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1、溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定第1页，本讲稿共24页溶菌酶的来源：1922年的一天，正在感冒的英国细菌学家Alexander Fleming发现，把一些鼻粘液加入细菌的培养基后会引起细胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质被认为是一种酶，Fleming命名其为溶菌酶（Lysozyme）。那时，溶菌酶不能证明有临床价值。但是在酶机制的研究学习方面，溶菌酶扮演了一个很重要的角色。第2页，本讲稿共24页溶菌酶的结构在1965年,David Phillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射线晶体（X-ray crystallography）结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构(t
2、ertiary structure)。第3页，本讲稿共24页溶菌酶的作用机制：溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，该酶可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，使内容物溢出而是细菌溶解，阻碍致病细菌的活性繁殖，并杀死细菌。第4页，本讲稿共24页溶菌酶的制备实验原理实验材料、试剂及仪器实验步骤实验看法第5页，本讲稿共24页溶菌酶的制备本实验主要是以鸡蛋清作为实验材料，采用D152型树脂柱层析法除去杂蛋白及等电点法提取溶菌酶的粗品第6页，本讲稿共24页溶菌酶的制备：鸡蛋清中约含有0.3的溶菌酶，分子量为14，
3、000，等电点为11.1，最适溶菌温度为50，最适pH值为7。鸡蛋清溶菌酶化学性质非常稳定，当pH值在1.211.3范围内剧烈变化时，其结构仍稳定不变，遇热时该酶也很稳定，在pH47的范围内，100处理lmin，仍保持原酶活性。但在碱性环境中，该酶对热稳定性较差。其一级结构由129个氨基酸残基组成的一条多肽链，其稳定性主要与多级结构中的4对二硫键、氢键及疏水键相互作用。人溶菌酶的溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。第7页，本讲稿共24页溶菌酶的制备实验主要仪器、材料及试剂：（一）主要仪器：高速冷冻离心机、恒流泵、部分收集器（二）材料及仪器：D152大孔弱酸性阳离子交换树脂，新鲜鸡蛋，0.1mol/L
4、磷酸盐缓冲剂，pH7.0,氯化钠，硫酸铵，0.5mol/L NaOH,0.5mol/L HCl,层析柱（2.6cm*30cm）,无水乙醇 ，聚乙二醇第8页，本讲稿共24页溶菌酶的制备实验步骤：蛋清样品的制备：取出蛋清，加入1.5倍体积的0.1mol/L磷酸盐缓冲剂，搅拌均匀，将pH值调至8左右，然后用八层纱布过滤，去滤液，量取体积并记录。第9页，本讲稿共24页溶菌酶的制备实验步骤：阳离子交换层析的制备：1、D152树脂的处理：将D152树脂先将蒸馏水洗去杂物，滤除，用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌48h，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗近pH7.5左右，抽滤干，再用1mol/L HCl按上述方
5、法处理树脂，知道全部转变为氢型，抽滤干HCl，用2mol/L NaOH处理树脂，是指转变为钠型，pH值不低于6.5。吸干溶液，加0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。2、装柱：取直径为2.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理过的上述树脂悬浮液，关闭层析柱出口，带树脂沉降后，放过量的溶液，再加上一些树脂，至树脂沉积至1520cm高度即可。与柱子顶部继续加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。最终是流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持页面高出树脂表面1cm。第10页，本讲稿共24页溶菌酶的制备装柱吸附：将上述蛋清液仔细加入到树脂顶部，打开出口
6、使其缓慢流如注内，流速为1ml/min。去杂蛋白：取出树脂，用柱平衡液洗去树脂上可能有的杂蛋白。在手机洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检测杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5、浓度为0.02mol/L 磷酸钠缓冲液洗脱收集洗脱液！聚乙二醇浓缩：将上诉洗脱液合并装入透析袋内，至容器外，外面附以聚乙二醇，容器加盖。酶液中的水分很快就透析到膜外，被聚乙二醇所吸收。然后所得浓缩液之后的透析袋用蒸馏水洗去透析袋膜外的聚乙二醇！小心取的浓缩版的溶菌酶溶液第11页，本讲稿共24页实验看法：与教科书P488页制备方法不同的是：教材所选用的吸附方法使用磁力搅拌器
7、搅拌蛋清液和树脂，个人觉得此方法可以用于样品较小的情况下，大约在300毫升以下！第12页，本讲稿共24页溶菌酶活力、蛋白浓度的测定实验原理实验仪器、材料及试剂试剂配制实验步骤第13页，本讲稿共24页溶菌酶活力、蛋白浓度的测定实验仪器、材料及试剂：（一）仪器：721分光光度计 (二)材料及试剂：溶菌酶，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，溶壁微球菌干粉，氯化钠，考马斯亮蓝G-250,95%乙醇，85%磷酸，牛血清蛋白（BSA）第14页，本讲稿共24页溶菌酶蛋白浓度的测定实验原理：棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色的复合物最大吸光度由465nm变为595nm。在一定蛋白浓度范围内，蛋白和
8、染料的结合符合比尔定律。通过测定595nm处的光吸收值的增加量，可对蛋白质浓度进行定量测定。第15页，本讲稿共24页溶菌酶活力、蛋白浓度的测定试剂的配制：1、测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.2。2、底物浓度：40mg溶壁微球菌干粉，荣誉100mL测活缓冲液中。3、考马斯亮蓝G-250试剂;考马斯亮蓝G-250 100mL 95%乙醇中，加入100mL 85%盐酸，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。4、标准蛋白质溶液，用含有0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0(缓冲液A)配制1mg/mL牛血清蛋白溶液。5、溶菌酶液配制：取上述实验中所获得的
9、溶菌酶粗品液，荣誉100mL的测活缓冲液。第16页，本讲稿共24页溶菌酶蛋白浓度的测定实验步骤标准曲线的测定：取14支试管按下表，分两组进行平行操作：管号管号0 01 12 23 34 45 56 6标准蛋白标准蛋白溶液溶液/mL/mL0.00 0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04 0.04 0.05 0.05 0.06 0.06 缓冲液缓冲液A/mLA/mL0.10 0.10 0.09 0.09 0.08 0.08 0.07 0.07 0.06 0.06 0.05 0.05 0.04 0.04 考马斯亮考马斯亮蓝蓝G-G-250/mL250/mL5.
10、00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 摇匀，摇匀，1h1h内以内以0 0号管为空白对照，在号管为空白对照，在595nm595nm处比色处比色A A295295第17页，本讲稿共24页溶菌酶蛋白浓度的测定按上表的数据，以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。测定未知样品的蛋白质浓度：测定方法同上。去合适的未知样品提及，使其测定值在标准曲线的线性范围内。根据所测定的A595值，在标准曲线上查处相当于标准蛋白的Laing，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）第18页，本讲稿共24
11、页溶菌酶蛋白浓度的测定实验备注：若样品浓度超出了标准曲线的线性范围，则适当加以稀释，稀释至标准曲线的线性范围之内的浓度！第19页，本讲稿共24页溶菌酶活力的测定实验原理：本实验以溶壁微球菌为底物，通过测定细菌悬液浊度的变化（OD600）来测定溶菌酶的活性第20页，本讲稿共24页溶菌酶活力的测定酶活力的测定：在室温下，取2个试管，分别在1号管中加入3.0mL测活缓冲液，2.5mL底物浓度；2号管中加入2.5mL测活缓冲液，2.5mL酶液。以2号管为对照，根据不同反应时间内在721分光光度计上每隔30s测定1号650nm处的吸光值。按下列表格记录是按结果：时间时间/s/s0 03030606090
12、90120120150150180180ODOD650650第21页，本讲稿共24页溶菌酶活力的测定实验数据处理酶活力单位（U）：没在温室pH6.2条件下，OD650每分钟强大0.001为1个酶活力单位U。比活力=活力单位/mg蛋白根据测得结果，计算各步数据填入下表：组分组分体积体积/mL/mL蛋白蛋白/mg*mL/mg*mL-1-1总蛋白总蛋白/mL/mL活力活力/U*mg/U*mg-1-1比活力比活力/U*mg/U*mg-1-1提纯倍提纯倍数数回收率回收率1 1100%100%第22页，本讲稿共24页参考文献：生物与制药工程实验 主编：万海同 浙江大学出版社 P89-94生物制药工艺学 主编：吴梧桐 中国医药科技出版社 P488-489第23页，本讲稿共24页第24页，本讲稿共24页