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1、专题专题 3 3 植物的组织培养技术植物的组织培养技术在生物技术实践模块课程标准中，植物组织培养的具体要求是“尝试植物的组织培养”。尝试是技能在生物技术实践模块课程标准中，植物组织培养的具体要求是“尝试植物的组织培养”。尝试是技能性目标中的模仿水平，即学生仿照教师的示范性动作完成对实验对象的操作。性目标中的模仿水平，即学生仿照教师的示范性动作完成对实验对象的操作。植物组织培养是一项操作复杂而精细，操作难度较大的实践活动，其操作流程包括：配制母液、培养基配植物组织培养是一项操作复杂而精细，操作难度较大的实践活动，其操作流程包括：配制母液、培养基配制与灭菌、外植体选择和消毒、接种、形成愈伤组织、诱
2、导丛芽和生根、组培苗移栽等操作环节。从操作的持制与灭菌、外植体选择和消毒、接种、形成愈伤组织、诱导丛芽和生根、组培苗移栽等操作环节。从操作的持续时间看，完成前四项活动需要一天，后三项活动需要续时间看，完成前四项活动需要一天，后三项活动需要1 12 2 个月。为了确保在有限的时间内顺利地开展实验教个月。为了确保在有限的时间内顺利地开展实验教学，需要确定学生动手操作的一些重要环节和步骤，并针对这些环节和步骤提前做好实验准备。学，需要确定学生动手操作的一些重要环节和步骤，并针对这些环节和步骤提前做好实验准备。1 1 实验室的准备工作实验室的准备工作本实验需要作好三项实验准备：一是提前配制各种母液；二
3、是提前准备本实验需要作好三项实验准备：一是提前配制各种母液；二是提前准备MSMS 培养基；三是选择外植体并进行培养基；三是选择外植体并进行预处理。预处理。1.11.1 配制母液配制母液母液中含有大量元素、微量元素、激素（植物生物调节剂）和维生素等有机成分，母液浓度是实际溶液浓母液中含有大量元素、微量元素、激素（植物生物调节剂）和维生素等有机成分，母液浓度是实际溶液浓度的度的 5 51010 倍。配制母液花费时间多，需要用到溶量瓶、移液管等精密仪器，无法由每位学生亲自操作，教师倍。配制母液花费时间多，需要用到溶量瓶、移液管等精密仪器，无法由每位学生亲自操作，教师可带领部分学生在课外进行。母液的类
4、型和配制顺序如下：可带领部分学生在课外进行。母液的类型和配制顺序如下：配制母液的注意事项：自来水或河水中含有大量的矿质元素，勿用配制母液；配配制母液的注意事项：自来水或河水中含有大量的矿质元素，勿用配制母液；配制大量元素和微量元制大量元素和微量元素母液时，应将每种化合物单独溶解后，再一一混合，同时还应用适量的蒸馏水清洗烧杯内壁，并将清洗后的素母液时，应将每种化合物单独溶解后，再一一混合，同时还应用适量的蒸馏水清洗烧杯内壁，并将清洗后的蒸馏水倒入混合溶液中，这样可以保证每种元素的浓度，混合时要按照教材附表中的顺序进行，最后加入的是蒸馏水倒入混合溶液中，这样可以保证每种元素的浓度，混合时要按照教材
5、附表中的顺序进行，最后加入的是氯化钙溶液，这样可以避免发生沉淀；配制好的母液要先倒入氯化钙溶液，这样可以避免发生沉淀；配制好的母液要先倒入 1 000 ml1 000 ml 烧杯中，再由烧杯转入烧杯中，再由烧杯转入 1 000 ml1 000 ml 细细口瓶中，不可由容量瓶直接倒入细口瓶中；注意观察母液中是否有絮状物，出现絮状物表明离子之间发生反口瓶中，不可由容量瓶直接倒入细口瓶中；注意观察母液中是否有絮状物，出现絮状物表明离子之间发生反应，应，需要重新配制母液；需要重新配制母液；植物生长调节剂难溶于水，植物生长调节剂难溶于水，需要碱或酸助溶，需要碱或酸助溶，一般生长素类物质用碱一般生长素类物
6、质用碱（0.10.1 mol/LNaOH1mol/LNaOH13 ml3 ml）或酒精（）或酒精（75759595的的酒精酒精 1 13ml3ml）助溶，细胞分裂素类物质一般用酸（）助溶，细胞分裂素类物质一般用酸（0.1 mol/LHCL10.1 mol/LHCL13 ml3 ml）助溶，助溶，加入蒸馏水定溶时要缓慢，也可用水浴法助溶；用棕色细口瓶盛装有机物母液和植物生长调节剂母液，避免加入蒸馏水定溶时要缓慢，也可用水浴法助溶；用棕色细口瓶盛装有机物母液和植物生长调节剂母液，避免透射光损害母液中的有机成分；在瓶壁上贴好各种母液的标签（下图所示）；将配制好的母液放入冰箱中透射光损害母液中的有机成
7、分；在瓶壁上贴好各种母液的标签（下图所示）；将配制好的母液放入冰箱中或阴凉处保存。或阴凉处保存。MSMS 是穆拉希吉（是穆拉希吉（MurashigeMurashige）和斯库克（）和斯库克（SkoogSkoog）两位科学家第一个字母的缩写，他们于）两位科学家第一个字母的缩写，他们于19621962 年为培养烟草年为培养烟草而设计了一种培养基，这就是组培使用中最为广泛的而设计了一种培养基，这就是组培使用中最为广泛的 MSMS 培养基；标签中间一行的数字及单位表示的意义如下，培养基；标签中间一行的数字及单位表示的意义如下，例如，例如，100ml/L100ml/L，即配制，即配制 1 1 升培养基只
8、需从母液中提取升培养基只需从母液中提取 100ml100ml 即可；即可；50mg/100ml50mg/100ml，表明，表明 100ml100ml 母液中含有母液中含有 50mg50mg萘乙酸，如取萘乙酸，如取 4mg4mg 的萘乙酸，只需提取的萘乙酸，只需提取 8ml8ml 母液。母液。除母液需提前配除母液需提前配制好外，制好外，消毒液也需要提前配制好。消毒液也需要提前配制好。外植体消毒一般采用外植体消毒一般采用 7575的酒精、的酒精、2 21010的次氯酸钠的次氯酸钠溶液等。溶液等。1.21.2 培养基的配制与灭菌培养基的配制与灭菌培养基的类型有很多种，通常采用培养基的类型有很多种，通
9、常采用 MSMS 培养基。配制培养基的流程如下：培养基。配制培养基的流程如下：上述的培养基配制流程中，加入各种母液的时间是在琼脂溶化之后，这样既可避免加热使母液中的各种离上述的培养基配制流程中，加入各种母液的时间是在琼脂溶化之后，这样既可避免加热使母液中的各种离子发生反应，又可避免有机物母液和植物生长调节剂因高温受到损害。将母液加入培养基的顺序是：先提取大子发生反应，又可避免有机物母液和植物生长调节剂因高温受到损害。将母液加入培养基的顺序是：先提取大量元素、微量元素、铁盐、量元素、微量元素、铁盐、有机物母液，后提取植物生长调节剂母液，切勿先提取植物生长调节剂母液，这是有机物母液，后提取植物生长
10、调节剂母液，切勿先提取植物生长调节剂母液，这是因为该溶液中含有酸或碱，容易与其他元素形成沉淀而失败。因为该溶液中含有酸或碱，容易与其他元素形成沉淀而失败。培养基通常采用高压蒸汽灭菌，灭菌时间一般为培养基通常采用高压蒸汽灭菌，灭菌时间一般为151520min20min，灭好菌的培养基不易保存过长时间，灭好菌的培养基不易保存过长时间，通常是现通常是现用现配。在对培养基灭菌的同时，也要对解剖刀、镊子、烧杯、锥形瓶、牛皮纸等必要的仪器设备进行灭菌。用现配。在对培养基灭菌的同时，也要对解剖刀、镊子、烧杯、锥形瓶、牛皮纸等必要的仪器设备进行灭菌。1.31.3 外植体的选择和预处理外植体的选择和预处理根据植
11、物细胞的全能性原理，选择任何活的植物体都能培养出组培苗，但不同植物的各种组织和器官的分根据植物细胞的全能性原理，选择任何活的植物体都能培养出组培苗，但不同植物的各种组织和器官的分裂能力不同，同时还要考虑消毒处理的特殊情况，因此，选择恰当的外植体进行接种既有利于消毒，避免污染，裂能力不同，同时还要考虑消毒处理的特殊情况，因此，选择恰当的外植体进行接种既有利于消毒，避免污染，又有利于在较短时间内形成组培苗，又有利于在较短时间内形成组培苗，从而提高组培成功率。从而提高组培成功率。下面是选择外植体时需要考虑的一些因素及说明。下面是选择外植体时需要考虑的一些因素及说明。考虑的因素考虑的因素外植体的年龄外
12、植体的年龄说说明明一般情况外植体的年龄越小，一般情况外植体的年龄越小，分化的程度越小，分化的程度越小，组培的成功率就越组培的成功率就越高，因此，尽量选择幼嫩的植物组织或器官作为外植体高，因此，尽量选择幼嫩的植物组织或器官作为外植体外植体很小和很大都不合适，外植体很小和很大都不合适，很小的外植体极容易死亡，很小的外植体极容易死亡，很大的外很大的外外植体的大小外植体的大小植体不容易消毒，因此，植体不容易消毒，因此，要选择大小适中的外植体。例如，如果用菊花要选择大小适中的外植体。例如，如果用菊花的芽进行组培，选取的芽可为的芽进行组培，选取的芽可为 3mm3mm 左右左右外植体所在的外植体所在的部位部
13、位外植体的外观外植体的外观形态形态选择好外植体后教师还要做一些预处理，以便学生进一步消毒时能有效地杀死外植体表面的微生物。预处选择好外植体后教师还要做一些预处理，以便学生进一步消毒时能有效地杀死外植体表面的微生物。预处理包括：用清水冲洗；用洗涤灵或洗衣粉清洗；芽作为外植体时要放在锥形瓶中加清水反复振荡，如果芽中有理包括：用清水冲洗；用洗涤灵或洗衣粉清洗；芽作为外植体时要放在锥形瓶中加清水反复振荡，如果芽中有很多凹陷，还需要用毛刷轻刷；用自来水细流冲洗很多凹陷，还需要用毛刷轻刷；用自来水细流冲洗2 24 4 小时左右。组培室要进行紫外线消毒，或用化学药剂如小时左右。组培室要进行紫外线消毒，或用化
14、学药剂如甲醛和高锰酸钾进行蒸汽消毒。操作台、接种器械、工作服等都要提前进行消毒，等等。甲醛和高锰酸钾进行蒸汽消毒。操作台、接种器械、工作服等都要提前进行消毒，等等。2 2教学建议教学建议2.12.1 重视实验原理的学习，帮助学生形成网络化的知识结构重视实验原理的学习，帮助学生形成网络化的知识结构组培的原理及组培的原理及过程是教学中的重点，对于学生理解组培在生产实践中的重要性具有十分积极的现实意义，过程是教学中的重点，对于学生理解组培在生产实践中的重要性具有十分积极的现实意义，同时，有助于学生理解生命的本质，以及人类对生命现象进行干预的意义。组培的原理、过程及作用可用下面同时，有助于学生理解生命
15、的本质，以及人类对生命现象进行干预的意义。组培的原理、过程及作用可用下面的图示表示。的图示表示。一般选择植物的芽尖、一般选择植物的芽尖、根尖或幼嫩的茎作为外植体，根尖或幼嫩的茎作为外植体，这些部位的组这些部位的组织分裂能力强，容易形成愈伤组织织分裂能力强，容易形成愈伤组织由于外植体的消毒工作非常重要，因此，要由于外植体的消毒工作非常重要，因此，要选择哪些表面相对光选择哪些表面相对光滑容易消毒的外植体较好滑容易消毒的外植体较好为帮助学生理解组培的原理、操作和过程，教学时可引导学生讨论下列问题：灭菌和消毒的区别以及在为帮助学生理解组培的原理、操作和过程，教学时可引导学生讨论下列问题：灭菌和消毒的区
16、别以及在组培中是如何应用的？在脱分化和再分化过程中怎样使用植物生长调节剂组培中是如何应用的？在脱分化和再分化过程中怎样使用植物生长调节剂?组培过程中有时需要换瓶操组培过程中有时需要换瓶操作，这是为什么（改变培养基中的植物生长调节剂的浓度比例）作，这是为什么（改变培养基中的植物生长调节剂的浓度比例）?组培过程中的每一步都需要光照吗（愈伤组培过程中的每一步都需要光照吗（愈伤组织的形成不一定需要光照，但丛芽和根的形成需要光照）组织的形成不一定需要光照，但丛芽和根的形成需要光照）?组培中用的蔗糖作为能源和原料物质，用葡萄糖组培中用的蔗糖作为能源和原料物质，用葡萄糖行不行（使用蔗糖主要是考虑经济因素，也
17、可用葡萄糖或果糖行不行（使用蔗糖主要是考虑经济因素，也可用葡萄糖或果糖替代）？花药离体培养获得的植物幼苗都是单替代）？花药离体培养获得的植物幼苗都是单倍体吗（不是，也有正常的植物体）？等等。倍体吗（不是，也有正常的植物体）？等等。2.22.2 合理安排时间，确保学生动手操作关键的步骤合理安排时间，确保学生动手操作关键的步骤既然我们不可能让每一位学生都经历组培的全过程，但又要让学生实践操作，因此，选择什么样的操作环既然我们不可能让每一位学生都经历组培的全过程，但又要让学生实践操作，因此，选择什么样的操作环节让学生实践就显得尤为重要。以下的几种方案供参考和借节让学生实践就显得尤为重要。以下的几种方
18、案供参考和借鉴。鉴。方案方案 1 1：学生完成外植物体的消毒和接种工作。外植体的消毒工作至关重要，需要那些操作认真、细致的学：学生完成外植物体的消毒和接种工作。外植体的消毒工作至关重要，需要那些操作认真、细致的学生才能够很好地完成，因此这种方案要求学生具备一定的操作技能，并且做到耐心、细致。外植体的消毒流程生才能够很好地完成，因此这种方案要求学生具备一定的操作技能，并且做到耐心、细致。外植体的消毒流程如下。如下。上述流程中，酒精起到表面消毒的作用，次氯酸钠溶液的消毒作用更强。这两种消毒剂的使用时间可根据上述流程中，酒精起到表面消毒的作用，次氯酸钠溶液的消毒作用更强。这两种消毒剂的使用时间可根据
19、外植体的种类决定，一般而言，芽尖等相对幼嫩的组织消毒的时间要短些，而茎、根的消毒时间可用时长一些。外植体的种类决定，一般而言，芽尖等相对幼嫩的组织消毒的时间要短些，而茎、根的消毒时间可用时长一些。总的原则是，既要杀灭外植体表面的全部微生物，又要避免损害和杀死外植体本身。除上述的消毒剂外，过氧总的原则是，既要杀灭外植体表面的全部微生物，又要避免损害和杀死外植体本身。除上述的消毒剂外，过氧化氢溶液（化氢溶液（1010，5 515min15min）和）和氯化汞溶液（氯化汞溶液（0.10.10.50.5，2 27min7min）也是极好的消毒剂。通过以上操作学生能）也是极好的消毒剂。通过以上操作学生能
20、体会到无菌对于组织培养成功的重要作用，从而提高他们的实验操作技能、严谨认真的科学体会到无菌对于组织培养成功的重要作用，从而提高他们的实验操作技能、严谨认真的科学精神和精神和态度。态度。方案方案 2 2：学生完成愈伤组织的继代培养或分化换瓶。学生完成愈伤组织的继代培养或分化换瓶。由于减少了外植体消毒这一重要的环节，由于减少了外植体消毒这一重要的环节，操作相对简单，操作相对简单，成功率很高，学生容易获得成功的满足感。因此，这种方案是针对那些实践操作能力一般的学生而设置的。一成功率很高，学生容易获得成功的满足感。因此，这种方案是针对那些实践操作能力一般的学生而设置的。一方面可以让学生体验组培接种的操
21、作过程，另一方面保证了实验的成功率，节约了实验时间。方面可以让学生体验组培接种的操作过程，另一方面保证了实验的成功率，节约了实验时间。方案方案 3 3：探讨植物生长调节剂的不同浓度对组培的影响。探讨植物生长调节剂的不同浓度对组培的影响。为强凋不同浓度的植物生长调节剂在诱导愈伤组织为强凋不同浓度的植物生长调节剂在诱导愈伤组织分化形成丛芽或生根中的作用，可配制植物生长调节剂不同浓度的培养基，然后让学生根据自己的意愿选择这分化形成丛芽或生根中的作用，可配制植物生长调节剂不同浓度的培养基，然后让学生根据自己的意愿选择这些培养基进行换瓶操作。当学生看到植物生长调节剂的神奇作用时，一定能够深刻地理解激素对
22、植物生长的重些培养基进行换瓶操作。当学生看到植物生长调节剂的神奇作用时，一定能够深刻地理解激素对植物生长的重要作用，从而激发学生浓厚的探究兴趣。下表为组培中常用的植物生长调节剂的类型及作用。要作用，从而激发学生浓厚的探究兴趣。下表为组培中常用的植物生长调节剂的类型及作用。调节剂调节剂生长素生长素类类细胞分细胞分裂素类裂素类名称名称2 2，4 4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸（2 2，4 4D D）、萘乙酸（萘乙酸（NAANAA）、吲）、吲哚丁酸（哚丁酸（IBAIBA）等）等激动素激动素（KTKT）、6 6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤（BABA或或 6 6BABA）、玉米素（）、玉米素（ZTZT）等）等浓度范
23、围浓度范围0.010.015mg/L5mg/L0.50.510mg/L10mg/L作用作用促进细胞的伸长和分促进细胞的伸长和分裂，促进愈伤组织和根的裂，促进愈伤组织和根的形成形成促进细胞的横向生长促进细胞的横向生长和分裂，促进芽的分化和和分裂，促进芽的分化和形成形成诱导外植体形成不定芽时，一般用细胞分裂素类物质的浓度较高，生长素类物质的浓度较低；如果这两类诱导外植体形成不定芽时，一般用细胞分裂素类物质的浓度较高，生长素类物质的浓度较低；如果这两类物质的浓度相同，则有利于形成愈伤组织；如果其比值小于物质的浓度相同，则有利于形成愈伤组织；如果其比值小于 1 1，则有利于生根。教学中可选择不同的配比
24、浓度，则有利于生根。教学中可选择不同的配比浓度，探讨哪种配比浓度更有利于芽的形成，哪种配比浓度更有利于根的形成。探讨哪种配比浓度更有利于芽的形成，哪种配比浓度更有利于根的形成。2.32.3 成立课外活动小组，培养学生中的积极分子成立课外活动小组，培养学生中的积极分子组培实验的操作繁多而复杂，需要教师提前做好组培实验的操作繁多而复杂，需要教师提前做好 大量的准备工作，因此，成立活动小组，培养学生中的积极分大量的准备工作，因此，成立活动小组，培养学生中的积极分子十分重要。活动小组主要完成以下工作：（子十分重要。活动小组主要完成以下工作：（1 1）帮助老师完成实验室的前期准备，如各种母液的配制、各种培）帮助老师完成实验室的前期准备，如各种母液的配制、各种培养基的配制和灭菌，等等；（养基的配制和灭菌，等等；（2 2）做好接种的示范操作，并拍成录像，提供给其他学生借鉴；（）做好接种的示范操作，并拍成录像，提供给其他学生借鉴；（3 3）接种后的观）接种后的观察和记录；（察和记录；（4 4）进行继代培养和分化转瓶；（）进行继代培养和分化转瓶；（5 5）幼苗的移栽及管理；（）幼苗的移栽及管理；（6 6）进行课题延伸项目的研究，等等。）进行课题延伸项目的研究，等等。