发酵菌种的制备优秀课件.ppt

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1、发酵菌种的制备第1页，本讲稿共70页发发酵酵工工程程第一章第一章 发酵工程总论发酵工程总论第二章第二章 发酵设备发酵设备第三章第三章 发酵工业原料及其处理发酵工业原料及其处理第四章第四章 发酵工业灭菌发酵工业灭菌第五章第五章 发酵菌种的制备发酵菌种的制备第六章第六章 发酵工业放大发酵工业放大第第七七章章 微生物发酵机制微生物发酵机制第八章第八章 发酵动力学发酵动力学第第九九章章 发酵过程工艺控制发酵过程工艺控制第第十十章章 发酵染菌及防治发酵染菌及防治第第十一十一章章 发酵工业废物、废水处理和资源化技术发酵工业废物、废水处理和资源化技术第十二章第十二章 展望展望 发酵工程发酵工程第2页，本讲稿

2、共70页1 1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育2 2 工业微生物种子的扩大培养工业微生物种子的扩大培养3 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备第五章第五章 发酵菌种的制备发酵菌种的制备http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm 发酵工程发酵工程第3页，本讲稿共70页1.1 工业微生物的特点工业微生物的特点1.2 发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏1

3、 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育第五章第五章 发酵菌种的制备发酵菌种的制备第4页，本讲稿共70页1.1 1.1 工业微生物的特点工业微生物的特点1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育 一个现代化的发酵工业必须具有一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种优良的菌种、合合适的工艺和先进的设备适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制严格的检测与控制，其中，其中菌种菌种是主体是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良性能而考虑和设其他则是为了充分发挥菌种的优良性能而考虑和设计的。计的。能用于发酵生产的微生物即为能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它们具工业微生物，它们具有个体

4、小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能力强、易变有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能力强、易变异改造异改造等特点。等特点。第5页，本讲稿共70页1.2 1.2 发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求1)能在能在廉价原料制成的培养基上廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且产量高；迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且产量高；2）培养条件）培养条件易于控制易于控制；3）生长速度快，）生长速度快，发酵周期短发酵周期短；4）满足代谢控制的要求；）满足代谢控制的要求；5）抗噬菌体和杂菌的能力强；）抗噬菌体和杂菌的能力强；6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化；）遗传性状稳定，菌种不易变异

5、退化；7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义；要意义；8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳源利用；）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳源利用；9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。以保证安全。第6页，本讲稿共70页 地球上的微生物资源非常丰富，目地球上的微生物资源非常丰富，目前已发现的仅占其

6、总数的前已发现的仅占其总数的1%5%，而在，而在工业生产中被利用的仅有工业生产中被利用的仅有数百种数百种，分属，分属于于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌、藻类菌、藻类。1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种 发酵工程发酵工程第7页，本讲稿共70页放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：目前发现的生物来源如下：已工业化产品生

7、产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种第8页，本讲稿共70页二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵代谢控制发酵：用用人工诱变的方法人工诱变的方法，有意识地改变微生，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。2020世纪世纪50-6050-60年代以氨基酸发酵为代表的年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发代谢控制发酵酵，是发酵工业发展历史上的一个转

8、折点：，是发酵工业发展历史上的一个转折点：1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍第9页，本讲稿共70页HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸和异亮氨酸的合成调节机制的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物第10页，本讲稿共70页氨基酸生产菌的要求：氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，简单代

9、谢途径比较清楚，简单谷氨酸发酵的菌种：谷氨酸发酵的菌种：其他氨基酸生产菌：其他氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌草芽孢杆菌1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物第11页，本讲稿共70页三、食品酶制剂生产有关的微生物三、食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。开发一个新酶，都要经过一系

10、列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到关于食品用酶，美国需要得到FDAFDA的批准。目前已同意的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌菌和地衣牙孢杆菌1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍第12页，本讲稿共70页三、常用的基因表达系统(一一)原核生物：原核生物：大肠杆菌大肠杆菌(1977(1977年年Boyer)Boyer)、枯草牙胞杆菌、枯草牙胞杆菌 沙门

11、氏菌沙门氏菌q 生长迅速、蛋白产量高生长迅速、蛋白产量高;q 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；表达蛋白的纯化、分离及分析快速；q 外源基因的导入相对容易；外源基因的导入相对容易；q 已建立了整套表达理论及技术。已建立了整套表达理论及技术。l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种第13页，本讲稿共70页(二二)真核细胞表达系统真核细胞表达系统 酵母酵母(既是微生物又是真核细胞既是微生物又是真核细胞)l 生长迅速，营养要求不高，易培养；生长迅速，营养要求不高，易培养；l 安全性好；安全性好；l 比哺乳动物细胞操作简单；比哺乳

12、动物细胞操作简单；l 具有一定的修饰蛋白的能力。具有一定的修饰蛋白的能力。1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍第14页，本讲稿共70页 中国仓鼠卵巢细胞（中国仓鼠卵巢细胞（CHOCHO细胞）表达系统细胞）表达系统q 具有准确的转录后修饰功能；具有准确的转录后修饰功能；q 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；具有重组基因的高效扩增和表达能力；q 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；q CHO很少

13、分泌自身的内源蛋白。很少分泌自身的内源蛋白。1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍第15页，本讲稿共70页微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来礼来(Eli lilly),(Eli lilly),

14、花了花了1010年的时间从年的时间从4040万株微万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍第16页，本讲稿共70页一、菌种分离的一般过程一、菌种分离的一般过程样品采集样品采集预处理预处理 增殖培养增殖培养 纯培养纯培养 菌种的鉴定菌种的鉴定问题：问题：如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一

15、株高产目的产物的微生物1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 生产性能测定生产性能测定复合酶系复合酶系复合菌系复合菌系第17页，本讲稿共70页二、采样时要注意的问题二、采样时要注意的问题l 气候、水分、空气气候、水分、空气l 来源要广来源要广l 结合产品的特点结合产品的特点l 标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离第18页，本讲稿共70页富集的三种方案：l 定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的

16、微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。得可能。l 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，类学中考虑，l 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法时只能通过随机分离的办法1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离第19页，本讲稿共70页定向培养的方法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，物理方法：加热、膜过滤等，但主要是通过培养的方法但主要是通过培养的方法1.4 1.4 工业微生物菌种的

17、分离工业微生物菌种的分离三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm第20页，本讲稿共70页定向培养的富集方法定向培养的富集方法1 1、底物、底物2 2、pHpH条件条件3 3、培养时间、培养时间4 4、培养温度、培养温度等一切能提高目的微生物相对生等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液长速度的手段，培养（固体、液体；分批、连续）后使目的微生体；分批、连续）后使目的微生物在种群中占优势。物在种群中占优势。三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法第21页，本讲

18、稿共70页四、菌落的选出四、菌落的选出q 从产物角度出发从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素q 从形态的角度从形态的角度 菌菌落落的的外外观观形形态态，是是微微生生物物的的一一个个重重要要表表征征。如如多多糖糖产产生生菌菌在在适适当当的的培培养养基基上上生生长长，从从具具有有粘粘液液性性的的菌菌落落外外观观上就可以初步识别。上就可以初步识别。1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离第22页，本讲稿共70页实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌

19、的筛选采样（造纸厂）采样（造纸厂）80 30 min处理处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34 d，选择有，选择有凹陷圈凹陷圈的菌落的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离第23页，本讲稿共70页实例：醛肟水解酶的筛选实例：醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002),65

20、-72培养基中含培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔每隔23 d移去一半培养物，补充新鲜培养基移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，不断分析样品，2-3个月后个月后Z-PAOx降低后，稀释分离菌落降低后，稀释分离菌落1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离第24页，本讲稿共70页五、目的微生物富集方法的研究进展五、目的微生物富集方法的研究进展q 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同同 源性分析，基因序列分析及源性

21、分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等杂交技术等q 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%，微生物的微生物的 多样性及资源的开发多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。仍然是今后若干年的研究重点。陈文新（科学院院士）陈文新（科学院院士），2002q In contrast to this traditional approach,modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening,which also enables access to e

22、nzymes of nonculturable organisms.By this strategy,for instance,the company Diversa(San Diego,CA,USA)identised 120 unique esterases/lipases from only 16%of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.FEMS Microbiology Reviews 26(2002)73811.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离第25页，本讲稿共70页目的l 提高生产能力提高生产

23、能力l 提高产品质量提高产品质量l 开发新产品开发新产品l 解决生产实际问题解决生产实际问题l 防止菌种退化防止菌种退化1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育第26页，本讲稿共70页方法基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易位点突变、易位PCR、同序法、同序法DNA Shuffling等等1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育第27页，本讲稿共70页自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9。自然突变有两种情况自然突变

24、有两种情况：一一种种是是我我们们生生产产上上所所不不希希望望看看到到的的，表表现现为为菌菌株株的的衰衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另另一一种种是是我我们们生生产产上上希希望望看看到到的的，对对生生产产有有利利，这这种种突突变成为正突变。变成为正突变。一、自然选育一、自然选育1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育第28页，本讲稿共70页自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义自自然然选选育育虽虽然然突突变变率率很很低低，但但却却是是工工厂厂保保证证稳稳产产高高产产的的重要措施。重要措施。回回复复突突变变：高高产产菌菌株株

25、在在传传代代的的过过程程中中，由由于于自自然然突突变变导导致致高高产产性性状状的的丢丢失失，生生产产性性能能下下降降，这这种种情情况况我我们们称称为为回回复复突变突变问题：问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育第29页，本讲稿共70页自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落发酵试验发酵试验1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育注意形态的观察

26、注意形态的观察选择性培养法选择性培养法随机分离法随机分离法平板划线法平板划线法平板稀释法平板稀释法第30页，本讲稿共70页二、诱变育种二、诱变育种用用各各种种物物理理、化化学学的的因因素素人人工工诱诱发发基基因因突突变变进进行行的的筛筛选选，称为称为诱变育种。诱变育种。诱诱变变剂剂：能能够够提提高高生生物物体体突突变变频频率率的的物物质质称称为为诱诱变变剂剂（P103）诱变剂诱变剂物理：紫外，快中子，射线，激光物理：紫外，快中子，射线，激光化学：硫酸二乙酯（化学：硫酸二乙酯（DES），亚硝基胍（），亚硝基胍（NTG）生物：噬菌体，转座子生物：噬菌体，转座子1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵

27、高产菌种的选育第31页，本讲稿共70页（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂的选择诱变剂的选择出发菌株的选择出发菌株的选择（一）、诱变育种的原理（一）、诱变育种的原理 诱诱变变育育种种的的理理论论基基础础是是基基因因突突变变，突突变变主主要要包包括括染染色体畸变和基因突变两大类。色体畸变和基因突变两大类。压硝酸：压硝酸：0.07MNa0.07MNa2 2HPOHPO4 4亚硝基胍：亚硝基胍：1MNaOH1MNaOH二、诱变育种二、诱变育种第32页，本讲稿共70页（三）、

28、诱变育种的一般步骤（三）、诱变育种的一般步骤（P103）二、诱变育种二、诱变育种诱变育种一般包括诱变育种一般包括诱变和筛选诱变和筛选两个部分。两个部分。诱变诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。筛选筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到达到诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到达到高高产菌株产菌株。第33页，本讲稿共70页（三）、诱变育种的一般步骤（三）、诱变育种的一般步骤二、诱变育种二

29、、诱变育种出发菌株的选择出发菌株的选择制备菌悬液制备菌悬液诱变处理诱变处理突变菌株的筛选突变菌株的筛选营养缺陷型突变菌株的筛选营养缺陷型突变菌株的筛选抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株的筛抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株的筛选选组成型突变株的筛选组成型突变株的筛选抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选自然界直接分离到的野生型菌株自然界直接分离到的野生型菌株经历过生产条件考验的菌株经历过生产条件考验的菌株已经历多次育种处理的菌株已经历多次育种处理的菌株随随机机筛筛选选形形态态理理化化性性质质第34页，本讲稿共70页HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制的合成调节

30、机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似物抗性：Lys的类似物的类似物AEC,Thr的类似物的类似物AHV营养缺陷型营养缺陷型：如如Thr缺陷型缺陷型第35页，本讲稿共70页黄色短杆菌黄色短杆菌F9-50的诱变谱系的诱变谱系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-)lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (leu-,Thr-)20.8 g/lF9-50(leu-,Thr-,AEC r)33.5 g/l第36页，本讲稿共70页三、基因的直接进化三、基因的直接进化(directed evolution)q

31、突变 基因突变库的建立基因突变库的建立q 筛选 基因突变库的筛选基因突变库的筛选q 基因复制与遗传步骤：步骤：在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育第37页，本讲稿共70页主要应用：主要应用：酶活性能的提高酶活性能的提高:生理环境生理环境工业催化环境工业催化环境l pHl 温度温度l 有机溶剂有机溶剂l 底物专一性底物专一性第38页，本讲稿共70页脂酶拆分脂酶拆分2-2-甲基癸酸硝基苯酯甲基癸酸硝基苯酯例：例：PLAPLA

32、PLA光学拆分选择性光学拆分选择性(%)(%)231577581905 5次错位次错位PCR 2PCR 2次定点突变次定点突变Reetz(1997)Liebeton(2000)Reetz(1997)Liebeton(2000)第39页，本讲稿共70页定定点点突突变变第40页，本讲稿共70页错位错位PCR第41页，本讲稿共70页DNA改组改组(DNA Shuffling):指指DNA分子的体外重排，是基分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。DNA改组技术改组技术(1994)的发明人的发明人Stemmer博士，他以博士

33、，他以5项美国专利项美国专利为技术支撑点，于为技术支撑点，于1997年创立了专门从事年创立了专门从事DNA改组研究的公司改组研究的公司Maxygen。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司 duPont公司、公司、生产抗生素的世界巨头生产抗生素的世界巨头 DSM公司和工业酶研究生产之最的公司和工业酶研究生产之最的Novo nordisk公司。此外，迄今为止，公司。此外，迄今为止，Maxygen公司还得到了来自美公司还得到了来自美国国防高级研究计划局国国

34、防高级研究计划局(DARPA)和国家科学技术协会和国家科学技术协会(NIST)的的5项资助，共计项资助，共计2100万美元。从另一角度反映了万美元。从另一角度反映了DNA改组的重要改组的重要性及美国政府及商家对性及美国政府及商家对DNA改组技术的重视程度。改组技术的重视程度。第42页，本讲稿共70页图图1有性有性PCR法改组法改组DNA的基本程序的基本程序DNA shuffling第43页，本讲稿共70页 图图2交错延伸法改组交错延伸法改组DNA的基本程序的基本程序DNA shuffling第44页，本讲稿共70页X XXX X XX X XX X XXX X XX XX XXX XX X X

35、 XX X XXX XX XXX XX X X XX X XXX X XX X XX XXX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select bestwith DNAseI fragments recombinantsRepeat for multiple cyclesDNA shuffling 发酵工程发酵工程第45页，本讲稿共70页项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNA ShufflingDNA Shuffling与常规

36、定向进化的比较与常规定向进化的比较 发酵工程发酵工程第46页，本讲稿共70页类 型示 例特 性活性增加倍数 潜在应用领域抗体人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药-内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P5337半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药部分DNA Shuffling技术的研究成果第47页，本讲稿共70页DNA改组改组(DNA Shuffling)技术的应用领域技术的应用领域分类分类用途用途

37、进化进化DNA转基因；疫苗载体；转基因；疫苗载体；DNA疫苗；表达载疫苗；表达载体；基因转移载体体；基因转移载体进化蛋白进化蛋白基因治疗用酶；细胞因子；生长因子；基因治疗用酶；细胞因子；生长因子；抗体；工业酶抗体；工业酶进化生物体进化生物体 植物；科研用生物体；化学及药物加工；植物；科研用生物体；化学及药物加工；疫苗有机体；石油加工；除污生物疫苗有机体；石油加工；除污生物第48页，本讲稿共70页1）菌种的退化及原因）菌种的退化及原因菌菌种种退退化化：指指在在较较长长时时期期传传代代保保藏藏后后，菌菌株株的的一一个个或或多多个个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。生理性状和形态特征逐渐减退或

38、消失的现象。常常见见的的菌菌种种衷衷退退在在形形态态上上表表现现为为分分生生孢孢子子的的减减少少或或菌菌落落颜颜色色的的改改变变，与与由由于于环环境境条条件件变变化化而而引引起起菌菌落落形形态态和和生生理上的变异是不同的理上的变异是不同的。1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏菌菌种种退退化化的的原原因因：基基因因突突变变、变变异异菌菌株株性性状状分分离离、其其他他因因素（温度、湿度、培养基成分及各种培养条件）素（温度、湿度、培养基成分及各种培养条件）第49页，本讲稿共70页1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏狭狭义义的的菌菌种种复复壮壮指指在在菌菌种种已已发发生生衰衰退

39、退的的情情况况下下，通通过过纯纯种种分分离离和和测测定定生生产产性性能能等等方方法法，从从衰衰退退的的群群体体中中找找出出少少数数尚尚未未衰衰退退的的个个体体，从从而而达达到到恢恢复复该该菌菌原有典型性状的目的。原有典型性状的目的。广广义义的的菌菌种种复复壮壮指指在在菌菌种种的的生生产产性性能能尚尚未未衰衰退退前前，就就经经常常有有意意识识地地进进行行纯纯种种分分离离和和生生产产性性能能测测定定工工作作，从而逐步提高菌种的生产特性。从而逐步提高菌种的生产特性。2）菌种的复壮）菌种的复壮第50页，本讲稿共70页一、退化菌种的复壮一、退化菌种的复壮1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏

40、常常用用的的方方法法是是对对已已退退化化菌菌株株用用一一定定培培养养条条件件进进行行单单细细胞胞分分离离纯纯化化，从从而而限限制制退退化化菌菌株株在在数数量量上上占占优优势势，最最后后淘淘汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。纯纯种种分分离离的的方方法法常常用用的的有有三三种种：稀稀释释分分离离法法、平平板板划划线法和组织分离法（用于高等真菌）。线法和组织分离法（用于高等真菌）。2）菌种的复壮）菌种的复壮第51页，本讲稿共70页1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏二、通过寄生进行复壮二、通过寄生进行复壮 寄寄生生型型微微生生物物的的退退化化可可接接种种到到

41、相相应应寄寄生生体体内内以以提提高菌株的活力。高菌株的活力。三、联合复壮三、联合复壮 对对退退化化菌菌株株还还可可用用剂剂量量的的紫紫外外线线辐辐射射和和低低剂剂量量的的亚亚硝基胍（硝基胍（NTC）联合处理进行复壮。）联合处理进行复壮。2）菌种的复壮）菌种的复壮第52页，本讲稿共70页3）防止菌种退化的措施）防止菌种退化的措施合理的育种合理的育种选用合适的培养基选用合适的培养基创造良好的培养条件创造良好的培养条件控制传代次数控制传代次数利用不同类型的细胞进行移种传代利用不同类型的细胞进行移种传代选择有效的保选择有效的保藏方法藏方法1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏第53页，本讲稿

42、共70页4）菌种）菌种保藏保藏 菌菌种种保保藏藏的的意意义义：是是进进行行微微生生物物学学研研究究和和微微生生物物育育种种工工作作的的重重要要组组成成部部分分。其其任任务务首首先先是是菌菌种种不不死死亡亡，同同时时还还要要尽尽可可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 菌菌种种保保藏藏的的原原理理：根根据据菌菌种种的的生生理理生生化化特特点点，采采用用低低温温、干干燥燥、缺缺氧氧、缺缺乏乏营营养养、添添加加保保护护剂剂或或酸酸中中中中和和剂剂等等方方法法，使使孢子或菌体的生长代谢活

43、动尽量降低，以减少其变异。使使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。第54页，本讲稿共70页4）菌种）菌种保藏保藏1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 蒸馏水悬浮法蒸馏水悬浮法 斜面低温保斜面低温保藏藏 石蜡油封保藏石蜡油封保藏 菌种菌种保藏的方法保藏的方法 砂土管保藏砂土管保藏 冷冻保藏冷冻保藏 真空冻干保藏真空冻干保藏 寄主保藏寄主保藏（病毒、立克次氏体、螺旋体等不能人工培养）（病毒、立克次氏体、螺旋体等不能人工培养）基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏普通冷冻冷冻保藏技术普通冷冻冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术第55页，本

44、讲稿共70页小小 结结 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有 特定的微生物特定的微生物(动、植物动、植物)才具有大量表达的潜力；才具有大量表达的潜力；传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是 自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；目前土壤中已分离的微生物不到总数的目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%1%，微生，微生 物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生基因重组、直接进化技术的应用，大

45、大加快了生 物产品开发的进程。物产品开发的进程。1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育第56页，本讲稿共70页3.1 菌体组成和细胞外代谢产物菌体组成和细胞外代谢产物3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备第二章第二章 菌种的制备菌种的制备http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm第57页，本讲稿共70页3.1 菌体组成和细胞外代谢产物菌体组成和细胞外代谢产物3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备1）菌体组成：）菌体组成：?2）胞外代谢产物）胞外代谢产物 胞外产物多达胞外产物多

46、达37大类，根据微生物代谢产物和生长繁殖的关大类，根据微生物代谢产物和生长繁殖的关系不同，分为两大类：系不同，分为两大类：一类是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，称为一类是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，称为初级代谢产初级代谢产物物，此类产物的生产菌种主要是，此类产物的生产菌种主要是细菌、酵母、霉菌细菌、酵母、霉菌等。等。另一类代谢产物与微生物生长繁殖无明确关系，称为另一类代谢产物与微生物生长繁殖无明确关系，称为次级代谢产次级代谢产物物，如抗生素、生物碱、色素等。发酵工业用来生产次级代谢产，如抗生素、生物碱、色素等。发酵工业用来生产次级代谢产物的微生物仅有少数几个类群，主要是物的微生物仅

47、有少数几个类群，主要是丝状放线菌、丝状真菌丝状放线菌、丝状真菌等。等。第58页，本讲稿共70页3.1 菌体组成和细胞外代谢产物菌体组成和细胞外代谢产物3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备3）微生物的营养类型（）微生物的营养类型（nutritional types)碳源利用碳源利用自养型自养型（autotrophs）异养型异养型（heterotrophs）能量来源能量来源光能营养型光能营养型（Phototrophs）化能营养型化能营养型（chemotrophs）光能无机自养型光能无机自养型（Photo-Lithoautotrophy）化能有机异养型化能有机异养型（Photoorganohet

48、erotrophy）化能无机自养型化能无机自养型（chemoLithoautotro-phy）化能有机异养型化能有机异养型（chemoorganoheterotrophy）第59页，本讲稿共70页3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备1）培养基的营养成分及来源）培养基的营养成分及来源 培养基培养基（medium)是人们提供微生物生长繁殖和生物合成是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。包括：物。包括：碳源碳源(sourc

49、e of carbon)氮源氮源(source of nitrogen)无机盐无机盐(inorganic salt)生长因子生长因子(growth factor)水水(water)第60页，本讲稿共70页3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备2）培养基的类型和用途）培养基的类型和用途来源：来源：天然天然培养基（培养基（complex medium；undefined medium）合成合成培养基（培养基（synthetic medium；defined medium）半合成培养基半合成培养基（semidefined medi

50、um）外观：外观：固体固体培养基（培养基（solid medium）液体液体培养基（培养基（liquid medium）半固体培养基半固体培养基（semisolid medium）功能：功能：孢子孢子培养基（培养基（sporemedium）和种子培养基。和种子培养基。第61页，本讲稿共70页3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备3）培养基的配制原则）培养基的配制原则 选择适宜的营养物质、营养物质浓度及配比合适、选选择适宜的营养物质、营养物质浓度及配比合适、选择合适的择合适的pH、氧化还原电势、营养成分的加入顺序、氧化还原电势