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1、石蜡切片制作一、苏木精-伊红对染法 一、器材及试剂：1. 器材：切片刀，切片机，恒温箱，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖剪，解剖盘，培养皿，镊子，单面刀片，毛笔，包埋盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。2试剂：中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液， 1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。卡诺（Carnoy）固定液，埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（3
2、0%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。3. 材料：鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。二、实验原理：石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。三、试剂配法：1中性甲醛固定液： 甲醛（37%-
3、40%，市售，本所购买即为此浓度） 100mL 磷酸氢二钠 6.5 磷酸二氢钾（钠） 4g 双蒸水 900mL 2苏木精、伊红染色液为碧云天产品31%盐酸乙醇液盐酸 1份70%酒精 100份4甘油蛋白贴片剂：蛋白 50 ml甘油 50 ml水杨酸钠（防腐剂） 1g配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。四、实验步骤：1取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。切取的组织块不宜太大，
4、以利于固定剂穿透，通常以5mm5mm2mm或10 mm10 mm2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块23mm厚。注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。2固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定3050min。注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。（3）固定
5、材料时，固定液必须充足，一般为材料块的2030倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。3. 洗涤材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。4. 脱水材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。各注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器
6、皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象5透明纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯15min、15min（至透明为止）。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。透明注意事项（1）使用透明剂时
7、，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。（3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。6透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min（有吗 ？），再放入石蜡、石蜡透蜡各50-60分钟。透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55-60左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。透蜡注意事项（1）尽量保持在较低温度中进行，以石
8、蜡不凝固为度；（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。7. 包埋包埋时，用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。8. 切片将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-1
9、0微米。一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min。切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。9. 展片、贴片打开水浴锅，使水温维持在40-45，另准备30%乙醇溶液。 切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。 用小镊子夹取预先用刀片割
10、开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开。小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。 另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端（磨边，粗糙的一端）磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。10. 脱蜡复水 将水浴锅温度调至60，待水温控制在60时，将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子（可密封），30min至蜡熔化。之后，石蜡切片经二甲苯、脱蜡各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min。11 染色切片放入苏木精中染色约10-30mi
11、n。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。12水洗用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可），但要注意流水不能过大，以防切片脱落。13分化将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。见切片变红，颜色较浅即可。14漂洗切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。15脱水切片入50%乙醇70%乙醇80%乙醇中各3-5min。16、复染用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获
12、得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。17脱水将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。18透明切片放入二甲苯、中各3-5min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。19封藏：中性树胶封存因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。封藏的方法：封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片
13、。材料透明后，在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。二、免疫组化染色1. 石蜡切片，步骤同前。切片经贴片后，60烤片30min使蜡熔化，经二甲苯、各10min,脱蜡。然后，将切片放入100%
14、、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min，再放入蒸馏水中3min，水化。2脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4，具体看所用抗体及染色试剂说明)冲洗3次，每次3分钟。洗瓶冲洗。 3. 根据抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。可选步骤，具体见抗体说明书。 4.每张切片加1滴或50l 3%过氧化氢，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。此步骤是对内源性过氧化物酶含量高的组织而言。4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50l的第一抗体，室温下孵育60分钟或4过夜，具体参见每种抗体的说明书。PBS冲洗3次，每次3分钟。 5. 除去PBS液，每张切片加1滴或50l 即用型MaxVisionTM 试剂或SP试剂，室温下孵育10-15分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。 6. 除去PBS液，每张切片加2滴或100l新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-5分钟（DAB）或37环境下10-30分钟(AEC)。 7. 自来水冲洗，苏木素复染10分钟，PBS或自来水冲洗返蓝。如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，步骤同H-E染色，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。