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1、基因工程工具酶基因工程工具酶第1页，本讲稿共86页基因工程的工具酶基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是应用于基因工程的各种酶的）是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取重组体建、目的基因选取重组体DNA制备等程序中所需制备等程序中所需要的酶类。要的酶类。第2页，本讲稿共86页基因工程常用的工具酶n n限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶主要用于主要用于主要用于主要用于DNADNA分子的特异切割分子的特异切割分子的特异切割分子的特异
2、切割 n nDNADNA甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶用于用于用于用于DNADNA分子的甲基化分子的甲基化分子的甲基化分子的甲基化 n n核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶用于用于用于用于DNADNA和和和和RNARNA的非特异性切割的非特异性切割的非特异性切割的非特异性切割 n n核酸聚合酶核酸聚合酶核酸聚合酶核酸聚合酶用于用于用于用于DNADNA和和和和RNARNA的合成的合成的合成的合成 n n核酸连接酶核酸连接酶核酸连接酶核酸连接酶用于用于用于用于DNADNA和和和和RNARNA的连接的连接的连接的连接 n n核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于用于用于用于DNADNA
3、和和和和RNARNA的末端修饰的末端修饰的末端修饰的末端修饰 n n其其其其它它它它酶酶酶酶类类类类-用用用用于于于于生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞的的的的破破破破壁壁壁壁、转转转转化化化化、核核核核酸酸酸酸纯纯纯纯化化化化、检测等。检测等。检测等。检测等。第3页，本讲稿共86页第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）第4页，本讲稿共86页一、定义一、定义二、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点五、限制酶的特点六、酶切反应条件六、酶切反
4、应条件七、限制酶的星星活性（七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途八、限制酶的用途 第5页，本讲稿共86页限制性内切酶限制性内切酶(restriction endonuclease)是一是一类能识别双链类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸每条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。酶。第6页，本讲稿共86页一、定义一、定义二、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点五、限制酶的特点六、酶切反应条件六
5、、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途八、限制酶的用途 第7页，本讲稿共86页1限制与修饰系统限制与修饰系统 上世纪上世纪50年代发现年代发现类似于人体的免疫系统，限制与修饰系统是细类似于人体的免疫系统，限制与修饰系统是细菌排除异物保护自身的防御机制：菌排除异物保护自身的防御机制：限制限制酶切外源酶切外源DNA修饰修饰甲基化自身的内切酶识别位点甲基化自身的内切酶识别位点第8页，本讲稿共86页 噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。时会受到限制。E.coli E.coli 菌株
6、菌株菌株菌株 噬菌体感染率噬菌体感染率噬菌体感染率噬菌体感染率 KK B B C CE.coli E.coli KK1 11010-4-41010-4-4E.coli E.coli B B1010-4-41 11010-4-4E.coliE.coli C C1 11 11 1 K 和和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来菌株中存在一种限制系统，可排除外来的的 DNA。而。而 C 菌株不能限制来自菌株不能限制来自 K 和和 B 菌株菌株的的 DNA。第9页，本讲稿共86页2限制酶的发现限制酶的发现Werner Arber于于1962-1968年发现限制与修饰年发现限制与修饰体系，体系，196
7、8年分离得到年分离得到I型限制酶。型限制酶。1970 年，年，H.Smith 首次从流感嗜血杆首次从流感嗜血杆菌菌（H.influenzae）中发现并分离到中发现并分离到 Hind 限制酶。限制酶。1971年，年，D.Nathans用用HindII绘制了绘制了猿猴病毒猿猴病毒SV40的限制酶谱。的限制酶谱。第10页，本讲稿共86页到到1986 年下半年，发现年下半年，发现 615 种限制酶和种限制酶和 98 种甲基化酶。种甲基化酶。到到 2006 年年2 月，共发现月，共发现 4583 种限制酶种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有和甲基化酶，其中限制酶有 3773 种，种，型、型、型和型和型限制酶
8、各有型限制酶各有 68、3692、10 种。种。第11页，本讲稿共86页一、定义一、定义二、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点五、限制酶的特点六、酶切反应条件六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途八、限制酶的用途 第12页，本讲稿共86页限制酶的生物学功能是保护宿主不受外来限制酶的生物学功能是保护宿主不受外来DNA的感的感染，降解外来的染，降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。，从而阻止其复制和整合到细胞中。与
9、限制酶伴生的修饰酶多是甲基转移酶或甲基化与限制酶伴生的修饰酶多是甲基转移酶或甲基化酶，能保护自身的酶，能保护自身的DNA不被降解。它们与对应的限制不被降解。它们与对应的限制酶识别相同的序列，但其作用不是切割酶识别相同的序列，但其作用不是切割DNA，而是在，而是在两条链上对某个碱基进行甲基化。两条链上对某个碱基进行甲基化。限制酶与甲基转移酶组成限制酶与甲基转移酶组成限制与修饰系统限制与修饰系统。第13页，本讲稿共86页根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为三类。因子，限制与修饰系统至少可分为三类。酶分子酶分子
10、酶分子酶分子内切酶与甲基化酶内切酶与甲基化酶内切酶与甲基化酶内切酶与甲基化酶分子不在一起分子不在一起分子不在一起分子不在一起三亚基三亚基三亚基三亚基双功能酶双功能酶双功能酶双功能酶二亚基二亚基二亚基二亚基双功能酶双功能酶双功能酶双功能酶识别位点识别位点识别位点识别位点4-6bp,4-6bp,大多数为回文对称结构大多数为回文对称结构大多数为回文对称结构大多数为回文对称结构二分非对称二分非对称二分非对称二分非对称5-7bp 5-7bp 非对称非对称非对称非对称切割位点切割位点切割位点切割位点在识别位点中或靠近识别位点在识别位点中或靠近识别位点在识别位点中或靠近识别位点在识别位点中或靠近识别位点无特
11、异性，至少在识无特异性，至少在识无特异性，至少在识无特异性，至少在识别位点外别位点外别位点外别位点外 1000bp 1000bp在识别位点下在识别位点下在识别位点下在识别位点下游游游游 24-26bp 24-26bp限制反应与甲基限制反应与甲基限制反应与甲基限制反应与甲基化反应化反应化反应化反应分开的反应分开的反应分开的反应分开的反应互斥互斥互斥互斥同时竞争同时竞争同时竞争同时竞争限制作用是否需限制作用是否需限制作用是否需限制作用是否需用用用用 ATP ATPNoNoYesYesYesYes第14页，本讲稿共86页在三个限制与修饰系统中，只有在三个限制与修饰系统中，只有II型限制型限制酶与甲基
12、化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。而被广泛用于基因工程中。型在限制与修饰系统所占的比例达到型在限制与修饰系统所占的比例达到 93%。它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割切割DNA，产生带，产生带 3-羟基和羟基和 5-磷酸基团的磷酸基团的DNA产物，需产物，需Mg2+的存在才能发挥活性，相的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需应的修饰酶只需SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。识别腺苷甲硫氨酸）。识别序列一般为序列一般为 4-6bp，切割位置因酶而异。，切割位置因酶而异。第15页，本讲
13、稿共86页一、定义一、定义二、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点五、限制酶的特点六、酶切反应条件六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途八、限制酶的用途 第16页，本讲稿共86页限制性内切酶的命名由三部分构成，即限制性内切酶的命名由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。菌种名、菌系编号、分离顺序。Hind前三个字母来自于菌种名称前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示菌系为型表示菌系为型血清型；血清型
14、；“”表示分离到的第三个表示分离到的第三个限制酶限制酶EcoRIEscherichia coli RI 第17页，本讲稿共86页一、定义一、定义二、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点五、限制酶的特点六、酶切反应条件六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途八、限制酶的用途 第18页，本讲稿共86页 1.识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点（1）限制酶识别序列的长度）限制酶识别序列的长度 限制性内切酶在双链限制性内切酶在双链D
15、NA上能够识别上能够识别的特殊核苷酸序列被称为的特殊核苷酸序列被称为识别序列识别序列。识别。识别序列的长度一般为序列的长度一般为 48 个碱基，最常见个碱基，最常见的为的为 6 个碱基。个碱基。切割频率理论上为切割频率理论上为 1/4n（n为识别序列为识别序列长度），实际上与序列有关。长度），实际上与序列有关。第19页，本讲稿共86页（2）限制酶识别序列的结构）限制酶识别序列的结构 限制酶识别序列大多具有回文对称结构限制酶识别序列大多具有回文对称结构 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 有些限制酶的识别序列不对称有些限制酶的识别序列不对称 AccBS C
16、 C G C T C G G C G A G 第20页，本讲稿共86页有些限制酶可识别多种序列有些限制酶可识别多种序列 有些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序有些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。列之间含有若干个任意碱基。AlwN C A G N N N C T G G T C N N N G A C Acc G T M K A C C A K M T G 第21页，本讲稿共86页（3）限制酶切割的位置）限制酶切割的位置 限制酶对限制酶对 DNA 的切割位置大多的切割位置大多数在识别序列内部，但也有在外部的。数在识别序列内部，但也有在外部的。第22页，本讲稿共86页2
17、末端种类末端种类（1）黏性末端（）黏性末端（cohesive end）识别位点为回文对称结构的序列经限识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为黏性末端，这样制酶切割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。形成的两个末端是相同的，也是互补的。第23页，本讲稿共86页第24页，本讲稿共86页（2）平末端（）平末端（Blunt end）在回文对称轴上同时切割在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，的两条链，则产生平末端。则产生平末端。如如 Hae（GGCC）和）和 EcoRV（GATATC）。）。第25页，本讲稿共86页（3）非对称突出端）非对称突出端 当
18、识别序列为非对称序列时，切割的当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的。产物的末端是不同的。BbvCC C T C A G CG G A G T C GC C T C A G CG G A G T C G第26页，本讲稿共86页（4）同裂酶（）同裂酶（isoschizomer）识别相同序列的限制酶称识别相同序列的限制酶称同裂酶同裂酶，但，但它们的切割位点可能不同。它们的切割位点可能不同。同序同切同序同切同序异切同序异切 同功多位同功多位 识别序列有交叉识别序列有交叉 第27页，本讲稿共86页（5）同尾酶）同尾酶 许多不同的限制酶切割许多不同的限制酶切割 DNA 产生产生的末
19、端是相同的，且是对称的，即它们可的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的黏性突出末端，这些酶统称为产生相同的黏性突出末端，这些酶统称为同尾酶同尾酶。这些酶切割这些酶切割 DNA 得到的产物可进行得到的产物可进行黏端连接。黏端连接。第28页，本讲稿共86页3.DNA末端长度对限制酶切割的影响末端长度对限制酶切割的影响 限制酶切割限制酶切割 DNA 时对识别序列两时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。第29页，
20、本讲稿共86页4.位点偏爱（位点偏爱（Site preference）某些限制酶对不同位置的同一个识别某些限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作序列表现出不同的切割效率的现象称作位位点偏爱点偏爱。噬菌体 DNA全长48,502bp，有5个EcoR酶切位点。切割时并非在 5 个位点随机进行，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快 10 倍。第30页，本讲稿共86页 造成位点偏爱现象的原因造成位点偏爱现象的原因 限制酶在切割限制酶在切割DNA之前需要同时与两个识别之前需要同时与两个识别位点作用；位点作用；限制酶对要求作用的限制酶对要求作用的DNA序列有两个明显不序列有两个明显
21、不同的结合位点，其中一个是为同的结合位点，其中一个是为DNA切割时激切割时激活另一个的变构位点。活另一个的变构位点。第31页，本讲稿共86页一、定义一、定义二、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点五、限制酶的特点六、酶切反应条件六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途八、限制酶的用途 第32页，本讲稿共86页对任意一个限制酶来说，都有其各自的最对任意一个限制酶来说，都有其各自的最佳反应条件。佳反应条件。q缓冲液缓冲液 q反应
22、温度反应温度 q反应时间反应时间 q酶切反应的终止酶切反应的终止 第33页，本讲稿共86页一、定义一、定义二、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点五、限制酶的特点六、酶切反应条件六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途八、限制酶的用途 第34页，本讲稿共86页在极端非标准条件下，限制酶能切割在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称性称星星活性星星活性。实际上
23、星星活性是限制性内切酶的一般性实际上星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。切割非典型位点。第35页，本讲稿共86页引起星星活性的因素引起星星活性的因素 o甘油浓度高（甘油浓度高（5%）o限制酶过量（限制酶过量（100U/l）o离子强度低（离子强度低（8.0）o反应体系含反应体系含DMSO、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等有机溶剂胺、二甲基甲酰胺等有机溶剂oMg+被其它二价阳离子如被其它二价阳离子如 Mn+、Cu+、Co+或或 Zn+代替代替第36页，本讲稿共86页抑制星星
24、活性的措施抑制星星活性的措施 o减少酶的用量（可避免过分酶切）减少酶的用量（可避免过分酶切）o减少甘油浓度减少甘油浓度o保证反应体系中无有机溶剂或乙醇保证反应体系中无有机溶剂或乙醇o提高离子强度到提高离子强度到 100150mM（但不能抑（但不能抑制酶活性）制酶活性）o降低反应降低反应 pH 至至 pH7.0 o保证使用保证使用 Mg+作为二价阳离子作为二价阳离子第37页，本讲稿共86页一、定义一、定义二、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点五、限制酶的特点六、酶切反应条件六、酶切反应条
25、件七、限制酶的星星活性（七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途八、限制酶的用途 第38页，本讲稿共86页DNA重组重组限制酶（物理）图谱绘制限制酶（物理）图谱绘制突变分析（突变分析（RFLP分析）分析）限制酶的部分酶切与完全酶切限制酶的部分酶切与完全酶切第39页，本讲稿共86页第二节第二节甲基化酶甲基化酶（Methylase）第40页，本讲稿共86页一、甲基化酶的种类与识别序列一、甲基化酶的种类与识别序列二、甲基化对限制酶切的影响二、甲基化对限制酶切的影响第41页，本讲稿共86页原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的
26、一员，用于保护宿主于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。不被相应的限制酶所切割。1.限制修饰系统限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。甲基腺嘌呤。在在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。点可同可不同。M.EcoRI GA
27、mATTCC EcoRI G AATTC 不同不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同相同第42页，本讲稿共86页2.E.coli 的的dam、dcm甲基化酶甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。的限制修饰系统。Dam 甲基化甲基化酶可在可在 GATC 序列中的腺序列中的腺嘌呤呤 N6 位置上引入甲基。位置上引入甲基。G mATCDcm 甲基化甲基化酶识别 CCAGG 或或 CCTGG 序序列，在第二个胞列，在第二个胞嘧啶 C 的的 C5 位置上引入甲基。位置上引入甲基。C mCAGG C mCTGG 第43页，本讲稿
28、共86页该酶可使该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与基化反应与DNA复制、基因转录等过程复制、基因转录等过程有关。有关。3.哺乳动物的甲基化酶哺乳动物的甲基化酶第44页，本讲稿共86页E.coli 中至少有中至少有 3 种依赖于甲基化的限制种依赖于甲基化的限制系统系统 mcrA、mcrBC 和和 mrr，它们识别的序列，它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列，都降解各不相同，但只识别经过甲基化的序列，都降解由由 CpG 甲基化酶（甲基化酶（M Sss）作用的）作用的 DNA。4.E.coli中依赖于甲基化的限制修饰系统中依赖于甲基化的限制修饰系统第45页
29、，本讲稿共86页一、甲基化酶的种类与识别序列一、甲基化酶的种类与识别序列二、甲基化对限制酶切的影响二、甲基化对限制酶切的影响第46页，本讲稿共86页1修饰酶切位点修饰酶切位点M.Taq 处理处理 DNA 后，后，GTCGAC 将不将不受受 Hinc 切割。切割。GTCGACGTCAACGTTGACGTTAACHincM.Taq TCGA第47页，本讲稿共86页2产生新的酶切位点产生新的酶切位点Dpn 是依赖甲基化的限制酶，是依赖甲基化的限制酶，TCGATCGA 受受 M.Taq 处理后形成甲基处理后形成甲基化（化（A）产物）产物 TCG*ATCG*A，其中，其中 G*ATC 即为即为 Dpn
30、位点。位点。第48页，本讲稿共86页第三节第三节 DNA 聚合酶聚合酶（DNA polymerase）第49页，本讲稿共86页DNADNADNADNA聚合酶指的是在聚合酶指的是在聚合酶指的是在聚合酶指的是在DNA(DNA(DNA(DNA(或或或或RNA)RNA)RNA)RNA)模板指导下，以模板指导下，以模板指导下，以模板指导下，以4 4 4 4种种种种dNTPdNTPdNTPdNTP为底物，在引物为底物，在引物为底物，在引物为底物，在引物3-OH3-OH3-OH3-OH末端聚合末端聚合末端聚合末端聚合DNADNADNADNA链的一类链的一类链的一类链的一类酶。酶。酶。酶。特点：特点：需模板需
31、模板(DNA或或RNA)需引物需引物 聚合方向聚合方向53 同时具有同时具有35和外切和外切53外切作用外切作用第50页，本讲稿共86页目前已开发的目前已开发的DNA聚合酶聚合酶vDNA聚合酶聚合酶(全酶全酶)(E.coli)vKlenow片段片段(E.coli)vTDNA聚合酶聚合酶vTDNA聚合酶聚合酶vTaqDNA聚合酶聚合酶(耐热耐热)vDNA末端转移酶末端转移酶(小牛胸腺小牛胸腺)v反转录酶反转录酶(依赖依赖RNA)聚合酶聚合酶依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶不依赖不依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶第51页，本讲稿共86页 一一.E.coli
32、DNA聚合酶聚合酶I（polI）Pol I 参与参与DNA修复，具修复，具35和和53外切酶活性外切酶活性pol II 参与参与DNA修复，具修复，具35外切酶活性外切酶活性pol III 参与参与DNA复制，具复制，具35和和53外切酶活性外切酶活性 1.E.coli 的的DNA聚合酶系统聚合酶系统第52页，本讲稿共86页 2.E.coli DNA 聚合酶聚合酶的活性的活性 5-3 DNA 聚合酶活性聚合酶活性5-3 外切核酸酶活性外切核酸酶活性3-5 外切酶活性外切酶活性交换反应交换反应 第53页，本讲稿共86页3.E.coli DNA 聚合酶聚合酶的用途的用途1）切口平移法制备探针）切口
33、平移法制备探针Mg+DNase dNTPE.coli DNA Pol 第54页，本讲稿共86页2）用于）用于 cDNA 克隆中的第二链，即单纯的克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性。聚合活性。3）对对 3 突出端的突出端的 DNA 作末端标记作末端标记 Mg+,DNA Pol I -32P dATP AT第55页，本讲稿共86页二、二、Klenow DNA 聚合酶聚合酶 Klenow DNA 聚合酶是聚合酶是 E.coli DNA pol经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去中除去 5-3 外切活性的肽段后的大片段肽段，外切活性的肽段后的大片段
34、肽段，而聚合活性和而聚合活性和 3-5 外切活性不受影响。也外切活性不受影响。也称为称为 Klenow 片段，或片段，或 E.coli DNA 聚合酶聚合酶大大片段。片段。第56页，本讲稿共86页 补平补平 3 凹端凹端 DNA。抹平抹平 DNA 3凸端。凸端。通过置换反应对通过置换反应对 DNA 进行末端标记。进行末端标记。在在 cDNA 克隆中合成第二链。克隆中合成第二链。随机引物标记。随机引物标记。应用于双脱氧链末端终止法应用于双脱氧链末端终止法 DNA 测序。测序。应用于应用于 PCR 反应。反应。在体外诱变中，用于从单链模板合成双链在体外诱变中，用于从单链模板合成双链 DNA。Kle
35、now酶功能酶功能第57页，本讲稿共86页三、三、T4 噬菌体噬菌体 DNA 聚合酶聚合酶来源：来源：T4噬菌体感染的噬菌体感染的E.coli结构：结构：MW=114000d活性：活性：53聚合反应；聚合反应；35外切活性（活性比外切活性（活性比Klenow酶大酶大200倍，且对单链倍，且对单链DNA活性大于双链活性大于双链DNA）第58页，本讲稿共86页用途：用途：填补或标记限制酶切后产生的填补或标记限制酶切后产生的5-粘性末端的粘性末端的3-凹缺末端凹缺末端5533补齐或末端标记，补齐或末端标记，同于同于Klenow5533 3-粘性末端的标记制备粘性末端的标记制备DNA探针，同探针，同
36、Klenow 末端标记末端标记 延伸结合于单链延伸结合于单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物。模板上的诱变寡核苷酸引物。D诱变引物诱变引物T T4 4 DNA聚合酶聚合酶诱变诱变DNA第59页，本讲稿共86页四、四、T7 噬菌体噬菌体 DNA 聚合酶聚合酶来源：来源：T7噬菌体感染的噬菌体感染的E.coli结构：由结构：由2个蛋白亚基组成：个蛋白亚基组成：T7噬菌体基因噬菌体基因5编码的编码的蛋白蛋白&宿主硫氧蛋白宿主硫氧蛋白活性：活性：53聚合，在所有聚合，在所有DNA聚合酶中持续反应时间聚合酶中持续反应时间最长，所以合成最长，所以合成 的的DNA链较长，在链较长，在DNA测测序中有很大优越性
37、；序中有很大优越性；35外切活性（由外切活性（由 T噬菌体基因噬菌体基因5编码，编码，是是Klenow酶的酶的 1000倍。倍。）第60页，本讲稿共86页用途：用途：复制较长的模板，在测序中可读出较长的复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列序列55333355与与T TDNA polDNA pol一样，平齐粘性末端。一样，平齐粘性末端。定点突变中互补链的合成。定点突变中互补链的合成。用填补或交换反应快速进行末端标记。用填补或交换反应快速进行末端标记。第61页，本讲稿共86页测序酶（测序酶（Sequenase）测序酶是美国测序酶是美国 United States Biochemical 公司改
38、公司改造的造的 T7 噬菌体噬菌体 DNA 聚合酶，切除了聚合酶，切除了 99%以上的以上的 3-5外切活性。外切活性。改进的改进的Sequenase 2.0则切除了所有的则切除了所有的 3-5 外外切活性，是用双脱氧链终止法对长片段进行测序的切活性，是用双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。理想用酶。第62页，本讲稿共86页五、五、TaqDNA聚合酶（耐热）聚合酶（耐热）分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度，最适反应温度75，对对95高温具良好稳定性，该酶不存在高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性。外切酶活性。1.特点：特点：第63页，本讲
39、稿共86页2.用途：用途：PCR反应；反应；测序，高温下进行测序，高温下进行DNA合成可减合成可减少模板二级结构。少模板二级结构。第64页，本讲稿共86页六、六、DNA末端转移酶末端转移酶 分子克隆中常用的分子克隆中常用的末端转移酶末端转移酶来源于小牛胸腺，是来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不依赖于模板的种不依赖于模板的 DNA 聚合酶。聚合酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化在二价阳离子存在下，末端转移酶催化 dNTP 加于加于 DNA 分子的分子的 3 羟基端，形成同聚物末端。若羟基端，形成同聚物末端。若 d
40、NTP 为为 T 或或 C，此二价阳离子首选，此二价阳离子首选 Co2+；若；若 dNTP 为为 A 或或 G 此二价阳离子首选此二价阳离子首选 Mg2+。第65页，本讲稿共86页 克隆克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。便于与载体连接。用途：用途：末端标记末端标记第66页，本讲稿共86页七、反转录酶七、反转录酶 反转录酶即依赖于反转录酶即依赖于 RNA 的的 DNA 聚合酶，聚合酶，它有它有 5-3 合成合成 DNA 活性，但是无活性，但是无 3-5 外外切活性。切活性。它来自它来自 AMV（禽成髓细胞瘤病毒）或（禽成髓细胞瘤病毒）或 Mo-MLV（
41、Moloney 鼠白血病病毒，又称鼠白血病病毒，又称 M-MuLV）。）。第67页，本讲稿共86页用途：用途：合成合成cDNA，克隆至载体中；，克隆至载体中；黏性末端补平、标记；黏性末端补平、标记；双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。可使用反转录酶。第68页，本讲稿共86页第四节第四节 其它分子克隆工具酶其它分子克隆工具酶第69页，本讲稿共86页一、依赖于一、依赖于 DNA 的的 RNA 聚合酶聚合酶 来源：来源：SP6 噬菌体噬菌体 RNA 聚合酶（来源于感染鼠聚合酶（来源于感染鼠伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌 LT2 菌株）；菌株）；T4 或或 T
42、7 噬菌体噬菌体 RNA 聚合酶（来源于噬聚合酶（来源于噬菌体感染的大肠杆菌）。菌体感染的大肠杆菌）。第70页，本讲稿共86页 RNA 聚合酶实际上就是转录中的聚合酶实际上就是转录中的 RNA 合合成酶，识别成酶，识别 DNA 中各自特异的启动子序列，并中各自特异的启动子序列，并沿此沿此 dsDNA 模板起始模板起始 RNA 的合成。无需引物，的合成。无需引物，但需识别特异性位点。但需识别特异性位点。活性：活性：体外合成体外合成 RNA 分子。分子。用于表达外源基因。用于表达外源基因。用途：用途：第71页，本讲稿共86页二、连接酶二、连接酶（Ligase）催化双连催化双连DNA片段紧靠在一起的
43、片段紧靠在一起的3羟基和羟基和5磷酸集团末端之间形成磷酸二酯磷酸集团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。键，使两末端连接。第72页，本讲稿共86页1.T4 DNA连接酶连接酶PO43-5mM,NaCl25mM,Ca+0.1mM只连接只连接ds-DNA分子，要求分子，要求3-羟基和羟基和5-磷磷酸基酸基 特点特点用途用途1)相同或相容粘性末端的连接相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连平整末端的相连抑制剂抑制剂第73页，本讲稿共86页只能连接具黏性末端只能连接具黏性末端DNA分子，以分子，以NAD作辅助作辅助因子因子2.E.coli DNA连接酶连接酶T4 RNA 连接酶可以催化单链连接酶
44、可以催化单链 DNA 或或 RNA 的的 5-磷酸与另一单链磷酸与另一单链 DNA 或或 RNA 的的 3 羟基之间形成羟基之间形成共价连接。共价连接。3.T4 RNA连接酶连接酶第74页，本讲稿共86页三、三、T4 多核苷酸激酶多核苷酸激酶 1.催化反应类型催化反应类型1)激酶活性（激酶活性（5-磷酸化酶）：可将磷酸化酶）：可将ATP中的中的位的磷酸位的磷酸基转移到基转移到ss-DNA，ds-DNA和和RNA分子的分子的5-羟基端羟基端2)3-磷酸酶活性（磷酸酶活性（pH 5-6）1)5-端末端标记端末端标记 2)分子克隆过程中以获得分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，便磷酸基末端，便于连接
45、酶反应于连接酶反应2.用途用途第75页，本讲稿共86页四、碱性磷酸酶四、碱性磷酸酶 1)载体载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率以增加重组频率2)核酸末端标记核酸末端标记1.特点特点1)除去除去ss-DNA，ds-DNA 和和RNA分子分子两端的两端的3-和和5-磷酸基磷酸基2)对热稳定对热稳定2.用途用途第76页，本讲稿共86页五、核酸酶五、核酸酶 BAL31 核酸酶来源于交替单胞菌（核酸酶来源于交替单胞菌（A.espejiana）BAL31，主要活性为，主要活性为 3 外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，可从线性可从线性 DNA 两条链的两条链的 3 端
46、迅速去除单核苷酸，端迅速去除单核苷酸，随后可从单链随后可从单链 DNA 内部发挥缓慢的内切酶活性，内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短了的平端双链形成截短了的平端双链 DNA 分子（约占分子（约占 10-20%）以及带有约以及带有约 5 个核苷酸突出单链的截短分子（约占个核苷酸突出单链的截短分子（约占 80-90%）。）。反应依赖反应依赖 Ca+，EDTA 可抑制其活性。可抑制其活性。1BAL31 核酸酶核酸酶第77页，本讲稿共86页Sl 核酸酶来源于米曲霉（核酸酶来源于米曲霉（A.oryzae），可降解），可降解单链单链 DNA 或或 RNA，是一种单链核酸酶。对，是一种单链核酸酶。对 dsD
47、NA、dsRNA 和和 DNA:RNA 杂交体不敏感。杂交体不敏感。用于分析用于分析 DNA:RNA 杂交体的结构，去掉双链杂交体的结构，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链 cDNA 合成中产生的发荚环。合成中产生的发荚环。2Sl 核酸酶核酸酶第78页，本讲稿共86页RNaseA 来源于牛胰，为内切核酸酶，可特来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击异攻击 RNA 上嘧啶残基的上嘧啶残基的 3端。端。可除去可除去 DNA:RNA 中未杂交的中未杂交的 RNA 区，区，可用来确定可用来确定 DNA 或或 RNA 中单碱基突变的位中单碱基突变的
48、位置。广泛用来去除置。广泛用来去除 DNA 样品中的样品中的 RNA。3.核糖核酸酶核糖核酸酶 A（RNase A）第79页，本讲稿共86页DNase 来源于牛胰，是内切核酸酶，来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA。DNase 用途广泛，如切口平移标记时在用途广泛，如切口平移标记时在 dsDNA 上随机产生切口；在闭环上随机产生切口；在闭环 DNA 上引入单上引入单切口，以将分子截短；建立随机缺失的嵌套缺失切口，以将分子截短；建立随机缺失的嵌套缺失体，用于功能分析或测序；除去体，用于功能分析或测序；除去 RNA 样品中的
49、样品中的 DNA。4.脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶 （DNase）第80页，本讲稿共86页大肠杆菌外切核酸酶大肠杆菌外切核酸酶 催化从催化从 dsDNA 3-OH 逐逐一去除单核苷酸的反应，底物为一去除单核苷酸的反应，底物为 dsDNA 或线状和带切或线状和带切口或缺口的环状口或缺口的环状 DNA，反应结果是在，反应结果是在 dsDNA 上产生上产生长长的单链区。长长的单链区。该酶还有对无嘌呤该酶还有对无嘌呤 DNA 特异性内切核酸酶活性、特异性内切核酸酶活性、RNase H 活性和活性和 3-磷酸酶活性（去磷酸）。但不降解核磷酸酶活性（去磷酸）。但不降解核酸内的磷酸二酯键，也不降解单链酸内的
50、磷酸二酯键，也不降解单链 DNA 及带及带 3 突出的突出的 dsDNA。该酶持续作用能力不强，产物为切割程度不相上下的该酶持续作用能力不强，产物为切割程度不相上下的群体，有利于分离长短不等的群体，有利于分离长短不等的 DNA。5.外切核酸酶外切核酸酶（Exonulease）第81页，本讲稿共86页RNase H是内切核酸酶，特异性水解与是内切核酸酶，特异性水解与 DNA 杂交的杂交的 RNA 上的磷酸二酯键，产生带上的磷酸二酯键，产生带有有 3-OH 和和 5-磷酸末端的产物。磷酸末端的产物。6.核糖核酸酶核糖核酸酶 H（RNase H）第82页，本讲稿共86页六、六、DNA结合蛋白结合蛋白