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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。基因工程笔记总结-第二章Enzymes第四节DNA连接酶Ligase一、DNA连接酶的发现二.连接条件必须是两条双链DNA。DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。需要能量。三、连接反应的机理1、ATP（NAD+)提供激活的AMP。2、ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3、AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。4、AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。5、3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放
2、出AMP。Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口”四.两种DNA连接酶1.E.ColiDNAligase来源：E.coli适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端）2.T4ligase来源：T4phage适用：粘性末端及平末端T4vs.E.coliT4DNAligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！五.Ligase的反应温度最佳温度：界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15比较合适。六.DNA分子连接的四种形式1.粘性末端；2.平末端；3.平末端加尾；4.平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor)(1)Digesti
3、onandLigation1粘性末端连接Problem:(自我环化作用)解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸2.平末端连接粘性末端连接效率高于平末端约100倍！解决方法：化平末端为粘性末端J3.平末端连接-同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶功能：5至3单链聚合作用特点：单链；无模版作用机理：a:用5-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸,获得3-OH的单链延伸末端。b:加入dATP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。c:获得poly(dA)和poly(
4、dT)尾巴，就会彼此连接起来。缺点：当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。4.平末端连接-衔接物连接法与接头连接法(1)平末端的衔接物连接法衔接物的5末端和待克隆的DNA片段的5-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。(2)平末端的接头连接法将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。七.热稳定的DNA连接酶来自嗜热高温放线菌热稳
5、定的DNA连接酶的应用：寡核苷酸连接测定法（oligonucleotideligationassay,OLA）连接酶链式反应（ligationchainreaction,LCR）寡核苷酸连接测定法的作用检测突变寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。1.寡核苷酸连接测定法（1）原理:两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。第五节DNA聚合酶DNAPolymerase常用的DNA
6、聚合酶：1、大肠杆菌DNA聚合酶2、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段酶3、T4DNA聚合酶4、T7DNA聚合酶5、反转录酶等。一、大肠杆菌DNA聚合酶DNA聚合酶特点活性：53聚合低53外切有35外切低DNA聚合酶的应用放射性探针的标记(1)DNA聚合酶的两种特殊反应：切口转移与链取代(2)切口转移法制备放射性DNA分子杂交探针二、Klenow片段1、DNA聚合酶的Klenow片段活性：53聚合低53外切无！35外切低2.Klenow片段的应用末端补平末端标记及随机引物标记cDNA第二链合成（见cDNA文库构建）DNA测序三.T4DNA聚合酶1.T4DNA聚合酶特点活性：53聚合低53
7、外切无35外切高！2.T4DNA聚合酶活性的条件模版、引物、原料dNTP3.T4DNA聚合酶的“取代合成”法末端标记四.T7DNA聚合酶1.T7DNA聚合酶特点活性：53聚合高！53外切无35外切高2.T7DNA聚合酶的应用合成：高活性，几kb，不受DNA二级结构的影响标记：类似T4（取代合成）末端补平：类似T4第六节核酸修饰酶一.修饰的T7DNA聚合酶活性：53聚合更高(*3)！53外切无35外切无！修饰的T7DNA聚合酶的应用：合成能力：更高、更快、更强！标记：重在“掺”与末端补平：二.激酶(kinase)&磷酸酶(phosphotase)T4多核苷酸激酶(1)特点来源：T4噬菌体pseT
8、基因编码；活性：5-OH加磷酸；(2)T4kinase5末端标记的机理用酸性磷酸酶处理使其脱磷酸，使5OH基国暴露，同多核苷酸激酶从r-PATP分子中转移来的r-P基团键合，实现末端标记。(3)T4多核苷酸激酶的应用a:5末端标记b:5末端磷酸化磷酸酶(1)特点来源：细菌碱性磷酸酶（BacterialAlkalinePhosphotase，BAP)，E.coli；小牛肠碱性磷酸酶（CalfintestinalAlkalinePhosphotase,CIAP)，小牛肠。活性：5-P去磷酸(2)磷酸酶作用机理催化核酸分子脱掉5P，使DNA分子5P转化成5OH脱磷酸作用。这样产生的5OH末端，为随后
9、在r-PATP和T4多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。(3)磷酸酶的应用末端标记前处理防止DNA分子自身环化(4)BAP与CIAP比较热稳定性（65）BAP：activeCIAP：30min失活第七节核酸外切酶1.核酸外（Exonucleases）切酶定义:一类从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核苷酸的酶。分类：单链的核酸外切酶双链的核酸外切酶第八节核酸内切酶1.S1核酸酶(1)特点：活性：降解单链核酸（DNA或RNA）为单核苷酸；降解双链核酸的单链区(2)S1核酸酶的应用-RNA分子的定位2.Bal31核酸酶Bal31核酸酶的三种活性：（1）单链核酸内切（2）双链核酸外切（3）双链
10、切口对应链Bal31核酸酶主要用途：（1）诱发DNA发生缺失突变（2）定位测定DNA片断中限制性位点的分布（3）研究超盘旋DNA分子的二级结构3.其他核酸酶外切核酸酶（Exonuclease）：3至5外切RNA酶(RNase)：切割DNA-RNA杂合链中的RNA其他核酸酶:外切核酸酶（Exonuclease）：3至5外切DNA酶（DNase）：随机切割ss&dsDNARNA酶(RNase)：切割DNA-RNA杂合链中的RNA第三章Techniques基因工程技术Outline1、电泳2、分子杂交3、转化与转染4、核酸测序5、DNA扩增-PCR6、核酸-蛋白相互作用第一节电泳原理：通过电场的作用
11、使带电的大分子在电泳介质中运动。目的：根据带电分子的分子量、电荷及构型分离不同的分子（依据不同的凝胶体系）。电泳的分类：琼脂糖凝胶电泳（agarosegelelectrophoresis），聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）琼脂糖凝胶电泳（agarosegelelectrophoresis）ds-DNA目的：分离不同长度的DNA片段a.确定DNA片段的长度b.确定DNA的有无与多少c.分析酶切产物凝胶电泳的原理:略电泳步骤第一步：制胶第二步：样品制备第三步：点样第四步：跑电泳第五步：紫外灯下检测，拍照第六步：数据处理缓冲体系：TAE
12、,pH8.0,50mM-Tris,Acetate,EDTATBE,pH8.0,50mM-Tris,Borate,EDTA影响迁移率的因素：凝胶的孔径电压DNA片段长度及结构EB的影响分辨率影响因素：琼脂糖浓度缓冲液或样品的盐离子浓度核酸上样量电压聚丙烯酰胺凝胶电泳（poly-acrylamidegelelectrophoresis，PAGE）范围：短片段分辨率：1bp类型：变性胶（长度）、非变性胶（长度、构型）变性胶：1、含尿素；2、DNA样品经甲酰胺与热处理；3、电泳保持温度。Agarose与PAGE的不同：分辨率操作应用：RFLP,AFLP,DD-PCR,sequencing,primer
13、extension,S1mapping,RNaseprotectionassay第二节分子杂交一.分子杂交概述(1)定义分子杂交（molecularhybridization）：不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非共价键的结合。根据这一原理发展起来的各种技术统称为分子杂交技术。(2)用途形成DNADNA(DNARNA)杂种分子，可以用来a.检测特定生物体之间的亲缘关系。b.揭示核酸片段中某一特定基因的位置。c.对目的基因进行相对定量。d.对特定蛋白质进行定性及定量分析(3)杂交的基本步骤以核酸分子杂交为例：凝胶电泳分离的DNA/RNA吸印,转膜(通过毛细管作用或电导作用
14、)探针标记杂交检测(4).种类Southern:DNA-DNANorthern:DNA-RNAWestern:Pr-Pr二.Southernblotting1.SouthernBlotting(1)目的：检测特定DNA序列。(2)原理：电泳分离DNA，并将之转至尼龙膜上，以标记好的探针（DNA）与之杂交。(3)步骤Protocolsa.基因组DNA制备b.DNA酶切消化c.琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断d.碱变性，中和e.转移DNA到固相支持物(如，尼龙膜)f.杂交反应g.放射自显影h.数据分析2.OtherDNAanalyses（1）斑点杂交(dotblotting)与狭线杂交(slotblo
15、tting)（2）菌落与噬菌斑杂交(1)Dotblotting,slotblottlng:将样品直接有规律地排列成点阵或线阵，然后进行杂交检测。多用于病原体基因检测，如微生物的基因。(2)菌落与噬菌斑杂交（过程略）三.Northernblotting1.NorthernBlotting(1)目的：检测特定序列的RNA的长度与丰度。(2)原理：电泳分离RNA，并将之转至尼龙膜上（blot)，以标记好的探针（DNA）与之杂交。实验过程基本上同SouthernSouthernblot和Northernblot区别：1）RNA分子较小，不需进行限制性内切酶切割；2）在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使
16、RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团；3）在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱；4）在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合；5）操作均应避免RNase的污染。(2)Ribonucleaseprotectionassay过程：RNA和探针在液体混合物中杂交.未杂交上的RNA和探针被核酸酶降解，这种核酸酶只识别单链RNA。杂交后的探针和RNA复合体通过琼脂糖凝胶电泳分离。转膜，放射自显影。RPA有NorthernBlot无法比拟的优势：过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全。RPA比NorthernBlot灵敏15150倍，适合检
17、测各种表达水平之基因。RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达。一次RPA就能完成10多次NorthernBlot的工作，加快研究速度。主要缺点：RNA探针的制备麻烦。核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消化过头，X片上什么都没有。(3)ReverseNorthernblotting四.Westernblotting1.WesternBlotting(1)目的：检测特异性蛋白质有无及表达量。(2)理论依据：抗原-抗体特异性相互作用。(3)原理：电泳分离蛋白质，并将之转至膜上（blot)，以标记好的抗体（antibody）与之杂交。“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗(4)
18、免疫应答:略WesternBlot显色的主要方法：a.底物化学发光ECLb.放射自显影c.底物荧光ECFd.底物DAB（二氨基联苯胺）呈色底物化学发光ECL二抗用HRP标记，反应底物为过氧化物+鲁米诺，底物遇到HRP发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。Westernanalysis2.分子杂交技术与细胞学的结合(1)原位杂交（insituhybridization）与荧光原位杂交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）原理：标记的探针与在细胞原位的DNA分子杂交，通过显色反应其相应DNA在细胞染色体中的具体位置。(2)免疫组织化学（immunohistochem
19、istry）第三节外源核酸导入细胞的方法一.概述二.大肠杆菌的转化三.植物的转化一.概述1.转化/转染（1）转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。(2)基因转移的目的扩增重组DNA功能表达(3)转化与转染转染（Transfection)：当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是病毒DNA时就应该称此过程为转染。对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词，而转化指正常细胞转变为癌下表过程。2.外源基因导入的方法(1)热休克法（heat-shock)影响热休克法转化效率的因素DN
20、A：构型、纯度、浓度受体菌：R/M体系缺陷型；生理状态及成活率环境：温度、pH、离子浓度(2)电穿孔法(Electroporation)转化的原理与技术：高压电脉冲作用使细胞膜上出现小孔。电穿孔法影响因素：电压脉冲持续时间细胞类型(3)微弹轰击法(gene-gun)用压缩气体（氦氮）动力，产生一种冷的气体冲击波进入轰击室，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA随金属颗粒穿过细胞壁，细胞膜，细胞质等，层层到达细胞核。(4)显微注射(Microinjection)用微吸管吸取供体溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中的直接转移方法。(5)脂质体（Lipofectin）由人工合成磷脂类双分子层的脂质体包埋
21、DNA，然后进行脂质体与细胞膜的融合（内吞），将外源DNA导入细胞。(6)反转录病毒具有感染性的病毒颗粒，可以介导目的基因转染到分裂细胞。二.大肠杆菌的转化1.成功转化的必要条件(1)感受态（competence）：a:细菌能够获取外源DNA的状态。b:特定蛋白与DNA结合形成可以抵御核酸酶的复合物。(2)复制子（replicon）外源DNA稳定存在。(3)外源DNA的功能表达。2.感受态大肠杆菌的制备3.大肠杆菌的转化-以pGLO质粒为例三.植物的转化1.应用2.转化的方法3.农杆菌介导的转化1.应用a.提高植物的农业价值和园艺价值b.生物反应器（蛋白/次生代谢产物）c.研究基因在发育、代谢
22、途径中的作用2.转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。3.农杆菌介导的转化(一)农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制酚类-（启动）-Ti质料上的Vir基因-（表达）-Vir基因产物-（切断）-质料上的T-DNA单链；切下来的单链T-DNA与操纵子基因产物形成复合物，转化植物根部细胞。T-DNA上有三套基因，其中
23、两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，是农杆菌生长必需的物质。（二）Ti质粒转化植物细胞的战略为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。共整合系统原理:部分T-DNA片段克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr(卡那霉素抗性)。在E.coli中,将外源基因和带有部分T-DNA片断的质粒重组，筛选重组子；将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，侵染植物细胞。植物细胞转化的双元系统主要包
24、括两个部分：卸甲Ti质粒，由于缺失了T-DNA区域，丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T-DNA的转移。微型Ti质粒(Mini-Tiplasmid)，它在TDNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及大肠杆菌选择标记LacZ基因等。双元载体系统的构建的原理：是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活TDNA的转移。穿梭质粒定义：一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可以在两种不同类群中存在复制。第四节基因扩增技术-PCRPCR的定义PCR技术的发明PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用1.PCR的定义PCR技术是体外酶促合成特异DNA片
25、段的一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。2.PCR的发明Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。3.PCR技术的原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成的DNA引物。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环。每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍。4.PCR技术的特点高度的灵敏性特异性操作简便易行用途广泛5.引物设计长度结构（避免内部形成二级结构&有互补序列）GC含量6.PCR反应的条件及过程(1)具备的条件总体积25-100mlBuffer缓冲液dNTP原料Prim
26、er引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶(2)反应过程变性：退火：延伸：(3)PCR产物检测7.影响PCR的因素（）TaqDNApolymerase（）模板的浓度（）dNTP（）Mg2+浓度（）变性的时间（）退火的温度与时间（）延伸的温度与时间8.PCR技术的分类传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列（）反向PCR把线性DNA模板转变成环形分子。选择一个在已知序列中没有，而其两侧都存在的限制性内切酶位点。用相应的限制性内切酶酶解后，将酶切的片段在连接酶的作用下环化，使得已知序列位于环状分子上。根据已知序列的两端序列设计两个引物，以环状分子为模板进行PCR，就可以扩增出已知序列两侧的未知序列
27、。（）反转录PCR（RT-PCR)以RNA为模板,经逆转录获得与RNA互补的DNA链(即cDNA)，然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。（）梯度PCR(gradientPCR)（）实时荧光定量PCRCt值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板每个模板的Ct值与其起始拷贝数的对数是线性关系;SYBR荧光染料内嵌染料(Sybr-Greenl)：Sybr-Greenl，能与双链DNA特异结合，而不与单链DNA结合。未与双链DNA结合时荧光信号强度较低，而当SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强。TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个
28、特异性的荧光探针；探针两端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团；第五节DNA测序与合成一.DNA测序目的：基因组序列测定检查基因多态性确定新克隆的DNAs序列证实需要确认的突变Sanger测序法Sanger1977年发明,1980年NobelPrize化学奖1.原理（1）在PCR反应中，以DNA一条链为模板，按碱基互补配对的原则，复制链在引物3端以5-3方向延伸。（2）底物是2-脱氧dNTP和一定量2,3双脱氧ddNTP(脱氧核糖的3位置缺少一个羟基)。（3）2，3双脱氧ddNTP会使复制反应终止。（4）链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，使产物是一系列的核苷酸链。（5）在4组独立酶反应
29、中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。2.过程a.引物进行放射性标记。b.四种合成反应分别在不同的管中进行，依次分别加入ddGTP，ddATP,ddCTP,ddTTP。c.在第一个管中，DNA分子的合成过程中会有G掺入，每一个模板C点对应的位点都有几率插入ddGTP，只要插入ddGTP，DNA分子延伸就会停止，而且这一反应是随机发生的。因此就会形成一系列末端是ddGTP的DNA分子。d.同样的过程也会发生在另外3个管里。e.反应后的样品进行电泳并放射自显影分析。3步骤a.测序胶的制备b.模板DNA的制备,纯化c.PCR扩增d.点样，
30、跑胶e.序列分析DNA自动化测序过程：1、准备模板，引物，Tap酶，dNTP和少量用不同标记物标记的四种ddNTP；2、用Sanger测序法进行PCR反应，体系中会产生各种长度不同的DNA片段（各片段间只相差一个碱基）；3、电泳分离；4、自动化读取胶上的条带信号。Maxam-Gilbert化学修饰法1.原理用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳大小分离和反射子显影后，便可以根据X光片底板上所显现的相应谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。二.DNA片段的化学合成常用方法-亚磷酰胺三酯法第六节DNA与蛋白
31、质相互作用概述凝胶阻滞实验DNaseI足迹实验DMS足迹实验染色质免疫共沉淀蛋白质与蛋白质相互作用一.概述1.DNA-蛋白质互作的意义:a.DNA的复制与重组b.基因转录调控与转录后修饰2.DNA-蛋白质互作的研究方法(1)凝胶阻滞实验(2)DNaseI足迹实验(3)DMS足迹实验(4)染色质免疫共沉淀二.凝胶阻滞实验1.原理蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。2.步骤a.标记放射性探针并提取细胞核蛋白；b.提取物与探针进行温育，形成蛋白质-DNA复合体；c.将混合物加样到聚丙烯酰胺凝胶上，通过电泳将游离的探针和已与蛋白
32、结合的探针分离；d.放射自显影成像分析对游离型和结合型探针进行检测；5应用：可用于检测DNA结合蛋白&RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。6.优,缺点优点：简单、快捷缺点：确定准确结合部位比较麻烦三.DNaseI足迹实验（可以准确确定结合部位）1.原理如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。2.过程用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；得到一条单链标记的DNA双链分子，加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；加入适量DNa
33、seI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；进行DNA凝胶分析。四.DMS足迹实验1.原理硫酸二甲酯（Dimethylsulfate，DMS）：甲基化鸟嘌呤六氢吡啶：切割甲基化的鸟嘌呤DNA特异序列结合蛋白：阻止甲基化，阻止切割适量DMS处理完整的游离细胞，使染色质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA链上的蛋白质结合区。五.染色质免疫共沉淀(ChIP)1.原理活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段;然后通过免疫学方法沉淀此
34、复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段;通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息;AfterChIPPCRSouthernSequencing第七节.蛋白质与蛋白质相互作用1.GST融合蛋白的Pulldown实验（1）原理细菌表达的谷胱甘肽s转移酶（GST）融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性蛋白结合。根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。2.免疫共沉淀（1）原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。3酵母双杂
35、交系统（1）原理将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体；将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体；当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。（2）筛选在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白A和蛋白B能相互作用的双载体转化子。（3）用途a.已知蛋白之间相互作用的检测。b.蛋白质的功能域研究：
36、通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，可检测其功能域或关键氨基酸。c.克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞。第四章基因的分离概述定位克隆技术基因文库的构建与筛选差异表达基因的分析方法cDNA芯片技术第一节概述一.基因克隆（genecloning）1.定义：目的基因的分离与鉴定2.过程：1)、选材与DNA分子的片段化2)、目的片段与载体的连接3)、外源重组分子的导入4)、重组分子的筛选二.目的基因的分离编码产物已知的基因编码产物未知的基因1.编码产物已知的基因的分离通过生物化学和病
37、理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物；对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列；通过寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库筛选分离目的基因。2.编码产物未知的基因的分离定位克隆技术(Positionalcloning)差异表达基因的分析方法（Analysisofdifferentiallyexpressedgenes）cDNA芯片技术(cDNAmicroarray)基因标鉴法(Transposontagging)定位克隆技术首先基因定位，然后以紧密连锁的分子标记为起点，通过筛选基因文库，染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆目标基因。差异表达基因的分析方法-差别显示技术(diff
38、erentialexpression)以mRNA为起始材料，利用RT-PCR技术，对差异显示的基因带纹进行回收后作探针，在cDNA或基因组DNA文库中筛选新的基因。cDNA芯片技术基因标鉴法第二节定位克隆技术Positionalcloning一.定位克隆步骤a将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上(一对紧密连锁的分子标记)b构建YAC/BAC基因组文库c利用紧密连锁的两个分子标记作探针,筛选基因组文库，构建包含目的基因的物理图谱d筛选含连锁标记的YAC克隆，通过染色体移位将克隆排序获得目标基因的DNA片段e通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。二.分子标记1.定义DNA分子标记（D
39、NAmolecularmarker）是指可遗传并可检测的DNA序列，以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础，是DNA水平遗传变异的直接反映。2.特征基因组DNA水平可遗传可与基因-表型连锁3.技术方法限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）随机扩增多态性（randomamplifiedpolymorphismDNA，RAPD）扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP）简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）DNA指纹技术（DNAfingerpr
40、inting）1).限制性片段长度多态性（RFLP）(1)技术原理：DNA序列的变化引起酶切位点的改变，从而使两个酶切位点间的DNA片段长度发生变化。基础：酶切(2)优，缺点优势：共显性，有利选择隐性基因；RFLP标记之间相互独立，互不干扰缺陷：信息含量较低，费用昂贵，操作复杂，不适用于分析样本量较大的群体(3)应用构建基因组连锁图谱亲缘关系鉴定品种鉴定2).随机扩增多态性(RAPD)技术原理：以短核苷酸为随机引物(10-12bp)，以DNA为模板合成多态性DNA片段。(3)优，缺点优势：技术简单，检测速度快；引物序列通用性强，无需根据物种特异性分别设计引物；成本较低，所需DNA量较少缺陷：显
41、性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；共迁移；重复性差3）.扩增片段长度多态性（AFLP）技术原理：先进行PCR扩增，再进行酶切，跑电泳。优势：RAPD相比：假阳性率降低，重复性好；RFLP相比：操作简单缺陷：基因组DNA质量要求高，成本高，多为显性标记。4）.简单重复序列与DNA指纹技术（SSR&DNAfingerprinting）特性：a高度的特异性：b稳定的遗传性：c体细胞稳定性：第三节基因文库的构建与筛选基因文库的基本概念基因文库的构建程序1、 基因组文库重组克隆的排序基因文库定义：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同基因文库分为：基因组文
42、库2、 cDNA文库基因文库的构建程序a.基因组DNA的制备b.基因组DNA的切割c.载体和受体的选择d.从基因文库中筛选目的基因3.cDNA文库(cDNAlibrary)（1）定义某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。（2）构建步骤a.总RNA（totalRNA）提取b.mRNA的分离纯化c.cDNA的合成d.cDNA与载体连接（人工接头法、同聚物加尾）第四节差异表达基因的分析方法一.特征mRNA水平二.技术方法1）cDNA代表差异分析(cDNArepresentationaldifferenceanalysis,cDNA-RDA)2
43、）cDNA扩增片段长度多态性（cDNAamplifiedfragmentlengthpolymorphism，cDNA-AFLP）3）消减杂交（subtractivehybridization）4）cDNA芯片分析1.cDNA代表差异分析（cDNA-RDA）通过限制性内切酶消化双链cDNA，再经过多轮消减杂交结合PCR，使差异表达的cDNA片段得以大量富集。2.cDNA扩增片段长度多态性（cDNA-AFLP）mRNA水平的AFLP3消减杂交（subtractivehybridization）第五节DNAchip1.定义采用原位合成(insitusynthesis)或显微打印手段，将数以万计的D
44、NA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断。2.DNAChips组成载体连接层DNA分子探针阵列3.ChipAssay的优点:高通量条件一致微型化自动化第五章基因工程载体一概述二大肠杆菌质粒载体三噬菌体克隆载体四YAC克隆载体一.概述1定义：载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞进行复制的DNA分子。2.载体特点至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。至少应有一个多克隆位点，以供外源DNA插入。至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。必需是安全的，不含对受体细胞有害的基因，不应任意转入其他生物的细胞（人的细胞）。3.载体的分类a.普通型载体b.表达型载体（expressionvector）c.失控型质粒载体(Run-awayplasmidvector)d.探针型载体（probingvector）二大肠杆菌质粒载体1.质粒的一般生物学特性（1）分子小：1-200kb（2）编码基因少：（3）环状2质粒的构型(1)共价闭合环状DNA(2)开环DNA（opencircular/ocDNA）(3)线形DNA（linear/lDNA）3.质粒载体必备的基