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1、实验三 学习细菌培养的基本技术教学目标 1知识方面 (1)通过本实验使学生了解微生物实验中无菌操作的方法及重要性；学习细菌培养的基础知识；加深对微生物的营养、代谢和影响生长的环境因素等知识的理解。 (2)掌握培养基的制备、消毒灭菌及接种培养等基本操作方法，理解其原理。 2态度观念方面 培养严谨、求实的科学态度；树立勤俭节约、爱护公物、相互协作的优良作风及安全意识；提高学生的科学素质。 3能力方面 (1)培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力。 (2)通过分组实验，统筹分配，培养学生动手操作能力和创新、应变能力。重点、难点分析重点是了解微生物实验的一些最基本操作技术及其原理。难点是根据本校
2、条件如何保证实验的有序、有效地进行。教学模式以课堂实验为主，课内外想相结合的教学，属于半独立性质及独立性质的实验。教学手段学生分组实验、录像、投影仪。课时安排大纲要求4课时。针对高三年级的特点，建议老师们利用机动课时，最好安排连堂的两节课完成此实验。设计思路教学过程一、课前准备。1 实验室 做好卫生，物品摆放有序，悬挂“微生物实验须知”。在每次实验前，实验台、地面用3的来苏水(或石碳酸)消毒，有条件的提前用紫外灯照射半小时。接种箱在使用前用紫外灯照射半小时和熏蒸法半小时(高锰酸钾+甲醛)消毒。在消毒过程中要严格监管，注意安全，尤其是紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以不能直
3、视紫外线，照射期间，室内不能有人或其他动物、植物。 2实验材料 (1)菌种 选择：菌种选择的原则是安全无毒、容易获得。教材中所提供的金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌中的大部分是有毒的，不宜采用。经反复筛选，我们选择了枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)。 制备和保存：可以向各级菌种站、大专院校索取或购买。若五条件，也可以自己分离培养，方法如下： 取田园土10g加蒸馏水90mL制成土壤悬液，可再制成10-3、102、101各种稀释的土壤溶液，用涂布法在牛肉膏蛋白胨平板上培养，温度32。培养3848h后(适于芽孢生长)选择菌落乳白色，大小适中的镜检，可用结晶紫染色。镜下菌体呈杆状，芽孢位于菌
4、体中间或靠尖端大小与菌体相当的即为所需菌种枯草芽孢杆菌。 无菌操作条件下将菌种转接到斜面培养基上，扩大培养，按实验班实际分组数，平均两组一支的数量进行准备。如需保存一段时间，可待菌体充分生长后，将棉塞部分用油纸包扎好，置于冰箱内冷藏保存(4一6)，最好每月移种一次。 (2)药品 按课本要求准备，可从化学试剂或药品公司购买。如五条件，牛肉膏也可自制，方法如下(以配制l 000mL培养基为例)：瘦牛肉(去筋去油)500g，切成小丁，加入1 000mL蒸馏水，煮熟(牛肉熟、凝集成块)过滤，补充蒸馏水至1 000mL。如果实验室为学生配制，可直接从市场购买“营养琼脂”按说明调配。 3实验用具 (1)接
5、种工具 可将电炉丝拉直，缠绕在玻璃棒或金属棒上制成；也可制成一次性接种针，用中号毛衣针从中间截断为二，打磨尖端使其不尖锐，以报纸扎好，注意大小头，每包1012支，与培养基一起高压蒸汽灭菌。这种接种工具的优点，首先是操作简单，不用灼烧灭菌；其次是容易控制，操作起来灵活方便，在接种划线时不会划破培养基；它也适用于有超净工作台的实验室(因为工作台抽风的过程常使酒精灯火焰不稳定)。此外，这种接种工具经济易得，灭菌后还可反复使用。 (2)灭菌设备 首选高压灭菌锅。当实验室没有此设备时，可选择使用大的蒸笼，在这种情况下，蒸汽的压力不超过大气压，温度不超过100。我们采用常压间歇灭菌法，即把培养基或其他灭菌
6、物放在蒸笼内，每天蒸煮一次，每次30min，连续蒸煮3d。在每两次蒸煮之间，将培养基或灭菌物放在2830的条件下培养24 h，芽孢萌发成为营养体，在第二次蒸煮时又可被杀死，极少数在第一次培养中就形成的芽孢在第二次培养时萌发为营养体，在第三次蒸煮时也被杀死。经过三次蒸煮，培养两次，基本上达到完全灭菌。 (3)培养设备 首选恒温箱。经实验，对于枯草芽孢杆菌，发育良好的温度为3212培养2448 h。若没有恒温箱也可室内培养，若室内温度稍低，则应延长培养时间。 4组成实验筹备小组为保证实验的顺利进行，可在课前组成实验筹备小组(可以自愿报名或由12个实验小组组成)。这样一方面是让学生了解课前的准备工作
7、，理解微生物实验的具体要求和特殊性，对其他学生有指导作用；另一方面，通过小组的课前实际操作，便于掌握整个实验不同步骤所需的大约时间；同时，也可为上课准备材料。 (1) 制备斜面培养基(供接种用)。(2) 实验环境和人体表面微生物的检查(见下表)。 实验器材 操作方法 样品来源 培养条件 实验结果牛肉膏蛋白胨 琼脂平板 酒精灯 接种针严格无菌操作方法 空气 实验台 手 头发口腔(咳嗽)37，2448小时 菌落计数， 菌落类型描述 注意： 在取样时尽量安排对比实验：如“实验室空气”，一组选择实验室上课时采集，一组可选择放在无人走动的实验室；再比如“手”可设置二到三组：(A)未做任何处理；(n)肥皂
8、清洗后；(C)用酒精擦拭后。 指导学生动手操作以前，在平板皿底用记号笔写上班级、姓名、日期、样品来源，字尽量小些，靠皿底一侧，不要写在中间，以免影响观察结果。5布置好预习由于本次实验内容多、时间长，建议教师安排课前预习动员，可以让学生根据本班实际情况，结合实验内容和实验时间(每步骤的大约时间由教师提供)，对实验的步骤安排进行统筹，对于科学合理的计划予以采纳。这样，让学生参与实验课的设计，既激发了学习兴趣，调动学习主动性，又达到了充分预习的目的，使学生在实验前了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 二、实验过程 导入：常言道“眼见为实”，而小小的微生物我们肉眼看不到它，它却无缝不钻
9、，无孔不入。先请实验筹备小组的同学为我们讲述一下他们的实验：“环境中的微生物”。由学生代表介绍实验的步骤、方法，通过照片和实物运用对比的方法，显示菌落的数量及特征。经过介绍，使学生在第一次进入微生物学实验室时，建立起“微生物无所不在”的概念，这样才能真正体会到无菌技术和环境卫生的必要性。然后教师按照实验顺序顺序讲解要点和注意事项： 在实验中就如何提高实验速度，克服操作中的困难等问题，应该积极思考，改进方案大胆创新。 对消耗材料和药品要力求节约，用毕仍放回原处。在此基础上，学生按照分发的实验指导材料开始分组实验，教师巡回指导。1 培养基的配制 在配制过程中会遇到很多问题：如怎样称量牛肉膏?琼脂怎
10、样溶化得快而充分?可以改变培养基的凝结速度吗?等等。可以先在学生中征求方案，学生们边实践边总结交流。 在实验中发现，配方中适当增加琼脂的含量可提高培养基的凝结速度，如室温较高可加入253g琼脂。另外，在程序上应先盛量100mi。蒸馏水，加人称量好的琼脂浸泡(泡软后再加热容易溶化)后，再进行其他工作 牛肉膏的称量可利用硫酸纸和玻璃棒；蛋白胨容易吸潮，所以称量动作要快。 在加热时，培养基沸腾后要不断搅拌，防止溢出，充分溶化后补加蒸馏水至lOOmL(可供制812个斜面培养基)。 从加热到完全融化约需10min左右，这时可以让学生根据实验指导资料制作棉塞(见教参)，同时讨论为什么制作的棉塞不能太紧，也
11、不能太松?(经过实验，总结出棉塞容易拔下，并发出噗的一声轻响为合格。) 在培养基的分装过程中，可以让学生先用水进行练习，摸索出如何把握量的问题，滴管伸人试管的深度等；并熟练快进快出。另外关于分装装置，可以简化(见图1)，这样既方便操作，又减轻了实验室的工作量。 最后，小组同学分工合作完成加棉塞和包扎，注明培养基名称，配制的日期和制作者姓名，并做好自检和互检工作，准备无误后，等待灭菌。 2灭菌 由各实验小组把本组的灭菌物品放人高压蒸汽灭菌锅内，由实验室教师负责灭菌(在准备室内)。问：高压锅是怎样工作的?在学生回答的基础上总结出高压蒸汽灭菌的原理。教师给出资料(表1、表2)：表1 蛋白质含水量与凝
12、固所需温度的关系 表2 干热与湿热穿透力及灭菌效果比较 分组讨论：同一温度下，湿热灭菌优于干热灭菌的原因?如果高温水蒸汽又高压，灭菌效果会怎样? 请实验筹备小组的同学结合自身实践，讲解高压蒸汽灭菌的方法。 主要内容如下： 用实物和剖面图介绍高压蒸汽灭菌锅的基本构造。 具体操作步骤(录像、照片等)。 注意细节：如高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?在使用时怎样杜绝一切不安全的因素?(分析讨论)第二课时(课前进行实验台面、地面消毒)3、接种利用课前实验筹备小组制备的斜面培养基进行接种操作。由教师利用录像(五条件的可用图示和演示操作结合)分步讲解在无菌操作的条件下接种的步骤和要点 强调：
13、 实验过程中，应保持室内安静，勿高声谈话和随意走动。 实验过程中要小心仔细，注意酒精灯的使用，保证安全。全部操作应严格按操作规程进行，万一遇到有盛菌试管不慎打破，皮肤破伤等意外情况发生，应立即报告指导教师处置。 对用过的棉签、接种针(竹制)、培养物等均放在指定的容器内。 在学生分组实验时，应为每个实验组准备一套练习用试管，使学生能反复操作，熟练手部动作。菌种试管和接种的斜面试管都应放在试管架上。 另外，应准备接种操作程序图(见课本，也可用投影仪打在大屏幕上)：接种环(金属制)的火焰灭菌步骤(见图2)、斜面划线图示(见图3)，进行指导。 如有条件，也可安排几组同学在接种箱(或超净工作台)进行接种
14、。一方面使学生了解微生物学实验的接种器具，另一方面可对实验结果进行比较。 接种完毕后，以组为单位，为斜面试管挂标签，并填写所接菌种名称、接种日期、接种者姓名，并放在指定的恒温箱内培养。 以组为单位完成整理工作。 4搁置斜面 培养基灭菌2030min，保压时间结束后，应停止加热，使其自然冷却。此时切勿急于打开放气阀因为压力骤然降低，会导致培养基剧烈沸腾而冲掉或污染棉塞。待压力接近零时，再打开放气阀。 排气完毕后，即可扭松盖上螺栓，使锅盖松动，等待1520心n后,可以取出已灭菌物品（注意：此步可以由实验教师完成，如需要学生操作应注意安全，不要烫伤，准备手套。） 摆放斜面之前，应给学生充分时间讨论、
15、实验，选取合适的摆放材料，如书本、木块等，使斜面的高处不超过试管的12(如图4)。应趁热摆放，不能随意晃动，争取一次成功。(为下面实验班的接种操作提供斜面培养基) 5培养观察： 培养条件：恒温箱32，2448h。 可以以实验小组为单位，设计观察记录表(见表3)，利用课余时间做好观察记录和结果分析。 培养特征 菌种 培养时间 备注 生长程度 菌苔形状菌苔隆起形状 表面光泽 透明程度 颜色 质地 其他表3斜面培养特征观察记录表 记录指示： 生长程度：分良好、微弱、不生长等。 菌苔形状：分丝状、有刺、有小突起、念珠状、扩散状、树状、假根状等。 菌苔隆起形状：分扁平、台状、凸起等。 建议在实验室安放一台凋试好的显微镜，显示枯草芽孢杆菌的形态，使学生对它有一个全面的了解形成完整的概念。 最后请学生对自己的实验结果进行分析，并进行自我评价。要点提示 1针对本实验的特点，一定要事先充分做好准备工作，通过指导学生预习、参与统筹、填写提纲、实验操作、观察思考和讨论分析等获得知识。教师起组织引导的作用。 2在实验中强调小组成员分工协作，每人每组的实验结果都记录明确，增强学生的责任感，使学生体会到“做科学”的严谨性。 3.本实验教师在设计时一定要考虑安全因素。天津市第十七中学 悦胡