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1、RAPD分析中大豆基因组 DNA的快速制备温和的条件下操作， 如尽量减少酚/氯仿抽提的次数、 混匀过程要轻缓，以保证得到较长的 DNA。 另外在吸取上清的步骤中， 所用枪头最好用剪刀把枪头尖儿稍剪一点， 并在酒精灯上烘烤一下， 这样做可以防止因枪头尖过细而对大分子量 DNA所产生的机械剪切作用。从本实验的步骤和结果可以看出， 用此方法小量提取的基因组 DNA用时较少(一般在 3 h 内均可完成)， 保证质量， 得率较高， 并且实验所用药品和仪器均为分子生物学实验常规配备， 所得 DNA 可直接用于基因组文库构建、 Southern 杂交、 RFLP 和 RAPD等实验漂洗 1 次， 真空干燥或
2、晾干， 溶于 200l TE 或 ddH2O， - 20保存备用。2 结果与分析2.1 DNA浓度及提取率的测定取2L DNA溶液， 加1L上样缓冲液， 在0.8% 琼脂糖凝胶上100 V电压电泳1 h，用2L DNA(50ng/L) 和1kbDNA Ladder作Marker，凝胶用溴化乙锭(EB)染色， 紫外灯下观察电泳结果(图1)。在加样孔附近呈现一致密亮带， 分子量较高(20 kb)， 且无降解现象， 与DNA亮度作比较， 可判断所提DNA浓度大约为200 ng/L， DNA得率(g/g材料鲜重)=DNA浓度/取材量(g)， 约为80g/g。2.2 DNA纯度和质量的检测采用紫外分光光
3、度法， 可以检测DNA的纯度。纯净的DNA溶液其OD260/OD280应为1.8。如果OD260/OD280大于1.8， 表明含有较多的RNA； 如果OD260/OD280小于1.6， 则说明样品中蛋白质较多；通常260/A280应不小于1.8才符合一般分子生物学反应DNA的最佳质量要求， 1.6以上即可用于RAPD分析。将所提取的 DNA 稀释后(稀释倍数为 25)， 以稀释所用超纯水为对照，用分光光度计测定其在 260nm、 280 nm 波长处的光吸收值:OD260/OD280=1.892(为 5 次提取结果的平均值)。表明所得的 mtDNA 纯度较高， 无 RNA和蛋白质的污染。2.3
4、 PCR 扩增结果随机选取5个RAPD随机引物(OPERON公司)进行PCR扩增反应， 反应体系为25L， 其中包括10 Buffer(含Mg2+)2.5L， 10mmol/L dNTPs 0.4L， Taq酶1U， 引物2L， 模板DNA20ng， 其余体积用超纯水补齐。PCR反应在T- G96型DNA扩增仪中进行，反应程序为94预变性5 min、 94 变性1 min， 36 退火1 min， 72 延伸1 min 30 s， 40个循环； 再72保温10min。扩增产物在1.5% 琼脂糖凝胶上120V电压电泳1 h 2 h，紫外灯下观察照相(图2)， 所选引物均能良好扩增， 扩增条带清晰
5、， 效果良好。3 讨 论因大豆材料中含有较多的蛋白和脂类， 一般提取方法多采取增加抽提次数来获得较纯净的 DNA， 但对 DNA产率有重大影响， 选择在提取缓冲液中加入一定量的巯基乙醇， 适当减少抽提次数， 可使 DNA的产率大大提高。在实验中我们发现， 用液氮研磨材料后， 一定要在材料未融化之前及时地放入 65水浴中， 否则提取的 DNA常会有降解现象。在提取过程中， 染色体会发生机械断裂， 产生大小不同的片段， 因此分离基因组 DNA 时应尽量在图 1 大豆基因组 DNA琼脂糖凝胶电泳1： 大豆基因组 DNA2： DNA（100ng）3： 1kb DNA Ladder图 2 大豆基因组 D
6、NA RAPD扩增图谱1- 6： 引物分别为 OPA03、 OPA06、 OPA12、 OPB01、OPB10、 OPB1536 31 卷 吉 林 农 业 科 学利用基因工程手段对植物进行定向改造， 已成为当今植物育种学发展的一个新领域。DNA 是生物遗传信息的载体，植物基因工程操作离不开基因组 DNA。关于植物 DNA 提取方法的研究报道很多， 但因植物材料不同， 所采用的方法也不尽完全相同。传统的 CTAB 法(Murry， 1980)步骤较多， 操作烦琐， 虽然获得的 DNA质量较纯， 但产率较低， 尤其在分析大量样品时， 工作效率很难提高。 本实验以大豆材料为例， 采用了本实验室改进的
7、 DNA 提取方法， 所得 DNA 产率大、 纯度， 高且无降解现象， 完全可以用于 RAPD、 PCR 等分子生物学实验。1 材料与方法1.1 实验材料、 溶液及试剂暗培养 5 7 d， 长约 8 10 cm的大豆黄化苗。提取缓冲液： 300 mmol/L NaCl， 200 mmol/L TrisCl， pH 8.0， 250 mmol/L EDTA， 1.5% SDS， 1%- 巯基乙醇(临用前加)。TE 缓冲液:10 mmol/L TrisCl， 1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。其它试剂： 液氮， 5mol/L KAc，3mol/L NaAc， 氯仿- 异戊醇(24 1；
8、V/V)， 异丙醇(- 20保存)， 无水乙醇(- 20保存)， 70%乙醇(预冷)， 无菌双蒸水(ddH2O)。1.2 仪器设备移液器、 台式高速离心机、 水浴锅、 陶瓷研钵、 1.5mL离心管、 弯成钩状的小玻棒、 电泳仪、 紫外检测仪和分光光度计。1.3 实验步骤取0.5g新鲜植物材料， 于研钵中快速用液氮研成粉末； 将研好的粉末迅速转入1.5 mL离心管中， 立即加入900L提取缓冲液(65预热)， 轻轻混匀； 置65水浴中20 min； 取出后立即置于冰上， 并加入300L 5mol/L KAc， 于冰上反应30 min， 在4 下12 000 r， 离心10 min， 收取上清； 向上清液中加入等体积的异丙醇， 轻轻混匀后4放置10 20 min， 用玻璃棒将白色丝状物挑出， 或于4 12000 r离心10 min， 收集沉淀， 晾干后回溶于600L TE； 向其中加等体积的氯仿- 异戊醇溶液(24 1；V/V)混匀后410 000r离心5 min， 收集上清液， 若蛋白没抽提干净， 有必要重复一次； 向上清液中加入 2 倍体积的无水乙醇， 于- 20放置 1 2 h， 于 4 12 000 r 离心 10 min， 收集沉淀； 沉淀用 70%乙醇