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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究-基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究作者：杨丽萍；刘志锋；黎永明；李志杰；姜勇(南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室，广东广州510515)摘要：目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体，并诱导原核表达纯化融合蛋白；将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞
2、，在高渗刺激下，通过检测p38底物ATF2的磷酸化水平，以观察由TAT转导进入细胞His-TAT-p38及其无活性突变体对内源性p38活性的影响。结果酶切和测序结果表明，载体构建正确；SDS-PaGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白；Westernblot表明，融合蛋白His-TAT-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞；导入His-TAT-p38蛋白后，结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能，而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能，从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化，使得信号不能传递下去，进而抑制p38MAPK通路
3、的活动。结论成功建立了基于TAT的蛋白转运系统，并证实TAT能够以浓度和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞；进入细胞的His-TAT-p38和His-TAT-p38无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性，在高渗刺激作用下前者可以增加p38磷酸化水平，而后者则显著抑制p38信号通路的活性。关键词：I型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白；p38丝裂原活化蛋白激酶；蛋白转导中图分类号：Q291文献标识码：A文章编号：1673-4254(2006)05-0553-05Cell-penetratingpeptide-basedfunctionalstudyofp38MAPKYANGLi-ping；LIUZhi
4、-feng；LIYong-ming；LIZhi-jie；JIANGYongDePartmentofPathophysiologyandGuangdongProvincialKeyLaboratoryofFunctionalProteomics,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,ChinaAbstract:ObjectiveToconstructap38MAPKproteindeliverysystembasedonTATproteinandstudyitsfunctionsineukaryoticcells.MethodsRecombinant
5、vectorspHis-TAT-p38andpHis-TAT-p38(AF)wereconstructed,andtworecombinantproteins,His-TAT-p38andHis-TAT-p38(AF),wereexpressedandpurifiedinE.coli.ThetwofusionproteinswerethenincubatedwithECV304cells,respectively.ThephosphorylationofATF2wasdetectedtoassaytheeffectofHis-TAT-p38onendogeneiousp38activityaf
6、terthecellswerestimulatedbysorbitol.ResultsTheresultsofrestrictionenzymedigestionandDNAsequencingshowedthatthetworecombinantvectorswerecorrectlyconstructed.TherecombinantproteinsofHis-TAT-p38andHis-TAT-p38(AF)wereisolatedandpurifiedbySDS-PaGE,andWesternblottingsuggestedthatHis-TAT-p38anditsmutantwit
7、hdualphosphorylationsitescouldenterthecellsefficientlyinatime-andconcentration-dependentmanner.His-TAT-p38wasfoundcaPableofincreasingtheactivityofendogenousp38inECV304cells,butHis-TAT-p38(AF)inhibitedthephosphorylationofATF2soastoblockthetransductionofp38signalPathwaywhenthecellswerestimulatedwithso
8、rbitol.Conclusionp38MAPKproteindeliverysystembasedonTATproteinhasbeenconstructedsuccessfully.ItisconfirmedthatTATcantransfertheproteinsintothecellsinatime-anddose-dependedmanner.TAT-p38anditsdominantnegativeformpossesshighbiologicalactivityaftertransductionintoECV304cellsbyTATproteindeliverysystem,a
9、ndtheformercanincreasetheactivityofendogenousATF2,butthelatterinhibitsthetransductionofendogeneiousp38signalPathwayinECV304cellswithhighosmoticstress.Keywords：humanimmunodeficiencyvirustype-1；p38mitogen-activatedproteinkinase；proteintransduction收稿日期：2005-10-31基金项目：广东省科技计划项目(A1090202)；广州市科技计划项目(2001-
10、z-035-01-1)；广东省自然科学基金重点项目(13058)SupportedbySci-TechResearchDevelopmentProgramofGuangdongProvince(A1090202),NaturalScienceFoundationofGuangdongProvince(13058),andScienceandTechnologyDevelopmentProgramofGuangzhouMuniciPality(2001-Z-035-01-1)作者简介：杨丽萍(1972-)，女，硕士研究生，从事炎症的信号转导通路的研究通讯作者：姜勇，教授，电话：020-85148
11、231,E-mail：yjiang应激激活的丝/苏氨酸蛋白激酶p38属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)超家族。各种细胞外刺激，包括紫外线、放射、热休克、高渗压、致炎细胞因子和某些病原体，能触发应激调节的蛋白激酶级联，最终通过磷酸化激酶活化环(Loop12)上的TGY基团而激活p38MAPK。p38在凋亡、细胞因子产生、转录调节和细胞骨架重构中起重要作用，还与败血症、缺血性心脏病、关节炎、人免疫缺陷病毒感染及阿尔茨海默氏病有密切联系1，2。人类免疫缺陷病毒(HIV)1型的反式激活因子(TAT)，是一种正调控蛋白质，可以极大的提高HIV
12、基因组的转录和复制水平，还能够调节细胞基因及细胞的行为3。近年来，TAT融合蛋白转导技术系统是研究蛋白质功能的的一种重要的技术手段，利用该方法来提高目的蛋白穿透生物膜的方法简单可行，不影响生物大分子的活性，可高效地介导目的蛋白穿透生物膜进入细胞。本研究应用TAT蛋白技术，建立了一个高效转导p38MAPK及其活性突变体地高效工作系统，并探讨使用外源性TAT蛋白调节p38通路活动的可行性。1材料1.1主要仪器及试剂ABI310型DNA测序仪(美国PE公司)、微量DNA/RNA定量仪(瑞典Pharamacia公司)、低温离心机(美国Beckman公司)。DNA纯化回收试剂盒(Vitagene公司)、
13、凝胶回收试剂盒(Vitagene公司)、LB培养基(Gibco)、异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG，华运公司进口分装)、Ni2-NTA亲和树脂(Qiagen公司)、羧苄青霉素(Novagen)、1kbDNA标准物(NEB公司)、限制性核酸内切酶和T4连接酶(ToYoBo公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、DMEM(GibcoBRL公司)。兔源抗p38抗体、兔源抗ATF2抗体、抗磷酸化ATF2抗体和兔源抗actin抗体购自CellSignaling公司；HRP标记的抗兔IgG购自SantaCruz公司；其它试剂均为国产分析纯或试剂盒附带。1.2质粒、菌种和细胞表达载体pET-14b-His
14、-TAT由本室郭爱华博士构建4，野生型及双磷酸化位点突变的flag标记的质粒pcDNA3-Flag-p38、pcDNA3-Flag-p38以及pET14b-His-p38原核表达质粒由本室构建，DH5和BL21(DE3)大肠杆菌和ECV304细胞由本实验室保存。2方法2.1pET14b-His-TAT-p38和pET14b-His-TAT-p38(AF)重组质粒的构建用Nde和BamH限制性核酸内切酶消化pcDNA3-Flag-p38、pcDNA3-Flag-p38(AF)质粒6h，琼脂糖凝胶电泳将目的片段p38和p38(AF)切胶回收，用上述同样的内切酶消化pET14b-His-TAT载体使
15、之线性化，二者通过T4连接酶16条件下连接16h。连接产物10l转化感受态菌DH5，铺琼脂糖LB平板，37孵箱倒置培养1216h。待平板长出菌落后，挑取单菌落于5mlLB培养基中(加相应抗生素)，置37摇床培养12h，小量制备质粒，利用酶切和测序鉴定重组质粒。2.2His-TAT-p38和His-TAT-p38(AF)融合蛋白的原核表达与纯化将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化后单菌落置于2ml的LB/Amp+培养液中，室温振摇培养至D600值约为0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，继续振摇3h。诱导结束后取诱导前和诱导后菌液0.5ml经10%SDS-Pa
16、GE鉴定融合蛋白表达的情况。对有融合蛋白表达的菌落进行大量(500ml)扩增诱导，用Ni2离子亲和树脂层析纯化得到蛋白，最后用10%SDS-PaGE电泳鉴定蛋白的纯度。His-p38蛋白和His-TAT-EGFP蛋白的表达与纯化方法同上。用CB-ProteinAssayTM试剂盒测定蛋白含量。2.3TAT介导的融合蛋白跨膜转导进入真核细胞效率的检测将纯化得到的蛋白放入预先配好的1PBS透析液中，4透析过夜，透析完毕后蛋白经过滤器过滤除菌备用。将ECV304细胞传代至6孔板内，然后将过滤后的融合蛋白分别按照以下方法加入细胞。浓度依赖性实验：将His-TAT-p38蛋白分别按15g/ml，30g/
17、ml，45g/ml的浓度加入细胞孵育2h。时间依赖性实验：将His-TAT-p38蛋白以每孔终浓度为1000nmol/L加入6孔板内与细胞分别孵育180min，120min，60min，30min。TAT介导的融合蛋白进入细胞实验：以每孔终浓度为500nmol/L分别将His-p38，His-TAT-p38，His-TAT-p38(AF)突变体蛋白加入细胞孵育2h。孵育结束后，彻底吸去原培养基，用冰预冷PBS将6孔板内细胞小心冲洗3遍。加入100l/孔冰预冷的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液，冰上裂解细胞30min。用细胞刮小心刮下裂解细胞，用移液器将细胞裂解物迅速移入冰预冷的1.5ml微
18、量离心管中。12000r/min、4离心10min后，取上清分别以兔源抗p38抗体(11000稀释)和兔源抗actin抗体(11000稀释)为一抗，HRP标记的抗兔IgG(11000稀释)为二抗行Westernblot检测。2.4His-TAT-p38及其突变体对p38活性的影响将ECV304细胞传代至6孔板内，待细胞进入对数生长期后，实验分四组：对照组不加任何蛋白；第二组加入His-TAT-p38(AF)突变体蛋白；第三组加入His-TAT-EGFP蛋白；第四组加入His-TAT-p38蛋白，每组又分为刺激组和无刺激组。按照分组分别加入终浓度为750nmol/L的融合蛋白与细胞孵育12h，孵
19、育结束后撤掉原培养基，用无血清培养基培养稀释Sorbitol至终浓度0.4mol/L，分别加入各组中刺激0.5h，裂解细胞取上清分别以兔源抗ATF2抗体、抗磷酸化ATF2抗体(均为11000稀释)为一抗，HRP标记的抗兔IgG(11000稀释)为二抗行Westernblotingt检测。3结果3.1pET14b-His-TAT-p38和pET14b-His-TAT-p38(AF)重组质粒的构建将重组质粒用Nde和BamH双酶切后进行1%琼脂糖电泳，可以看到两条带，大小分别约为4740bp与1080bp，与预期大小一致。测序证实构建正确(图1)。图1重组质粒pET14b-His-TAT-p38和
20、pET14b-His-TAT-p38(AF)酶切鉴定图Fig.1IdentificationofpET14b-His-TAT-p38andpET14b-His-TAT-p38(AF)vectorsM:1kbDNAmarker;Lane1:pET14b-His-TAT-p38digestedwithNdeandBamH;Lane2:pET14b-His-TAT-p38(AF)digestwithNdeandBamH3.2融合蛋白的原核表达与纯化pET-His-p38、pET-His-TAT-p38和pET-His-TAT-p38(AF)质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单个菌落培养经IPT
21、G诱导后，经Ni2+-NTA磁珠亲和层析纯化，10%SDS-PaGE凝胶电泳可见在41kD左右见到一特异性蛋白条带。His-p38蛋白约40kD(图2)。图2His-TAT-p38、His-TAT-p38(AF)蛋白以及His-p38蛋白表达纯化Fig.2ExpressionandpurificationofHis-TAT-p38,His-TAT-p38(AF)andHis-p38M:proteinmarker;Lane1:FirstelutionofHis-TAT-p38;Lane2:SecondelutionofHis-TAT-p38;Lane3:FirsteluteofHis-TAT-p
22、38(AF);Lane4:SecondelutionofHis-TAT-p38(AF);Lane5:FirstelutionofHis-p38;Lane6:SecondelutionofHis-p383.3His-TAT-p38、His-TAT-p38(AF)蛋白转导进入细胞的检测首先将ECV304细胞传代至6孔板内，待细胞进入对数生长期后，将过滤好的His-TAT-p38蛋白，His-TAT-p38(AF)蛋白和His-p38蛋白分别加入培养的细胞孵育2h，用兔源抗p38抗体(11000稀释)和兔源抗actin抗体(11000稀释)为一抗行Westernblot检测，结果见图3。对检测得到的
23、蛋白条带进行灰度扫描并根据净灰度值比值计算得到两种蛋白的导入效率分别为65%和69%，这一结果证实了TAT介导的融合蛋白p38及其突变体能够高效地进入ECV304细胞。按照一定的浓度梯度将His-TAT-p38蛋白加入细胞培养上清，37孵育2h，同样用兔源抗p38抗体(11000稀释)和兔源抗actin抗体(11000稀释)为一抗行Westernblot检测，结果见图4；然后，按照一定的时间间隔将His-TAT-p38蛋白加入6孔板内与细胞孵育，同样用抗p38抗体为一抗行Westernblot检测，结果见图5；融合蛋白His-TAT-p38(AF)的结果同此一致，由此可见，融合蛋白His-TA
24、T-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞。图3TAT介导的p38及其AF突变体蛋白进入真核细胞Fig.3TAT-mediatedentryofp38anditsmutantfusionproteinintothecellsA:Westernblottingdetectionofp38anditsmutantenteringECV304cellsmediatedbyTAT.Lane1:His-TAT-p38protein;Lane2:CelllysatewithHis-TAT-p38protein;Lane3:His-TAT-p38(AF)protein;Lane4:C
25、elllysatewithHis-TAT-p38(AF)protein;Lane5:His-p38protein;Lane6:CelllysatewithHis-p38protein.B:BarchartofquantificationofTAT-mediatedproteinenteringthecells.Theresultsarerepresentativeof3independentexperiments.Internalizationraterepresentsthepercentageratiooftheopticaldensityoftheinternalizedproteint
26、othatoftotalinputprotein.图4TAT介导的p38蛋白以浓度依赖性方式进入细胞Fig.4Concentration-dependententryofHis-TAT-p38intoECV304cellsA:WesternblottingofHis-TAT-p38proteinenteringECV304cells;B:BarchartofquantificationofHis-TAT-p38fusionproteinenteringECV304cells图5TAT介导的p38蛋白以时间依赖性方式进入细胞Fig.5Time-dependententryofHis-TAT-p3
27、8intoECV304cellsA:WesternblottingassayofHis-TAT-p38proteinenteringECV304cells;B:BarchartofquantificationofHis-TAT-p38fusionproteinenteringECV304cells3.4TAT介导p38及其突变体进入细胞对p38活性的影响首先将ECV304细胞传代至6孔板内，待细胞进入对数生长期后根据实验分组将过滤好的可溶性蛋白His-TAT-p38和His-TAT-p38(AF)突变体以及TAT-EGFP按照每孔终浓度为750nmol/L加入各孔，孵育12h后，撤掉原培养基，
28、加入无血清培养基，按照0.4mol/L终浓度加入Sorbitol刺激0.5h后，裂解细胞离心取上清行Westernblot，检测p38底物ATF2磷酸化水平，观察加入的外源性His-TAT-p38(AF)蛋白对p38MAPK通路功能的影响。结果可见，导入His-TAT-p38蛋白后，未加刺激的ECV304细胞的p38MAPK活性有所增加，给予刺激后，其活性显著增高，而导入His-TAT-p38(AF)突变体蛋白后，在给予刺激的情况下，p38MAPK活性被显著抑制(图6)。图6His-TAT-p38及其无活性突变体对高渗刺激诱导的ATF2磷酸化的影响Fig.6EffectofHis-TAT-p3
29、8anditsdominantnegativeformonthephosphorylationofATF2inducedbysorbitolinECV304cells4讨论完整的TAT蛋白由86个氨基酸组成，Schwarze和Watson等确定TAT蛋白内介导蛋白传递的核心序列由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR5，6。虽然TAT介导的蛋白转导在1998年首先被报道，但其转导机制并不清楚，在活细胞上应用可转导的TAT-Cre重组报告基因检测后，人们发现TAT融合蛋白中一个富含碱性氨基酸、具有较多正电荷的多肽片段与跨膜转导有关，因而被称为蛋白转导结构域(PTD)，目前对PTD进入细
30、胞的机制尚不完全清楚，有人认为它可与细胞表面离子作用后，由液态脂质依赖的胞饮作用(一种特殊形式的内吞作用)进入细胞。将这一核心序列与多肽、蛋白质及DNA共价连接后，它们将不依赖于受体和转运物质进入几乎所有的组织和细胞，甚至可以通过血脑屏障，转导效率很高而且对细胞没有损伤。p38MAPK信号通路参与了细胞的生长发育及细胞间功能同步等多种生理过程，并与炎症、应激反应的调控密切相关，被认为是细胞信息传递的交汇点和共同通路78910。在这条通路中，当各种信号由细胞外跨膜转导进入细胞后，激活胞内的蛋白激酶级联，导致p38磷酸化激活，活化的p38转位入核，进一步磷酸化核内的转录因子，从而调节相关基因的表达
31、，进而影响细胞的许多生理过程。p38通路对多种细胞生理病理过程都是非常重要的，其磷酸化就像是一个阀门，当它开启的时候，细胞内可发生正常或异常的生理反应。适度的p38磷酸化参与多种细胞的生理状态下的功能活动调节，而p38的异常磷酸化可以引发多种疾病，我们利用TAT介导的蛋白转导技术将p38及其突变体导入真核细胞，对于研究p38通路的功能有着重要的意义。为了研究TAT能否有效地携带p38及其突变体进入ECV304细胞，我们将蛋白His-TAT-p38及其突变体，以及His-p38分别加入已经铺好的6孔板内与细胞孵育，结果显示目标蛋白His-TAT-p38及其突变体能够被高效地转导进入细胞，而His
32、-p38蛋白则几乎不能进入细胞，同时我们对检测得到的蛋白条带进行灰度扫描，并根据净灰度值比值计算得到两种蛋白的导入效率分别为65%和69%，这一结果证实了TAT介导的融合蛋白p38及其突变体能够高效地进入ECV304细胞。进一步的实验结果证实，加入的His-TAT-p38蛋白随着浓度从15g/ml增加到45g/ml，进入ECV304细胞的蛋白量也随着增加；同样，随着时间的延长，进入细胞的蛋白量也相应增加，而加入蛋白120min后，进入细胞的蛋白量不再显著增加，说明此时进入细胞的蛋白量已经达到饱和。这些结果证实了TAT介导的p38蛋白以时间依赖性和浓度依赖性方式进入ECV304细胞。我们利用p3
33、8无活性突变体不能被外来刺激激活而磷酸化的原理，通过TAT蛋白转导系统将p38及其无活性突变体导入细胞，观察其对细胞内源性ATF2磷酸化水平的影响，结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能，而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能，从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化，使得信号不能传递下去，进而抑制p38MAPK通路的活动，这一结果对于探索新的控制炎症的途径有着非常重要的理论与实践意义。至此我们的p38MAPK蛋白转运系统构建成功，为我们进一步研究建立了一个很好的技术平台，并为以后的基础研究和临床研究提供了思路和理论基础。参考文献：1JiangY,LiZ,S
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