、火焰光度检测器等。、火焰光度检测器等。第24页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23检测器的性能指标检测器的性能指标 一个优良的检测器应具以下几个性能指标：一个优良的检测器应具以下几个性能指标：响应响应迅速，灵敏
23、度高，检出限低，死体积小，线迅速，灵敏度高，检出限低，死体积小，线性范围宽，稳定性好性范围宽，稳定性好。通用性检测器要求适用范围广；选择性检测器要通用性检测器要求适用范围广；选择性检测器要求选择性好。并以这些作为检测器的性能指标。求选择性好。并以这些作为检测器的性能指标。第25页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/237.7.气相色谱法的特点气相色谱法的特点（1）分离效率高分离效率高：复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2 2）灵敏度高：灵敏度高：可以检测出可以检测出g.gg.g-1-1(10(10-6-6)级甚至级甚至ng
24、.gng.g-1-1(10(10-9-9)级的物质量级的物质量.（3）分析速度快：分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4 4）应用范围广：应用范围广：适用于沸点低于适用于沸点低于400400的各种有机或无机试样的分析。的各种有机或无机试样的分析。不足之处：不足之处：不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。被分离组分的定性较为困难。被分离组分的定性较为困难。第26页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/238 气相色谱分析的应用范围气相色谱分析的应用范围气相色谱
25、法应用对象气相色谱法应用对象:气体试样，也可以分析易挥气体试样，也可以分析易挥发或可转化为易挥发的液体或固体，不仅可以分发或可转化为易挥发的液体或固体，不仅可以分析有机物，也可以分析部分无机物。一般说来，析有机物，也可以分析部分无机物。一般说来，只要沸点在只要沸点在500以以下，热稳定性良好，相对分下，热稳定性良好，相对分子量在子量在400以下以下的物质，原则上都可以用气相色谱的物质，原则上都可以用气相色谱分析法。分析法。第27页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23 3 3、简要说明气相色谱分析的基本原理、简要说明气相色谱分析的基本原理4 4、气相色谱仪的基本设备包括哪几部
26、分、气相色谱仪的基本设备包括哪几部分?各有什么作各有什么作用用?5 5、气相色谱法的优缺点。、气相色谱法的优缺点。思思 考考 题题1 1、名词解释：气相色谱法、载气、担体、峰面积、保留、名词解释：气相色谱法、载气、担体、峰面积、保留时间、死时间时间、死时间2 2、请你简述气相色谱法的基本过程。、请你简述气相色谱法的基本过程。第28页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23气相色谱气相色谱就是：流动相为气体的、借在两相间分配原就是：流动相为气体的、借在两相间分配原理而使混合物中各组分分离。理而使混合物中各组分分离。根据组分与固定相与流动相的亲和力不同而实现分离。根据组分与固定相与
27、流动相的亲和力不同而实现分离。组分在固定相与流动相之间不断进行溶解、挥发（气液组分在固定相与流动相之间不断进行溶解、挥发（气液色谱），或吸附、解吸过程而相互分离，然后进入检测色谱），或吸附、解吸过程而相互分离，然后进入检测器进行检测。器进行检测。载气：气象色谱法中的气体流动相担体：化化学学惰惰性性的的多多孔孔性性固固体体颗颗粒粒，具具有有较较大大的的比比表表面面积，是气象色谱法中固定相中的支持体。积，是气象色谱法中固定相中的支持体。峰面积峰面积（A）：峰与峰底围成的面积。）：峰与峰底围成的面积。保留时间保留时间（tr）：组分从进样到出现峰最大值时所需时间。）：组分从进样到出现峰最大值时所需时间
28、。死死时时间间（t tr r0 0）：不不与与固固定定相相作作用用的的气气体体（如如空空气气）的的保保留留时间。时间。第29页，本讲稿共30页2022/10/232022/10/23气路系统进样系统、分离系统、温控系统以及检测和记录气路系统进样系统、分离系统、温控系统以及检测和记录系统系统气相色谱仪具有一个让载气连续运行气相色谱仪具有一个让载气连续运行 管路密闭的气路系统管路密闭的气路系统 进样系统包括进样装置和气化室其作用是将液体或进样系统包括进样装置和气化室其作用是将液体或固体试样，在进入色谱柱前瞬间气化，固体试样，在进入色谱柱前瞬间气化，然后快速定量地转入到色谱柱中然后快速定量地转入到色谱柱中第30页，本讲稿共30页