《山羊IGFBP-6基因的克隆及其组织表达的发育性变化-游杰讲解学习.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《山羊IGFBP-6基因的克隆及其组织表达的发育性变化-游杰讲解学习.doc（27页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。山羊IGFBP-6基因的克隆及其组织表达的发育性变化-游杰-山羊IGFBP-6基因的克隆及其组织表达的发育性变化动物科学（特种经济动物养殖方向）2008级游杰指导教师张红平教授摘要：IGFBPs在体内循环系统中能与IGFs结合，延长IGFs的半衰期，调节IGFs的代射清除率，提高IGFs的生物学效应。肝脏和局部组织分泌的IGFBPs共同调控各个组织的生长与发育，从而促进动物机体的生长。本研究以培育品种南江黄羊为试验材料，应用RT-PCR和克隆技术克隆山羊IGFBP-6基因的全编码区序列，采荧光定量PCR
2、技术研究该基因在南江黄羊生后5个时间点（0d、30d、60d、90d、120d）和6个组织（肝脏、肺、心脏、背最长肌、半膜肌和臂三头肌）的发育性变化。结果表明：克隆得到南江黄羊IGFBP-6基因的CDS全序列长度为711bp，编码235个氨基酸，该基因的核苷酸、氨基酸序列同绵羊的一致性为97%，与其他物种间的一致性也较高；在各个时间点的各个组织中都检测到IGFBP-6基因的表达，但相对表达量存在一定的差异。IGFBP-6在背最长肌的基因表达量远远高于肝脏、心脏、脾脏、肺脏和其它肌肉等组织的表达量（0.01P0.05或P0.01），在肝脏中的表达量最低。关键词：南江黄羊；IGFBP-6基因；克隆
3、；荧光定量PCR；表达CloningofGoatIGFBP-6GeneanditsDevelopmentalChangeinTissueExpressionYouJie,Animalscience(Specialeconomicalanimalbreeding),Grade2008SupervisedbyProfessorZHANGHongpingAbstract:IGFBPs(insulin-likegrowthfactors,IGFs)familyplayanimportantroleinmaintainingnormalphysicalactivitiesandprocesses,inc
4、ludingembryodifferentiation,bodydevelopment,sugar,lipidandproteinmetabolism.IGFBPscanprolongthehalf-lifeofIGFs,enhanceitsbiologicalactivityandregulateitsmetabolismclearancebybindingIGFsincirculationsystem.IGFBPssecretedfromliverandotherlocaltissuescanregulateandstimulategrowthoftissuescorporately.In
5、thisstudy,Nanjiangyellowgoatwaschooseasexperimentalmaterial.RT-PCRandcloningtechnologywereemployedtoclonethefullcodingsequenceofIGFBP-6genesoutthetotalRNAsextractedfromlivertissueat0dafterbirth,followedbyusingofQ-PCRtoidentifytheprofileofgeneexpressionindifferenttissues(liver,lung,heart,longissimusd
6、orsi,semimembranosus,musculustriceps)andatdifferenttimepoints(0d、30d、60d、90d、120dafterbirth).Theresultsindicate:(1)WehaveclonedtheCDSfullsequenceofIGFBP-6(711bp),whichencodingapeptideconsistsof235aminoacidresidues.ThenucleotideandaminoacidsequenceofIGFBP-6possesshighhomogeneitywithsheep-about97%ofit
7、ssequence-aswellasotherspices;(2)WehavedetectedtheexistenceofIGFBP-6mRNAinalltissuesandateachtimepointswechoose,buttheexpressionleveldifferfromeachother.Itexpressmorehigherinlongissimusmusclethanliver,heart,lungandothermuscletissues(0.01P0.05orP0.01),whileinliver,itsexpressionreachedthelowestlevelre
8、latively.KeyWords:Nanjiangyellowgoat,IGFBP-6,Clone,Q-PCR,Expression1文献综述1.1IGFBPs的研究进展1.1.1IGFs简介胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactors,IGFs）系统在正常生理活动中起着极为重要的作用，其与胚胎分化、个体发育密切相关，而且参与糖、脂肪和蛋白质代谢。IGF家族由2个生长因子(IGF-I和IGF-II)、IGF受体(IGF-IR和IGF-IIR)、IGF结合蛋白(IGFBPs)及IGF蛋白水解酶组成。IGF-I和IGF-II结构与胰岛素相似，是两个同源性较高、分子量大约为
9、7KDa的多肽类激素1。Salmon和Daughaday(1957)在研究生长激素(growthhormone,GH)作用时，首次发现了血清中含有胰岛素样作用的促生长因子，命名为“硫化因子”2，因其具有拟胰岛素样活性3和刺激增殖活性4命名为生长调节素5，随后被命名为IGFs6。IGFs在许多组织中均有表达，IGFs除了通过旁分泌方式发挥作用外7，还可以在局部以自分泌的方式促进细胞增殖8。IGFs通过与细胞表面特定受体(IGF-I受体和IGF-II受体)结合发挥其生物学作用，也可以与胰岛素受体结合发挥作用。IGFs主要通过与IGF-I受体结合发挥促进有丝分裂的作用，IGF-I受体与胰岛素受体结构
10、相近，均具有受体酪氨酸激酶活性。IGF-II受体与胰岛素受体无同源性，主要与IGF-II结合。IGF-II受体对IGF的调节作用目前尚不清楚9。存在于血液和细胞间隙中的IGFs绝大部分与IGF结合蛋白(IGFBPs)结合。IGFs与IGFBPs的亲和力高于IGF-I受体，因此IGF生物活性和对IGF的代谢与IGFBPs密切相关10。1.1.2IGFBPs的概况胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactors,IGFs）系统在正常生理活动中起着极为重要的作用，其与胚胎分化、个体发育密切相关，而且参与糖、脂肪和蛋白质的代谢11。IGFBPs是IGFs的重要组成之一，IGFBPs
11、对于调节IGFs的生物学功能主要表现在以下四个方面：(1)IGFs运载蛋白的作用，并可调节血液中游离IGFs含量；(2)延长IGFs的半衰期，调节IGFs的代射清除率；(3)对特异性组织、细胞进行识别和定位；(4)调节IGFs的生物学效应，通过调节IGFs和IGFs受体的相互作用来完成；(5)不用依赖于IGFs而直接调节正常和恶性细胞的生长12-15。目前发现IGFBPs家族有6个成员，分别命名为IGFBP16。IGFBPs在氨基酸结构上高度保守，在总蛋白质中有35%左右氨基酸是同源的。IGFBPs具有一些共同结构和特征，都能与IGFs结合，同源性较高。它们在人体组织和器官中分布不同，虽然都能
12、与IGFs结合，但产生的生物学作用也不尽相同16。1.1.3IGFBPs的结构和功能IGFBPs成熟蛋白均由200300个氨基酸残基组成，其中2040个氨基酸残基形成信号序列，并含有18个半胱氨酸残基，组成9对链内二硫键。如果把IGFBPs平均分成三个区，即N端区、中间区、C端区，则其中12个Cys分布在N端区，另6个分布在C端区，但N端区和C端区之间无二硫键连接16。上述氨基酸的排列相当保守，表明二硫键在形成高亲和力的IGFs位点中起重要的作用。但也有例外，在人和鼠中IGFBP-6分别缺乏2个和4个氨基酸；而IGFBP-4则含有20个半胱氨酸残基。在N端区域中，IGFBPs存在保守的GCGC
13、CxxC模体，但IGFBP-6为GCAEAEGC结构，该结构的意义还不清楚。另外IGFBPs的成员一些特殊结构，IGFBP3-6均有糖基化现象，除IGFBP-6的糖基化位点在C端外，IGFBP3-5均位于肽链中间区17。IGFBP1-2结构中没有糖基化的现象，但在其C端区域均保留有Arg-Gly-Asp(RGD)一致序列。IGFBP-6参与生长、发育、生殖及血糖等生理过程，是一个多功能蛋白。在人和猪上IGFBP-6研究较多。人IGFBP-6的研究主要集中于肿瘤的抑制。顾以韧等18采用荧光定量PCR技术检测了长白猪和梅山猪的背最长肌组织中IGFBP-6基因的表达丰度，研究结果显示IGFBP-6基
14、因在两猪种中表达模式相似，均在4月龄时表达量达到最高后出现极显著下降。这些都证明了IGFBP-6在肌肉的生长中具有重要的作用。而在山羊研究的比较少。针对于其与IGF-II高亲和力的特点，可以推测其可能的生物学作用。近几年研究也表明，IGF-II在胎儿生长发育，肿瘤细胞增殖和肌肉生长等方面具有重要调控作用，是影响山羊产肉量的主要候选基因。IGF-II在生长发育中具有重要作用，IGFBP-6可能通过与IGF-II结合而间接影响生长。2本研究的目的和意义本研究采用基因克隆、实时荧光定量等现代分子生物学技术，以我国培育的第一个肉用山羊品种南江黄羊为研究对象,克隆南江黄羊IGFBP-6基因CDS区序列，
15、研究IGFBP-6基因在南江黄羊出生后的不同时期以及同一时期不同组织的表达变化规律，以揭示山羊早期生长发育的基因调控与表达规律，为我国肉用山羊的分子标记辅助选择、品种分子设计以及快速培育肉用山羊新品种（系）提供科学依据。3材料与方法3.1试验材料3.1.1试验动物试验动物来自巴中市南江县南江黄羊育种场，生后0d选取2头公羊和2头母羊，生后30d、生后60d、生后90d和生后120d等4个时间点各选取了3头公羊和3头母羊，共28头羊（见表1）。随机选取符合时间段的羊宰杀，取其心脏、肝脏、肺脏、背最长肌、半膜肌、臂三头肌共6个组织。采样后快速置于液氮中带回试验室，放置于-80冰箱中保存备用。表1采
16、样信息表Table1Informationofsample日龄Day0d30d60d90d120d雄性Male23333雌性Female233333.1.2仪器与试剂3.1.2.1主要仪器微量可调移液器；梯度PCR仪；紫外透射仪TMW-20；核酸蛋白检测仪SmartSpecTMPlus；电子天平；水平电泳仪；常温冰箱；低温冰箱-20；超低温冰箱-80，；超净工作台；RT-PCR仪。3.1.2.2主要试剂盒与试剂Trizol总RNA抽提试剂盒，氯仿、无水乙醇，反转录试剂盒，2TaqPCRMasterMix，DNA胶回收试剂盒，克隆载体试剂盒，实时荧光定量PCR试剂盒3.2试验方法3.2.1总RN
17、A的提取按照上海生工Trizol总RNA抽提试剂盒（UNIQ-10柱式）说明书提取组织总RNA。3.2.2总RNA质量检测l%的琼脂糖凝胶电泳，检测RNA质量，对符合要求的总RNA样品，用核酸蛋白检测仪在260nm和280nm下测定吸光度，按A260/A280接近2.0(可接受范围为1.9-2.1)评估总RNA样品纯度。3.2.3引物设计检索NCBIGenBank数据库中公布绵羊（Ovisaries）的IGFBP6基因的基因登录号，分别为NM_001134308，并下载其序列。采用Prime5.0软件对这个基因序列设计引物，包括完整的开放阅读框，并用Oligo6.0进行评价，设计的引物采用NC
18、BI网站BLAST工具进行比对检索，验证引物的特异性，引物信息如表2。引物由大连宝生物公司合成。表2IGFBP-6基因的引物信息表Table2PrimerpairsdesignedforIGFBP-6genes基因Gene引物序列Sequenceofprimer扩增温度Tm片段大小LengthIGFBP-6F：5-AGCTTTGCTGCGACTGCTCT-359801bpR：5-ATGCTCCTGCCAGTGGCCTT-33.2.4cDNA第一条链合成（1）RNA变性：将模板RNA65水浴5分钟，立即置于冰上冷却（对容易形成高级结构的RNA可提高逆转录效率）。（2）按照下表的逆转录体系配制混合
19、液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5秒钟，简短离心，并置于冰上，如果要做多个逆转录反应，可以将配制好的混合液后分装在单个反应管中，置于冰上。（3）逆转录反应，先37，15分钟；然后98，5分钟（酶失活），反应结束后，将所得的cDNA于-20保存。表3RT反应体系Table3RTReactionsystem试剂名称体积5RTbuffer8lRTEazymemix2lPrimermix2lRNAaseInhibitor2lRNase-freeH2O18l模板总RNA4l总体积40l3.2.4荧光定量PCR引物设计根据已克隆得到的IGFBP-6的CDS区序列，选择-actin作为内参基因，利用Prim
20、er5软件设计引物，引物由上海生物工程生物技术服务有限公司合成。3.2.5引物特异性检测取所有组织经反转录得到的cDNA各1l，加入到相应的反应体系中，设定退火温度梯度为55-65，分别对每个基因的熔解曲线进行分析，检测引物的特异性。同时根据熔解曲线确定每个基因的最佳退火温度（Ct值最小）。将产物经2琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异目的片段。3.2.6标准品的制备分别取每个基因（Ct值最小的管）扩增产物溶液10l，加入90l去离子水进行稀释，作为原始管。然后从原始管中取稀释液50l，加入450l去离子水进行稀释后作为第一管。接着从第一管中取稀释液50l，加入450l去离子水进行稀释后作为第二管。如此反
21、复，进行10倍浓度梯度稀释。各梯度稀释液作为标准品备用。3.2.7标准曲线的绘制取10-110-10的标准品各1l加入到相应的反应体系中，在同样的反应条件下(除退火温度不同外)进行扩增。根据荧光定量PCR仪绘制的PCR动力学曲线，以样品的拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，分别绘制IGFBP-6和-actin基因的标准曲线。3.2.8实时荧光定量PCR将模板cDNA解冻，取1l样品建立12.5l反应体系。反应体系如表3。体系配好后彻底混匀，上机，最后通过标准曲线来计算未知样品的起始拷贝数。反应体系在伯乐iq5荧光定量PCR仪上进行。检测中为每个待测样品cDNA设置3个重复，对得到的3个Ct值
22、取平均值，以备带入公式进行计算。反应条件如下：95预变性30s。然后95变性5s，63.5退火30s，72延伸15s，共40个循环。熔解曲线分析：951min，551min。然后从55开始，每个循环温度增加0.5，时间为10s，81个循环，整个过程收集荧光。根据样品荧光曲线和内参荧光曲线的Ct值计算定量结果。表4PCR反应体系Table4PCRReactionsystem组成成分12.5l体系2.5RealMasterMix/20SYBRsolution5.65l正向引物(10uM)0.2l反向引物(10uM)0.2lcDNA模板1lRNase-freeH2O5.45l2.2.9统计分析采用相
23、对定量解析方法，选用-actin作为看家基因，对扩增效率达到要求的样品，根据定量仪器自带分析软件计算各基因各时间点的拷贝数，以目的基因mRNA的拷贝数（单个部位的不同时间点/单个时间点不同部位的样品的最大拷贝数设为1）与对应样品内参基因mRNA的拷贝数（单个组织的不同时间点/单个时间点不同组织最大拷贝数设为1）的比值表示基因mRNA的相对表达量。运用SAS8.0软件的PROCGLM程序进行最小二乘分析，结果以最小二乘均数标准差表示，用Duncan法进行均数间的多重比较。3试验结果与分析3.2荧光定量分析3.2.1Real-timePCR标准曲线的建立根据回收的标准品DNA，按照110-3110
24、-9的范围梯度内进行IGFBP-6基因及看家基因的定量反应。得到2条Real-timePCR标准曲线。-actin基因标准曲线的扩增效率在98.3%98.6%之间，相关系数在0.9971.000之间，得到的标准的扩增效率及拟合度较好，选择的5个或6个点均匀分布在标准曲线上，可以用于表达量定量的分析。3.2.2荧光定量PCR扩增产物的特异性在荧光定量PCR扩增程序中，设定扩增产物的溶解曲线。荧光定量PCR反应完成后，将反应产物温度降低到55，然后每10sec升高0.5，同时实时检测SYBRGreen的荧光信号强度。随着温度升高，DNA双链打开，荧光信号逐渐降低。当DNA解链时，荧光信号强度降急剧
25、降，此时的温度为融解温度(Tm)。对于某一特定的产物，其DNA链的长度和C+G含量决定其Tm，因此其Tm值固定。通过对扩增产物Tm值分析，可以衡量扩增的特异性（如图3）。AB图3IGFBP-6和-actin基因的扩增产物熔解曲线Fig.3MeltcurveofIGFBP-6and-actingeneamplificationproduct结果表明：各个基因扩增产物的溶解曲线均为单峰曲线。表明各个基因的荧光定量PCR扩增过程中，没有非特异性产物和引物二聚体形成，扩增过程的荧光信号均为特异扩增产物的荧光信号。3.5IGFBP-6基因的表达差异3.5.1IGFBP-6基因的性别表达差异IGFBP-6
26、基因的性别表达在不同时间段器官中存在差异，如表4、5和图5。IGFBP-6基因在在出生0d的背最长肌组织中mRNA的表达量、在出生90d的半膜肌中、出生后120d的肝脏和心脏组织中在公母羊之间存在极显著差异（P0.01），在出生后90d的肝脏和心脏组织中mRNA的表达量在公母羔羊之间存在显著差异（P0.05）。在肝脏、心脏、肺脏、肌肉组织中，其他各时间点IGFBP-6基因表达量在性别之间差异不显著（P0.05）。3.5.2IGFBP-6基因的组织表达差异根据出生后各阶段不同组织IGFBP-6基因表达量的差异，如图4，基本呈现背最长肌表达量最高，IGFBP-6基因表达量总是极显著高于其他组织（P
27、0.01），其次为肺脏和心脏组织，其它组织的表达量最低。另外，肺脏组织在出生后30d的IGFBP-6基因表达量是极显著高于除背最长肌外其他组织（P0.01），心脏组织在出生后0d、90d和120d的IGFBP-6基因表达量是极显著高于除背最长肌外其他组织（P0.01），在出生后120d，肺脏中IGFBP-6基因表达量显著高于除背最长肌外其他组织（P0.05）。图4IGFBP-6基因的组织表达差异Fig.4ThedifferenceofrelativeexpressionofIGFBP-6geneinsixtissues-表4IGFBP-6基因的表达差异Table.4Thedifferenceo
28、frelativeexpressionofIGFBP-6geneinsixtissues注：A：肝脏；B：肺脏；C：心脏；D：背最长肌；E：半膜肌；F：臂三头肌；。Note：A：liver；B：lung；C：heart；D：longissimusdorsi；E：semimembranosus；F：musculustriceps；A肝脏日龄Day表达量均值ExpressionofMean公母均值MaleandFemaleofMean标准误StandardErrorofMean0d3.433.4310080.10162344.0581980.674147830d1.481.3242020.0952
29、9611.6263300.165688960d4.014.1908831.10586393.8885300.820496590d4.815.9386751.00629513.6867910.6490971204.842.8744920.13085056.1536290.5129864B肺脏日龄Day表达量均值ExpressionofMean公母均值MaleandFemaleofMean标准误StandardErrorofMean0d8.166.64342981.05110329.67825051.711988530d89.00105.583825.03818777.93868617.10513
30、60d3.982.78619500.34486055.17920471.348403690d2.495.43917740.32374971.50831950.11852091205.756.60060720.47977744.89440260.2706046C心脏日龄Day表达量均值ExpressionofMean公母均值MaleandFemaleofMean标准误StandardErrorofMean0d3.583.4310080.10162344.0581980.674147830d3.581.3242020.09529611.6263300.165688960d3.724.1908831
31、.10586393.8885300.820496590d7.435.9386751.00629513.6867910.6490971206.132.8744920.13085056.1536290.5129864D背最长肌日龄Day表达量均值ExpressionofMean公母均值MaleandFemaleofMean标准误StandardErrorofMean0d31.4747.70693275.36692985315.22309451.43116215430d24.9122.06367973.710696827.76467245.83106441360d15.7916.08292312.2
32、0809181615.48960120.98046931590d11.0012.95659591.3079787159.045262763.1845490091209.6510.23826552.4534266729.065894341.036239625E半膜肌日龄Day表达量均值ExpressionofMean公母均值MaleandFemaleofMean标准误StandardErrorofMean0d2.351.6045182710.2258904793.092855830.35687231930d3.032.5819982870.1889939163.4770172670.586245
33、9860d3.713.1891908970.1516546744.2294849310.77977449490d2.703.7237648390.6097441061.1535009110.0616048431203.173.6275717180.5082861592.7090375370.50821737F臂三头肌日龄Day表达量均值ExpressionofMean公母均值MaleandFemaleofMean标准误StandardErrorofMean0d6.256.2499039240.3828096.2499039240.38280930d6.013.982955150.2896378
34、.0450394291.98660560d22.5514.790266511.50416810.799075331.95529890d5.7714.790266512.06618410.799075330.3016741202.862.8761674810.2878732.8360148810.508958ABCDEF图5IGFBP-6基因的表达差异Fig.5ThedifferenceofrelativeexpressionofIGFBP-6geneinsixtissues注：A：肝脏；B：肺脏；D：心脏；E：背最长肌；F：半膜肌；G：臂三头肌Note：A：liver；B：lung；C：hea
35、rt；E：longissimusdorsi；F：semimembranosus；G：musculustriceps；表5IGFBP-6基因的发育性变化Table.5ThedifferenceofrelativeexpressionofIGFBP-6geneineighttissuesatdifferentgrowthpoints日龄Day肝脏Liver肺脏Lung心脏Heart背最长肌Longissimusdorsi半膜肌Semimembranosus臂三头肌Musculustriceps0d7.1792368648.1608401640.81376757556.669900218.83946
36、67522.3282413630d3.08693070388.9967374840.70958867440.774381724.9005176221.4854475660d8.3896456463.98269988442.34154223279.285974329.7536226945.7099027390d10.070436452.49103399184.63408923194.625252921.6226266320.6043877312010.131622125.74750490747.61141358170.761800125.4138454410.203595773.5.3IGFBP
37、-2基因表达的发育性变化如图4和表5可知，肝脏中IGFBP-6基因的表达量为生后120d生后90d生后60d生后0d生后30d。肺脏中IGFBP-6基因的表达量为生后30d生后0d生后120d生后60d生后90d，其中在生后30d基因表达量达到峰值，极显著高于生后0d、60d、90d、120d（P0.01）。心脏中IGFBP-6基因的表达量为生后90d生后120d生后60d生后0d生后30d，其中在生后90d、120d基因表达量极显著高于生后0d、30d、60d（P0.01）。背最长肌中，IGFBP-6基因的表达量为生后0d生后30d生后60d生后90d生后120d，呈随时间增大而下降的趋势。
38、半膜肌中，IGFBP-6基因的表达量为生后60d生后120d生后30d生后90d生后0d。臂三头肌中，IGFBP-6基因的表达量为生后60d生后0d生后30d生后90d生后120d，其中在生后60d基因表达量达到峰值，极显著高于生后0d、30d、90d、120d（P0.01）。4讨论胰岛素样生长因子对细胞生长分化具有重要的调控作用，其水平与动物生产性能密切相关。胰岛素样生长因子结合蛋白是IGFs在体内的特异性结合蛋白，主要通过转运循环中的IGFs，调整IGFs清除率、延长其半衰期、调节IGFs在组织细胞中定位以及调节IGFs与其受体相互作用几个方面来调节IGFs的生物学作用12。因此，可以通过
39、IGFBPs来调控IGFs活性，进而实现对畜禽生长发育的调控。分离和克隆基因是研究基因结构、功能及表达的基础，由于GenBank中还没有山羊IGFBP-6基因序列的报道，判断克隆所得到的cDNA是否为新的基因以及它与其他已发现的基因序列有何异同，可通过相应的软件(如Blast、PIMA、Fasta、MAP等)对网上多个DNA序列数据库(GenBank、DDBJ和EMBL等)中己登陆的序列进行搜索、比较，了解序列间的相似程度63。因此在本次试验中，PCR引物的设计主要参照绵羊和牛物种的IGFBP-6基因序列，用此引物扩增所得的IGFBP-6序列与在网站上公布的其他物种IGFBP-6序列相似性都非
40、常高,其中与绵羊IGFBP-6基因相似性高达99%，与牛IGFBP-6基因相似性高达97%，由此说明，IGFBP-6基因翻译的蛋白在哺乳动物中具有一些共同的结构和特征，同源性较高，保守性很强，得出的结论与前人研究相同，并说明利用近缘物种的DNA序列设计，对不同物种的同源DNA序列进行扩增是可行的。在此基础上成功的克隆出南江黄羊IGFBP基因家族中IGFBP-6基因的全编码区序列。CDS全长为711bp，编码氨基酸数目为235，氨基酸的分子量为24.70187KDa，理论等电点pI=8.405。本次试验在南江黄羊从初生到生后120d，在肝脏、肺脏、心脏和背最长肌、半膜肌、臂三头肌组织中均检测到I
41、GFBP-6基因的表达，并且在背最长肌中的表达量最高，在肝脏组织中表达量最少。在各个时间点IGFBP-6基因在背最长肌中的表达量极显著地高于其他组织中的表达量。本试验对南江黄羊IGFBP-6基因表达量的发育性变化研究结果显示：各组织在各个不同时间点基因的表达量有显著的差异，其中在肺脏中IGFBP-6基因表达量在生后30d达到最高，基因表达量极显著的高于其余时间点的表达量（p0.01)。在背最长肌中，IGFBP-6基因的表达量极显著高于其它组织，在生后0d表达量最高，之后呈现下降趋势。参考文献1VivianHwa,YoungmanOh,RonGRosenfeld.TheInsulin-LikeG
42、rowthFactor-BindingProtein(IGFBP6)SuperfamilyJ.EndocrineReviews,1999,20(6):761-7872SalmonW,DaughadayW.AhormonallycontrolledserumfactorwhichstimulatessulfationincorporationbycartilageinvitroJ.LabClinMed,1957,49:825-8363FroeschER,MullerWA,BurgiHetal.Nonsuppressibleinsulin-likeactivityofhumanserum.II.B
43、iologicalpropertiesofplasmaextractswithnonsuppressibleinsulin-likeactivityJ.BiochimBiophysAeta,1966.121:360-3744DulakNC,TeminHM.ApartiallypurifiedpolypeptidefractionfromratlivercellconditionedmediumwithmultiplicationsimulatingactivityfroembryofibroblastsJ.CellPhysiol,1973,8l:153-1605DaughadayWH,Hall
44、K,RabenMSetal.Somatomedin:proposeddesignationforsulphationfactorJ.Nature,1972,235:1076DaughadayW,RotweinP.Insulin-likegrowthfactorsIandIIpeptidemessengerribonucleicacidandgenestructures,serumandtissueconcentrationsJ.EndocrRev,1989,10:68-917RosenfeldR,WilsonD,LeePetal.Insulin-likegrowthfactorsIandIIi
45、ntheevaluationofgrowthretardationJ.Pediatr,1986,109:4288RotweinP.Structure,evolution,expressionandregulationofinsulin-likegrowthfactorsIandIIJ.GrowthFactors,1991,5:3-18.9KornfeldS.Structureandfunctionofthemannose6-phosphate/insulin-likeGrowthfactorIIreceptorsJ.AnnuRevBiochem.1992,61:307-33010JonesJI,ClemmortsDR.Insulin-likegrowthfactorsandtheirbindingproteins:BiologicalActionsJ.EndocrRev,1995,16:32